PLoS ONE: Protein Phosphorylering profilering Ved hjælp af en in situ Nærhed ligeringsassayet: Phosphorylering af AURKA-fremkaldte EGFR-Thr654 og EGFR-Ser1046 i lungekræft Cells

Abstrakt

epidermal vækstfaktor receptor (EGFR), som opreguleres i lungekræft, medfører aktivering af mitogene signaler og udløser flere signalleringskaskader. For at dissekere disse EGFR kaskader, vi brugte 14 forskellige phospho-EGFR antistoffer til at kvantificere protein fosforylering ved hjælp af en

in situ

nærhed ligeringsassayet (

in situ

PLA). Phosphorylering ved EGFR-Thr654 og -Ser1046 var EGF-afhængig i vildtype (WT) receptoren, men EGF-uafhængige i en cellelinie, der bærer EGFR-L858R mutation. Ved hjælp af en ProtoAarray ™ indeholder ~5000 rekombinante proteiner på proteinet chip, fandt vi, at AURKA interageret med EGFR-L861Q mutant. Desuden kunne overekspression af EGFR danne et kompleks med AURKA, og inhibitorer af AURKA og EGFR faldt EGFR-Thr654 og -Ser1046 phosphorylering. Immunhistokemisk farvning af trin I lunge adenocarcinom væv viste en positiv korrelation mellem AURKA udtryk og phosphorylering af EGFR på Thr654 og Ser1046 i

EGFR

-mutant prøver, men ikke i

EGFR

-WT prøver. Samspillet mellem EGFR og AURKA giver en forklaring på forskellen i afhængighed EGF mellem

EGFR

-WT og

EGFR

-mutant celler og kan give en ny terapeutisk strategi for lungekræftpatienter bærer

EGFR

mutationer

Henvisning:. Chen TC, Liu YW, Huang YH, Yeh YC, Chou TY, Wu YC, et al. (2013) Protein Phosphorylering profilering Brug af en

In Situ

Nærhed ligeringsassayet: Phosphorylering af AURKA-fremkaldte EGFR-Thr654 og EGFR-Ser1046 i Lung Cancer Cells. PLoS ONE 8 (3): e55657. doi: 10,1371 /journal.pone.0055657

Redaktør: Karl X. Chai, University of Central Florida, USA

Modtaget: 14. august 2012; Accepteret: 3 Januar 2013; Udgivet: 8 marts 2013

Copyright: © 2013 Chen et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne forskning blev støttet af tilskud fra National Science Council (NSC101-2325-B-010-011 og NSC101-2627-B-010-001), center of Excellence for Cancer Research på Taipei Veterans General Hospital (DOH101-TD-C- 111-007), og Undervisningsministeriet, Sigt efter Top University Plan (National Yang Ming University) til CYH. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

lungekræft er den mest almindelige årsag til kræftdødsfald i verden, og den femårige relative overlevelse på patienter med lungecancer er mindre end 15% [1]. Der er to hovedtyper af lungekræft: småcellet lungecancer (SCLC, ca. 20% af lungecancere) og ikke-småcellet lungekræft (NSCLC, ca. 80% af lungecancere) [2], [3]. Epidermal vækstfaktorreceptor (EGFR), som er en receptortyrosinkinase (RTK), initierer multiple signalveje i forbindelse med cancer progression, såsom dem involveret i celleproliferation, migration /invasion og cellecyklussen [4] – [7]. Overekspression af EGFR observeres hos ca. 50% af NSCLCs og er også forbundet med dårlig prognose og en mere aggressivt sygdomsforløb [8], [9].

EGFR

mutationer ofte påvist i NSCLC patienter (10-40%) [10], [11]. Ca. 50% af

EGFR

mutationer omfatter deletioner i exon 19, hvorimod 35-45% består af L858R mutation og 5% består af insertioner i exon 20 eller L861Q mutationen [10] – [12]. Gefitinib (Iressa) og Erlotinib (Tarceva) er EGFR-hæmmere, der bruges klinisk til behandling af fremskreden NSCLC, primært, at med

EGFR

mutationer i tyrosinkinasedomæner [13] – [16].

