PLoS ONE: Synaptonemal Complex Protein 3 Er prognostisk markør i Livmoderhalskræft Cancer

Abstrakt

Synaptonemal komplekse protein 3 (SCP3), et medlem af COR1 familien, er opreguleret i forskellige kræftceller; Men dens onkogene potentiale og klinisk betydning er endnu ikke blevet karakteriseret. I den foreliggende undersøgelse, undersøgte vi den onkogene rolle SCP3 og dets forhold til phosphoryleret AKT (Pakt) i livmoderhalsen neoplasier. Den funktionelle rolle SCP3 udtryk blev undersøgt ved overekspression eller knockdown af SCP3 i murine cellelinie NIH3T3 og menneskelige livmoderhalskræft cellelinjer CUMC6, SiHa, CaSki, og HeLa både

in vitro

in vivo

. Derudover undersøgte vi SCP3 udtryk i tumor prøver fra 181 livmoderhalskræft og 400 cervikal intraepithelial neoplasi (CIN) patienter med immunhistokemi og analyseret sammenhængen mellem SCP3 udtryk og clinicopathologic faktorer eller overlevelse. Overekspression af SCP3 fremmet AKT-medieret tumorigenese både

in vitro

in vivo

. Funktionelle undersøgelser under anvendelse NIH3T3-celler viste, at den C-terminale region af human SCP3 er vigtig for AKT aktivering og dens onkogent potentiale. Høj udtryk for SCP3 var signifikant associeret med tumor fase (

P

= 0,002) og tumor bedømmelse (

P

0,001), mens SCP3 udtryk var positivt associeret med Pakt proteinniveauet i cervikale neoplasier . Overlevelsestid for patienter med livmoderhalskræft overekspression både SCP3 og Pakt (median, 134,0 måneder,

n

= 68) var signifikant kortere end for patienter med lav udtryk for enten SCP3 eller Pakt (161,5 måneder, n = 108) bestemt ved multivariat analyse (

P

= 0,020). Vores resultater antyder, at SCP3 spiller en vigtig rolle i udviklingen af ​​livmoderhalskræft gennem AKT signalvejen, understøtter den mulighed, at SCP3 kan være et lovende hidtil ukendt cancer target for livmoderhalskræft terapi

Henvisning:. Cho H, Noh KH, Chung JY, Takikita M, Chung EJ, Kim BW, et al. (2014) Synaptonemal Complex Protein 3 Er prognostisk markør i livmoderhalskræft. PLoS ONE 9 (6): e98712. doi: 10,1371 /journal.pone.0098712

Redaktør: Eric Asselin, University of Quebec på Trois-Rivieres, Canada

Modtaget: September 28, 2013; Accepteret: 6 maj 2014; Udgivet: 6 juni 2014

Copyright: © 2014 Cho et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev finansieret af Grundforskningsfonden Korea (2012R1A2A2A01007527, 2012R1A6A3A01010537, fra 2011 til 0.005.230, fra 2011 til 0.010.286, og fra 2011 til 0.007.146), Korea Healthcare Technology R D Project (A121387, A110057 og A062260), og fakultetet forskningsbevillinger fra Yonsei University College of Medicine (3-2010-0072, 6-2011-0073, og 6-2013-0106). Denne forskning blev støttet delvist af Intramural Research Program for NIH, National Cancer Institute, Center for Kræftforskning. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Tumorceller vise en lang række antigener, herunder unormale udtryk for cancer /testis-associerede antigener (CTA’er). CTA’er er begrænset i normale væv i kimceller i testikler, med lejlighedsvis ekspression i kvindelige kønsorganer, og udtrykkes i histologisk forskellige typer af maligne humane tumorer [1] – [4]. Tumoren begrænset ekspressionsmønster af CTA’er gør dem et interessant mål for immunterapeutiske metoder [3], [5]. Rolle CTA ekspression i tumorceller er fortsat uklart, og dermed er et område med aktiv forskning. Ligeledes kan vores resultater på ekspressionen af ​​CTA’er og deres molekylære mekanisme i tumorceller give bedre indsigt i tumorigenese.

COR1 familiemedlemmer såsom X-linked lymfocyt reguleret protein (XLR), XLR-relateret meiose reguleret protein (XMR), og synaptonemal kompleks protein 3 (SCP3) er typiske CTA’er [1]. De er involveret i DNA-bindende proteiner og en strukturel komponent i synaptonemal kompleks, som medierer Synapsis, parring af homologe kromosomer under meiose af kimceller [6]. Især hanmus deficiente for SCP3 er sterile som følge af massiv apoptotisk celledød i testiklerne under meiotisk profase [6], [7]. Selvom SCP3 udtrykkes strengt i testes og ovarie i normale væv, er ekspression af SCP3 hyppigt observeret i forskellige humane cancerceller, såsom akut lymfoblastisk leukæmi og ikke-småcellet lungekræft [8], [9]. Vi har tidligere udført en lille pilotundersøgelse, og fandt, at SCP3 udtrykkes i forskellige cervikale cancercellelinier og et lille antal livmoderhalskræft væv [10]. Men ingen af ​​disse undersøgelser har givet overbevisende dokumentation for onkogene potentiale SCP3.

For at belyse den rolle SCP3 i tumorigenese, vi undersøgte, hvilken rolle disse medlemmer som potentielle oncoproteiner ved at gennemføre en række

In vitro

in vivo

eksperimenter under anvendelse af både en murin cellelinje (NIH3T3) og human livmoderhalskræft cellelinier (CUMC6, SiHa, CaSki, og HeLa). Her rapporterer vi, at overekspression af SCP3 inducerer fænotypiske ændringer karakteristisk for transformation både

in vitro

in vivo

. Derudover analyserede vi mønstre af SCP3 og Pakt udtryk ved immunhistokemi i cervikale vævsprøver fra patienter med cervikal intraepithelial neoplasi (CIN) eller invasiv cervikal karcinom. blev også analyseret Forholdet mellem proteinekspression og klinisk-patologiske parametre /overlevelse livmoderhalskræft kræftpatienter, og viste, at SCP3 udtryk er en prognostisk faktor for patienter med livmoderhalskræft.

Materialer og metoder

Mus og cellelinier

Seks til otte uger gamle Balb /c nøgne mus blev anskaffet fra Daehan Biolink (Chungbuk, Korea). Alle dyreforsøg blev udført under en protokol godkendt af Korea Universitet Institutional Animal Care og brug Udvalg (KUIACUC-2009-126). Den murine fibroblastcellelinie NIH3T3 og humane cervikale cancercellelinier CUMC6, SiHa, CaSki, og HeLa blev indkøbt fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) og blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagle-medium (DMEM) i nærvær af 10 % føtalt bovint serum (FBS). Alle celler blev dyrket i 5% CO

2 balanceret luft ved 37 ° C. Identiteter cellelinjer blev bekræftet ved kort tandem repeat (STR) profilering af IDEXX Laboratories Inc. og anvendes inden for 6 måneder til test.

Patienter og tumorprøver

Primære tumor prøver blev opnået mellem 1996 og 2010 fra 181 tilfælde af livmoderhalskræft, 301 tilfælde af høj grade cervikal intraepithelial neoplasi (CIN), og 99 tilfælde af lav kvalitet CIN gennemgår primær kirurgi på Gangnam Severance Hospital, Yonsei University College of Medicine. Alle patienter gav mundtligt og skriftligt informeret samtykke. Paraffin blokke til nogle af patienterne blev leveret af Korea Gynecologic Cancer Bank gennem Bio Medicinsk Teknologi Development Program for Ministeriet for undervisning, videnskab og teknologi, Korea (https://www.kgcb.or.kr). Alle tumorvæv blev histologisk revideret og kun prøver med en tilstrækkelig overflod af tumorceller blev inkluderet i væv microarray konstruktion. Iscenesættelse blev udført i overensstemmelse med den internationale sammenslutning af Gynækologi og obstetrik (FIGO) iscenesættelse system. Primær behandling for invasiv livmoderhalskræft bestod af en type 3 radikal hysterektomi med bækken lymfeknude dissektion. Samtidig Platinum-baserede chemoradiation blev givet i tilfælde med øget risiko for tilbagefald, såsom positive resektionsmarginer, positive lymfeknuder, eller parametrial invasion. Medicinske journaler blev gennemgået for at opnå data, herunder alder, kirurgisk procedure, overlevelsestid, og overlevelse status. Reaktion på terapi blev vurderet i henhold til de svar evalueringskriterier i solide tumorer (RECIST; udgave 1.0), enten ved computertomografi eller magnetisk resonans [11]. Data om tumorstørrelsen, celletype, tumorklassificering, og lymfeknudemetastase blev opnået ved at gennemgå patologi rapporter. Undersøgelsen protokol Den blev godkendt af Institutional Review Boards (interne metoder) af Gangnam Severance Hospital og Office of personmotiver Forskning på National Institutes of Health (NIH).