EGFR aktiveres ved binding af dens beslægtede ligander, såsom EGF og TGFa. Ligandbinding til vildtype (WT) EGFR resulterer i receptordimerisering og aktivering af den indre kinase domæne, efterfulgt af phosphorylering af specifikke tyrosinrester på cytoplasmatiske hale [17] – [19]. Den dysregulering af EGFR-aktiverede veje kan skyldes mutationer, der forårsager ligand-uafhængig receptordimerisering, aktivering og nedstrøms signalering [16], [20]. Ved EGF stimulering, EGFR tyrosinphosphorylering er en “tidlig begivenhed”, mens EGFR serin /threonin fosforylering, f.eks Ser967, forekommer med en tidsforsinkelse [21], [22]. Phosphorylering af EGFR på mange tyrosin sites efter ligand stimulation initierer nedstrøms signalleringskaskader, og phosphorylering af EGFR i serin /threonin er blevet rapporteret at dæmpe disse signaler gennem negativ feedback [23] – [25]. Mange serin og threonin phosphoryleringssteder er til stede i EGFR, men deres funktion er fortsat uklart. Desuden signaleringen resultat induceret ved phosphorylering af forskellige steder på EGFR er kompliceret og endnu ikke klarlagt for udviklingen af ​​terapeutiske anvendelser.

AURKA proteinkinasen har tiltrukket opmærksomhed, fordi dets overekspression er blevet fundet i forskellige epitel- maligne tumorer [26], [27], såsom bryst- [28], colon [29], æggestokkene [30] og lungekræft [31], som resultat af genamplifikation, transcriptional deregulering eller defekter i proteinstabilitet og kontrol af kinaseaktivitet [32]. Dysregulering af AURKA og EGFR er observeret i forskellige typer af kræft og er en vigtig indikator for prognose i kræft udvikling [33]. En tidligere undersøgelse viste, at EGF-induceret rekruttering af nuklear EGFR og STAT5 til AURKA promotor yderligere forøget AURKA genekspression [34]. Desuden EGFR øger protein ekspression af AURKA ved at aktivere den translationelle maskineri via ERK og AKT pathways [35]. Disse resultater rejser muligheden for, at disse to proteiner funktionelt hænger sammen.

For nylig,

in situ

nærhed ligeringsassayet (

in situ

PLA) blev udviklet til at registrere og visualisere endogene PPI og post-translationelle modifikationer af proteiner, f.eks phosphorylering, med høj følsomhed og specificitet [36], [37]. For at påvise protein fosforylering, blev udvalgt to mål af primære antistof par [en, der genkender målet protein (fx EGFR), og en anden, der genkender phospho-site af målet (fx pEGFR-Tyr1068)]. Hvis målene for et antistof par er i tæt nærhed, vil sekundære antistoffer konjugeret med oligonukleotider være tilstrækkelig tæt til at tjene som skabeloner til ligering af yderligere to lineære oligonucleotider i en DNA cirkel. DNA cirkel kan amplificeres med oligonukleotidet af en af ​​de sekundære antistoffer ved anvendelse af rolling circle-amplifikation (RCA). RCA Produktet kan derefter hybridiseres med fluorescensmærkede oligonukleotider til generering af et prik-signal, der angiver den subcellulære lokalisering og hyppigheden af ​​phosphorylering [36], [37]. Denne teknik har høj specificitet og følsomhed til vurdering af protein phosphorylering og giver nye muligheder for nøjagtigt kvantificere protein phosphorylering og signaltransduktion i celler.

Her har vi brugt 14 forskellige EGFR phosphoryleringsassays-site-målrettede antistoffer med

in situ

PLA at belyse forskelle mellem EGFR-WT og EGFR-L858R mutant i lunge kræftceller. Af særlig interesse er identifikationen af ​​to EGF-uafhængig phosphoryleringssteder (EGFR-Thr654 og EGFR-Ser1046) i celler der bærer EGFR-L858R mutation. Desuden har både EGFR-WT og EGFR-L858R mutant viste fysiske interaktioner med AURKA under EGF stimulering. EGFR-Thr654 og EGFR-Ser1046 fosforylering faldt ved påføring af en AURKA inhibitor, men kun i EGFR-L858R mutant cellelinjer, som er rejst muligheden for den terapeutiske anvendelse af AURKA hæmmere hos patienter med lungecancer.