Construct af SCP3 og dens sletning mutant ekspressionsvektorer

hSCP3 fuld og deletionsmutanter blev skabt med en PCR-baseret strategi fra et humant testikel cDNA bibliotek (Clontech, Moutain View, CA) med følgende primere: hSCP3 en fremadrettet 5′-GCTCGAGATGGTGTCCTCCGGAAAAAAG-3 ‘; hSCP3 81 fremadrettet 5’-CCCTCGAGACCATGATTAACAAGGCTCTTCTT-3 ‘; hSCP3 131 fremadrettet 5’-GGCTCGAGATGGATATGCAGAAAGCTGAG-3 ‘; hSCP3 80 revers 5’-CGAATTCTCAGTCAACTCCAACTCCTTCCA-3 ‘; hSCP3 130 omvendt 5’CGAATTCTCAGAAACTGCTGAGAATAT-3 ‘; hSCP3 236 omvendt 5’-CGAATTCAGTCTTATTGTACCTAACTTCTCTG-3 ‘. hSCP3 1-236 (fuld), 1-80, 1-130, 81-236, og 131-236 fragmenter blev subklonet i pMSCV-puro vektor (Ciontech) på

Xho

I og

EcoR

I restriktionssteder. Rekombinante pMSCVs koder SCP3 eller dets deletionsmutanter blev bekræftet ved DNA-sekvensanalyse.

Construct af shSCP3 vektorer

For at generere Scp3 korte hårnål RNA (shRNA) exoression konstruere human Scp3-shRNA udglødet frem 5 ‘GATCCGGAGAAGAATCATGATAATTCAAGAGAT TATCATGATTCTTCTCCTTTTTTGGAAA-3’ (

Bam

HI-kompatibel) og reverse 5’AGCTTTTCCAAAAAAGGAGAAGAATCATGATAATCTCTTGAATTATCATGATTCTTCTCCG-3 ‘(

Hind

III-kompatible) oligonukleotider blev ligeret til

Bam

HI /

Hind

III-fordøjet pSilencer 3.1-H1 puro. Den shRNA kontrol ansat til disse undersøgelser var en kodet DNA-sekvens, der ikke målrettet nogen identificeret humane kodende sekvens (Ambion, Austin, TX).

Western blot-analyse

For hvert forsøg, i alt 5 × 10

5-celler blev skyllet to gange med iskold PBS og tilsat 0,2 ml af proteinet ekstraktionsopløsningen RIPA (Elpis Biotech, Daejeon, Sydkorea) [50 mM Tris Cl, pH 8,0, 150 mM NaCl, 1 mM phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), 0,1% natriumdodecylsulfat (SDS), 1% Nonidet P-40 (NP-40), 0,5 mM EDTA], inkuberet i 30 minutter på is, og derefter blev skrabet og centrifugeret. Proteinkoncentrationer blev bestemt ved coomassie plus protein assay (Pierce, Rockford, USA). 50 ug protein blev solubiliseret i Laemmli-puffer (62,5 mM Tris /HCI pH 6,8, 10% glycerol, 2% SDS, 5% mercaptoethanol og 0,00625% bromphenolblåt), koges i 5 minutter, og derefter adskilt ved SDS-polyacrylamidgelelektroforese. Adskilt gel blev overført til nitrocellulosemembraner ved 90 V i 1 time på is. Primære antistoffer mod phospho AKT (Ser473), AKT, og phospho ERK (T202 /Y204) blev indkøbt fra Cell Signaling (Beverly, MA) og anvendt i en fortynding på 1:1000. På samme måde blev primære antistoffer mod dobbelt phospho p38 MAPK (StressGen, Victoria, Canada) og SCP3 (BD ​​Biosciences, San Jose, CA) anvendt i en fortynding på 1:1000, mens antistoffer mod β-actin og Flag (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) blev anvendt i en fortynding på 1:10,000 i Tris-bufret saltvand (TBS) -T indeholdende 5% BSA (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) ved 4 ° C natten over, efterfulgt af 3 vaske i TBST, 5 minutter per vask. Gede-anti-muse-IgG-HRP, anti-kanin IgG-HRP sekundære antistoffer (1:5000) (StressGen) blev inkuberet i 1 time ved stuetemperatur konjugeret med peberrodsperoxidase. Immunoreaktive bånd blev visualiseret ved forøget kemiluminescens (ECL, Elpis Biotech). Densitometri blev udført ved hjælp af et billede analysator Fujifilm LAS-4000 (Fuji, Tokyo, Japan) og Multi Gauge V3.1 imaging software (Fujifilm Medical Systems USA, Inc., Edison, NJ). For at kvantificere intensiteten profil af protein band billeder, vi brugte billede J densitometri software (Version 1.6, National Institutes of Health, Bethesda, MD). Bandet billeder blev scannet i gråtoner med en opløsning på mindst 600 dpi og udtrykt i procent af den samlede størrelse af alle de målte toppe. For at beregne en relativ værdi, blev intensiteten af ​​hver prøve divideret med den for kontrollen. Tallene under western blots henviser til de relative værdier af intensiteten normaliseret til hver kontrol.

celleproliferation og kolonidannelse assays

I celleproliferationsassays, cellerne (n = 3) blev dyrket i seks brønde ved en densitet på 1 x 10

4 celler per brønd i 3 dage. Procentdelene af levende celler blev bestemt under anvendelse af et hematocytometer efter 0,4% trypanblåt-farvning. Målinger blev foretaget i tre eksemplarer for hver af cellelinierne og forsøgene blev gentaget tre gange. For den bløde-kolonidannelse assayet, 1 x 10

4 NIH3T3-celler, blev CaSki-celler og HeLa-celler udpladet i 6-brønds dyrkningsplade som en suspension i 2 ml DMEM indeholdende 10% FBS og 0,4% agar ovenpå af basislaget på 0,7% agar indeholdende 2 ml af det samme medium. Plader blev inkuberet ved 37 ° C i 2 uger, indtil kolonier blev dannet. To uger senere 2 mm kolonier blev talt med et okulært mikrometer på et mikroskop. Alle forsøg gentages mindst to gange.

siRNA behandling

Syntetisk lille interfererende RNA (siRNA) specifikt for grønt fluorescerende protein (GFP) og muse AKT blev indkøbt fra Invitrogen (Carlsbad, CA). Følgende sekvenser blev anvendt: GFP (ikke-specifik target kontrol) 5′-GCAUCAAGGUGAACUUCAA-3 ‘(sense), 5′-UUGAAGUUCACCUUGAUGC-3′ (antisense); AKT, 5’-GACAACCGCCAUCCAGACU-3 ‘(sense), 5′-AGUCUGGAUGGCGGUUGUC-3’ (antisense). For

in vitro

levering, NIH3T3-celler på en 6-brønds fartøj blev transficeret med 300 pmol af de syntetiserede siRNA’er anvendelse af Lipofectamine 2000 (Invitrogen) ifølge producentens instruktioner. SiRNA-behandlede celler blev opsamlet 48 timer efter transfektion for Western blot-analyse, celleproliferationsassay, og kolonidannende assay.