Resultater

Profilering af EGFR-phosphorylering i lungecancerceller

EGFR phosphorylering spiller en central rolle i modulering af aktivering af signalveje relateret til cancer progression [4] – [7]. Der er mange EGFR phosphoryleringssites (https://www.phosphosite.org) [38], og mange af dem er ikke blevet undersøgt i udstrakt grad (figur 1), på grund af en mangel på antistoffer og metoder til påvisning. I den foreliggende undersøgelse blev 14 phosphorylerede EGFR-antistoffer anvendes til

in situ

PLA at kvantificere det basale niveau af EGFR-signalering i HeLa-celler, som er den fælles cellelinie til screening (Tabel 1). Alle de testede negativ i antistoffer

in situ

PLA-assay i HeLa-celler, hvilket er konsistent med den ide, at EGFR aktiveres ved binding af dens ligand og udløser nedstrømseffektorer gennem receptordimerisering og phosphorylering af specifikke tyrosin rester i den cytoplasmatiske hale [17] – [19]. For at bekræfte følsomheden og specificiteten af ​​

in situ

PLA, vi derefter bruges A431 celler, som er velkendte for at udtrykke høje niveauer af EGFR og hyper-phosphoryleret EGFR-Tyr1068 under EGF stimulering. (Figur 2, blev de repræsentative BlobFinder overlay billeder vist i figuren S1). Således blev A431-celler valgt som en positiv kontrol. Den pEGFR-Tyr1068 blev opreguleret af en ca. 15-fold stigning på EGF stimulering som bestemt af

in situ

PLA assay (figur 2A og 2B), mens det kun var opreguleret med 2,6-fold, som bestemt ved immunoblotting ( Figur 2C), hvilket indikerer den høje følsomhed af

in situ

PLA-analysen.

EGFR phosphoryleringssite oplysninger blev indhentet fra PubMed og PhosphoSitePlus (https://www.phosphosite.org) .

A431-celler blev serum-udsultet i 16 timer og derefter behandlet med EGF (10 ng /ml) i serumfrit medium i 10 minutter. (A)

In situ

PLA er meget følsom til påvisning af phosphorylering af pEGFR-Tyr1068 efter EGF-stimulering. (B) Kvantificeringen af ​​disse to signaler er vist. (C) EGFR og pEGFR-Tyr1068 blev påvist i A431-celler ved immunblotting analyse.

Differentiel udtryk for EGFR fosforylering efter EGF stimulering mellem EGFR-WT og EGFR-mutant celler

EGFR aktivering initierer multiple signalveje, og dysregulering af EGFR-aktiverede veje kan være en konsekvens af forskellige

EGFR

mutation [39]. For at bestemme forskellen fosforylering status EGFR phosphoryleringssites, vi har registreret EGFR fosforylering på forskellige steder i H1299 lunge kræftceller, der stabilt udtrykte en tom vektor, EGFR-WT eller EGFR-L858R mutant med eller uden ligand stimulation. I H1299-EGFR-WT stabile celler, 9 af 14 EGFR phosphoryleringssteder var phosphoryleret på EGF-stimulering. Resten af ​​pEGFR antistoffer ikke påvist et signal på immunblotting. I modsætning hertil i EGFR-L858R mutant celler, EGF-induceret (EGFR-Tyr992, EGFR-Tyr1068 og EGFR-Tyr1148) og EGF-uafhængig phosphorylering (EGFR-Thr654, EGFR-Tyr845, EGFR-Tyr974, EGFR-Ser1046, EGFR -Tyr1086, og EGFR-Tyr1101) blev identificeret (figur 3A-3C). Sammenligne resultaterne af

in situ

PLA og immunblotting blev lignende phosphorylering mønstre observeret for alle de screenede phosphoryleringssites (tabel S1 og figur S2). Phosphoryleringsniveauerne mønstre af de 14 forskellige EGFR phosphoryleringssteder som bestemt ved

in situ

PLA og immunblotting er opsummeret i tabel 1.

H1299 celler stabilt udtrykte tom vektor, EGFR-WT eller mutant EGFR -L858R. (A) efter stimulering med EGF (10 ng /ml) i serumfrit medium i 10 minutter, blev celleekstrakter underkastet immunoblotting-analyse med de angivne phospho-tyrosin antistoffer. EGF-afhængig (EGFR-Tyr992, -Tyr1148 og -Tyr1068) og EGF-uafhængig [EGFR-Tyr845, -Tyr974, -Tyr1086 og -Tyr1101, -Thr654 (se nedenfor) og -Ser1046 (se nedenfor)] fosforylering blev observeret i H1299-celler udtrykker EGFR-L858R mutant. Phosphorylering af EGFR-Thr654 (B) og -Ser1046 (C) med eller uden EGF behandling i forskellige lungecancer cellelinier blev overvåget via