Tumordannelse

De transficerede NIH3T3-celler (1 x 10

5 celler /mus), CaSki-celler (1 x 10

6 celler /mus) eller HeLa-celler (1 x 10

6 celler /mus) blev injiceret subkutant i nøgne Balb /c-mus. Tumorstørrelse blev målt to gange om ugen i 24 dage efter tumorcelleinjektion. Hver enkelt tumorstørrelse blev målt med en skydelære, og tumorvolumen blev beregnet ud fra følgende formel: tumorvolumen (mm

3) = [bredde x længde

2] /2 [12]

Immunfluorescerende mærkning af tumor vævssnit

tumor vævsprøver blev fikseret og indlejret i Tissue-Tek OLT forbindelse (Sakura Finetechnical, Tokyo, Japan) i forme. For immunfluorescerende analyser blev 10 um kryosektioner placeret på poly-L-lysin-coatede objektglas, fikseret i 4% paraformaldehyd og blokeret i PBS med 10% normalt gedeserum (NGS) (NGS /PBS). Vævssnit blev inkuberet med Pakt antistof (1:100; cellesignalering) natten over ved 4 ° C. Efter vask blev snit inkuberet med det sekundære Alexa555-konjugeret gede anti-kanin IgG (1:1000 i NGS /PBS; Molecular Probes, Eugene, OR) og derefter monteret i Fluorescent Mounting Medium (Dako, Glostrup, Danmark) på glas mikroskop lysbilleder. Alle billeder blev erhvervet ved hjælp af et Zeiss LSM 5 Pascal konfokalmikroskop (Carl Zeiss, Jena, Tyskland). At kvantificere intensiteten profilen af ​​Pakt fluorescensbillede i tumor vævssnit, anvendte vi ImageJ densitometri software. De tumorvæv på dias blev scannet i gråtoner med en opløsning på mindst 600 dpi. Tumor områder på scannede billeder blev valgt mere end 10 gange fra hver gruppe med frihånd værktøj og målte middelværdien grå værdi. For at beregne en relativ værdi, blev intensiteten af ​​hver prøve divideret med den af ​​tomme dias (uden primært antistof).

Tissue microarray byggeri

Full-face sektioner af alle donorblokke blev farvet med haematoxylin og eosin (H fortynding 1:200) i 120 minutter ved stuetemperatur . EnVision FLEX + og EnVision + Dual Link System (Dako) blev anvendt til påvisning af SCP3 og Pakt, hhv. Farvning blev visualiseret ved anvendelse 3,3′-diaminobenzidin (DAB) og blev snittene modfarvet med hematoxylin. Endelig blev objektglassene dækket og observeret under et lysmikroskop (Axioplot, Carl Zeiss, Jena, Tyskland). I denne undersøgelse blev fem konventionelle hel sektion glider nøje udvalgt til at validere immunhistokemisk farvning udført for SCP3 og Pakt. Under denne proces blev farvningsmønstre grundigt sammenlignet, og nogle af de mønstre matchede de konventionelle objektglas fra samme sag. Endvidere ved udformningen denne undersøgelse, stromale celler fra hele sektioner af cercival cancer blev udvalgt som intern positiv kontrol, mens det primære antistof blev udeladt fra den negative kontrol.

SCP3 og Pakt farvningsresultater blev bedømt på grundlag af (a ) intensitet [kategoriseret som 0 (fraværende), 1 (svag), 2 (moderat), eller 3 (kraftig)] og (b) den procentdel af positive farvede epitelceller [scoret som 0 (0% positive), 1 (1 -25%), 2 (26-50%), 3 (51-75%) eller 4 ( 75%)] (fig S1). En samlet proteinekspression point er beregnet ved at gange intensiteten og positivitet score (samlet score range, 0-12). Den IHC score blev derefter dikotomiseret i høj ekspression (SCP3 IHC score på 7 og Pakt score på 7, henholdsvis), og lav ekspression (IHC score på ≤7 i både SCP3 og Pakt). Modtager opererer karakteristik (ROC) analyse blev anvendt ved fastsættelsen af ​​cut-off-værdier SCP3 og Pakt. Følsomheden og specificitet for diskriminerende død eller levende blev plottet ved hver IHC score og cut-off værdi blev fastsat til at være det punkt i ROC-kurven, hvor summen af ​​følsomhed og specificitet var maksimere [13]. To uafhængige patologer med erfaring i væv microarray analyse undersøgte dias uden nogen viden om de tilsvarende kliniske data.

Statistisk analyse

Alle data er repræsentative for mindst 2 uafhængige forsøg. Ikke-parametrisk 1-vejs eller 2-vejs ANOVA blev udført med SPSS-version 18.0 software (SPSS Inc., Chicago, IL). Sammenligninger mellem de enkelte datapunkter blev vurderet med t-test. Statistiske analyser af SCP3 og Pakt ekspression blev udført under anvendelse af Mann-Whitney-test og Kruskal-Wallis test. The Spearman parametrisk korrelation test blev anvendt til at analysere forholdet mellem SCP3 og Pakt. Overlevelseskurver blev estimeret ved Kaplan-Meier-analyse. Af log-rank testen blev anvendt til at sammenligne forskellene for overlevelse fordeling mellem grupperne. Den multivariate analyse med Cox proportional hazard model blev udført for at identificere uafhængige prædiktorer for sygdomsfri overlevelse i justering med relevante kliniske kovarianter såsom alder, FIGO stadium histologiske type, tumorklassificering, tumorstørrelse, og lymfeknude-status. Den endelige model blev valgt baseret på resultatet af univariable analyse samt hensyntagen til den kliniske eller biologiske betydning af variablerne. Alle statistiske tests var to-sidet, og

P

værdier. 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

Ektopisk udtryk for hSCP3 øger spredning og tumorgenicitet af NIH3T3 celler

En tidligere undersøgelse rapporterede, at menneskelig SCP3 (hSCP3) udtrykkes i forskellige kræftceller og at dens udtryk i humant prøvemateriale er forbundet med onkogenese [8], [10]. Men den onkogene potentiale SCP3 er ikke blevet tilstrækkeligt karakteriseret ved enten den molekylære eller cellulære niveau. For at undersøge, om hSCP3 kan have cellulære tumorigent potentiale, vi først brugt en ikke-tumorigen murine fibroblast NIH3T3 cellelinje og etablerede cellelinjer, der udtrykker hSCP3 ved hjælp af et retroviral transduktion-system (NIH3T3 /hSCP3). NIH3T3 /ingen indsats (tom vektor) celler blev også etableret som en kontrol. Ekspressionen af ​​SCP3 protein i NIH3T3 /hSCP3 celler blev bekræftet ved Western blot (figur 1A). Celleproliferation af transducerede NIH3T3-celler blev målt ved at tælle antallet af levende celler efter trypan blue-farvning. I celleproliferationsassays (Figur 1B), NIH3T3 /hSCP3 celler udviste en signifikant øget spredning sats sammenlignet med NIH3T3 /ingen indsætte celler (

P

0,005). Resultaterne af en blød agar-kolonidannelse assayet med de samme cellelinjer var i overensstemmelse med de for celleproliferationsassay (figur 1C). NIH3T3 /hSCP3 celler udviste signifikant højere potentialer kolonidannelse i blød agar i forhold til NIH3T3 /ingen indsætte celler (

P

0,005). Vi næste subkutant injiceret hSCP3- eller intet insert-udtrykkende NIH3T3 celle i venstre flanke af athymiske Balb /c nøgne mus (figur 1D). I overensstemmelse med vores

in vitro

data, tumor-dannende evne NIH3T3 celler drastisk forøget med ektopisk-udtrykkende hSCP3 (ingen insert

vs

. HSCP3,

P

(Til venstre) Repræsentative billeder af gennemsnitlig koloni størrelse i hver gruppe; (Højre) Søjlediagram der repræsenterer antallet af kolonier med diametre større end 2 mm i blød agar (skala bar: 1 mm). (D) tumorfremkaldende i NIH3T3 /hSCP3 celler. Balb /c nøgne mus (n = 5) blev inokuleret subkutant med 1 x 10

5 celler /mus af NIH3T3 /intet insert eller NIH3T3 /hSCP3 celler. Fejlsøjler repræsenterer middelværdien ± SD.

hSCP3 fremmer tumorigenese gennem AKT pathway i NIH3T3-celler

Vi har tidligere rapporteret, at Pakt niveauet hæves i hSCP3-udtrykkende cervikale cellelinier [10] . At vurdere ændringer i forskellige signalmolekyler, der kan spille en rolle i den globale kontrol af celleproliferation, udførte vi western blot-analyse for at måle indholdet af Ser473 phosphoryleret AKT, Thr 202 /Tyr 204 phosphoryleret ERK, og Thr 180 /Tyr 182 phosphoryleret p38 MAP-kinase i NIH3T3 celler, der udtrykker hSCP3 eller intet insert (tom vektor). Vi observerede, at ekspressionen af ​​Pakt var signifikant forøget i celler transduceret med hSCP3 sammenlignet med kontrolceller (figur 2A). Dernæst at undersøge forholdet mellem hSCP3-medieret tumorigent potentiale og AKT signalering, sammenlignede vi både celleproliferation og blød agar kolonidannende evne af NIH3T3 /hSCP3 celler i nærvær af kontrol (DMSO), 10 uM API2 (en hæmmer af AKT ), 50 pM PD98059 (en inhibitor af MEK /ERK) eller 10 pM SB203580 (en inhibitor af p38-MAPK) (figur 2B og 2C). Behandling med PD 98059 og SB203580 påvirkede ikke signifikant spredning og kolonidannelse kapacitet NIH3T3 /hSCP3 celler sammenlignet med DMSO. Tværtimod API2 behandlet NIH3T3 /hSCP3 celler udviste en signifikant nedsat proliferationshastighed sammenlignet med DMSO-behandlede kontrol (

P

0,001). Konsekvent, API2-behandlede NIH3T3 /hSCP3 celler dannet også mindre kolonier, hvis antal var næsten 5 gange mindre end kolonier dannet af DMSO-behandlede NIH3T3 /hSCP3 celler. Det er således indlysende, at både proliferation og kolonidannelse i disse celler er afhængige af AKT signalering. For at udelukke potentielle off-target effekter af API2, vi udførte

in vitro

celledeling og bløde agar koloni dannelse forsøg med siRNA-targeting AKT (siAKT) at blokere AKT-vejen. siRNA målretning til irrelevant GFP (GFP siRNA) blev anvendt som en negativ kontrol. I overensstemmelse med API2 data siAKT-behandlede NIH3T3 /hSCP3 celler udviste en nedsat sats for celledeling (figur 2D og 2E) og koloni antal sammenlignet med kontrol siGFP-behandlede NIH3T3 /hSCP3 celler (Figur 2F). Tilsvarende AKT afhængighed blev også observeret i NIH3T3-celler, der udtrykker mXLR, der udviste den mest potente tumorigent potentiale blandt medlemmer af det murine COR1 familien (fig S3). Således er vores data, at SCP3 og de andre COR1 medlemmerne skulle give tumorigene potentiale upon NIH3T3 celle gennem AKT pathway.

(A) Western blot-analyse af niveauer af Pakt, pERK, og pp38 i NIH3T3-celler ektopisk udtrykker hSCP3 eller intet insert. Tallene under western blots henviser til de relative værdier af intensiteten normaliseret til intet insert kontrol. (B)

In vitro

vækstkurver NIH3T3 /hSCP3 celler behandlet med DMSO eller API2 (Akt inhibitor), PD98059 (Erk inhibitor), eller SB203580 (p38-inhibitor). (C) blød agar kolonidannende kapacitet af NIH3T3 /hSPC3 celler i nærvær af API2, PD98059, eller SB203580; (C, Højre) Repræsentative billeder af gennemsnitlig koloni størrelse i hver gruppe; (C, Venstre) søjlediagram, der viser antallet af kolonier med diametre større end 2 mm i blød agar (skala bar: 1 mm). (D) Western blot-analyse af niveauer af Pakt i NIH3T3 /hSCP3 celler transficeret med et siRNA targeting GFP eller AKT (siGFP eller siAKT) for at bekræfte en reduktion af AKT-protein-niveau. Tallene under western blots henviser til de relative værdier af intensiteten normaliseret til intet insert kontrol. (E)

In vitro

vækstkurver NIH3T3 /hSCP3 celler transficeret med siGFP eller siAKT. (F) Soft agar kolonidannende kapacitet af NIH3T3 /hSPC3 celler behandlet med siGFP eller siAKT; (Venstre) Repræsentative billeder af gennemsnitlig koloni størrelse i hver gruppe; (Højre) Søjlediagram der repræsenterer antallet af kolonier med diametre større end 2 mm i blød agar (skala bar: 1 mm). Fejlsøjler repræsenterer middelværdien ± SD.

Den C-terminale region af hSCP3 er tilstrækkelig til at forøge Pakt niveauer og forbedre tumorigenese

Som skematiseret i figur 3A, indeholder hSCP3 en kernelokalisering (NLS, resterne 88-91), Gln-rige (resterne 106-139) og coiled-coil (resterne 131-236) motiver. At identificere de vigtigste motiver involveret i hSCP3-medieret onkogenese konstruerede vi fire deletionsmutanter af hSCP3 indeholdende forskellige motiver (figur 3A). N-terminalerne af fuld hSCP3 og deletionsmutanterne blev tagget med et Flag-epitop til visualisering med Western-blot. Vi kendetegnet derefter ekspressionen og funktionen af ​​hSCP3 og dens mutanter i retroviruslignende transducerede NIH3T3-celler. Især mutanter mangler den coiled-coil-motivet (hSCP3

1-80 og hSCP3

1-130) undlod at øge phosphorylering af AKT (figur 3B). Omvendt hSCP3

81-236 og hSCP3

131-236 mutanter indeholder det coiled-coil motiv held forhøjede niveauer af Pakt (figur 3B). I overensstemmelse med disse observationer, NIH3T celler, der udtrykker hSCP3

81-236 eller hSCP3

131-236 udviste en øget hyppighed af celledeling og antallet af koloni sammenlignet med dem, der udtrykker hSCP3

1-80 og hSCP3

1-130 samt ingen insert (figur 3C og 3D). Endnu vigtigere er, som vist i figur 3E-3G, lignende fænomener blev også observeret

in vivo

med tumor xenograft eksperimenter. Tumoren-dannende evne NIH3T3 celler drastisk forøget efter ektopisk udtryk for hSCP3

81-236 og hSCP3

131-236 [ingen insert

vs

. hSCP3

81-236 (

P

0,01) eller hSCP3

131-236 (

P

0,003)]. Tilsvarende blev immunfluorescensfarvning for Pakt steget betydeligt i histologiske snit af tumorer ektopisk udtrykker hSCP3

81-236 eller hSCP3

131-236 [ingen insert

vs

. hSCP3

81-236 (

P

0,05) eller hSCP3

131-236 (

P

0,003)] (figur 3G). Tilsammen indikerer vore data, at den dobbeltsnoet motiv indeholdende den C-terminale region er den primære bidragsyder til AKT-afhængige onkogent potentiale hSCP3.

(A) Skematisk af domænerne i hSCP3. Felter repræsenterer NLS, Gin-rige, og coiled-coil-motiver, hhv. (B) Western blot-analyse af niveauer af hSCP3 og dets deletionsmutanter, blev den N-terminale ender af hvilke mærket med et Flag-epitop til visualisering. Tallene under western blots henviser til de relative værdier af intensiteten normaliseret til intet insert kontrol. (C) blød agar kolonidannende kapacitet af NIH3T3 udtrykker vildtype eller deletionsmutanter af hSCP3. (D)

In vitro

vækstkurver NIH3T3 celler, der udtrykker vildtype eller deletionsmutanter af hSCP3. Celler blev talt efter farvning med trypanblåt at udelukke døde celler. (E)

In vivo

tumorgenicitet af NIH3T3 celler. Balb /c nøgne mus (n = 5) blev inokuleret subkutant med 1 x 10

5 celler /mus af NIH3T3 celler, der udtrykker fuld længde eller mutant hSPC3. Fejlsøjler repræsenterer middelværdien ± SD. (F) Repræsentative billeder af hudtumorer (skala bar: 60 mm). (G) Bar graf, der repræsenterer intensiteten af ​​Pakt fluorescens billede på tumor vævssnit blev ImageJ densitometri software, der anvendes til at kvantificere intensiteten af ​​billedet som beskrevet i Materialer og Metoder.