in situ

PLA. Kvantificeringen af ​​

in situ

PLA er vist til højre. EGFR-Thr654 og -Ser1046 blev phosphoryleret ved behandling EGF i H1299-EGFR-WT celler, mens deres fosforylering var EGF-uafhængig i H1299-EGFR-L858R celler. (D) Immunblotting analyse af EGFR-Thr654 og -Ser1046 blev udført i EGFR mutantceller (H1975, der indeholder EGFR-L858R og -T790M mutanter) og celler, der udtrykker EGFR-WT (A549). Phosphorylering af EGFR-Tyr1068 blev induceret af EGF. Phosphorylering af EGFR-Thr654 og -Ser1046 var EGF-uafhængig i H1975 og H1299-EGFR-L858R celler, som bestemt ved immunblotting.

Phospho-EGFR-Thr654 og phospho-EGFR-Ser1046 udstilling EGF- uafhængig phosphorylering i H1299-EGFR-L858R mutantceller

i H1299-EGFR-L858R cellelinje blev phosphorylering af EGFR-Thr654 (figur 3B) og EGFR-Ser1046 (figur 3C) blev identificeret som EGF-uafhængig phosphorylering af

in situ

PLA og Western blot analyser (de repræsentative BlobFinder overlay billeder blev vist i figuren S3 og fig S4). Men disse to phosphoryleringssteder udviste EGF-afhængig phosphorylering i H1299-celler udtrykker EGFR-WT. Derudover pEGFR-Thr654 og pEGFR-Ser1046, der blev anset for at phosphoryleres af andre kinaser [40] -. [42], men ikke af EGFR auto-fosforylering, blev udvalgt til at kontrollere de funktionelle virkninger på EGFR signalvejen

Vi vurderet yderligere, om EGF-uafhængig phosphorylering af EGFR-Thr654 og -Ser1046 kun forekommer i celler med overekspression af EGFR-L858R og forårsages af dysregulering af EGFR-signalvejen. Vi brugte A549 (lunge kræftceller med endogene EGFR-WT) og H1975 (lunge kræftceller med endogen muterede EGFR-L858R-T790M) at overvåge dem. Figur 3D viser, at phosphorylering af EGFR-Thr654 og -Ser1046 var EGF-uafhængig i celler, der udtrykker eksogene og endogene EGFR-L858R. Således blev forskellige EGFR serin /threonin phosphoryleringsassays mønstre observeret som EGF-uafhængig fosforylering i EGFR-L858R mutant celler.

Den fysiske vekselvirkning mellem AURKA og EGFR

AURKA er en kinase, der er stærkt udtrykt i mitose og har været impliceret i de forandringsprocesser celle processer [43]. I en søgning efter yderligere substrater og interagerende proteiner ved anvendelse af en ProtoAarray ™ [44], som indeholdt ~5000 rekombinante proteiner på proteinet chip (www.invitrogen.com/protoarray), fandt vi, at AURKA interageret med EGFR-L861Q mutant, som omfatter -5% af

EGFR

mutationer i lungekræftpatienter [10], men ikke EGFR-WT (figur 4A). For at bekræfte denne interaktion, som kunne reguleres af kinase aktivitet AURKA, AURKA-WT og AURKA-KD (AURKA-K162I mutant, som er kinase-død), blev anvendt til co-immunopræcipitation, som viste, at EGFR-WT og EGFR-L858R interagerede med AURKA-WT og AURKA-KD under overekspression af EGFR og AURKA (figur 4B). Resultaterne viste, at den katalytiske aktivitet af AURKA ikke modulere interaktionen med EGFR. Da EGFR-L858R mutant ofte (ca. 35-45%) synes i NSCLC patienter [12], valgte vi H1299-EGFR-L858R stabile celler til yderligere at karakterisere interaktionen med AURKA. For at undersøge, om der findes de endogene EGFR-AURKA interaktioner i lungekræft celler og om det er EGF afhængig, vi anvendte

in situ

PLA at bestemme EGFR-AURKA interaktion i A549 og H1975 med eller uden EGF stimulering (figur 4C). Det viste både EGFR-WT og EGFR-L858R interagerede med AURKA under EGF-stimulering.

(A) Vi brugte ProtoArray ™ til at identificere EGFR som en ny interaktion partner for AURKA. Kort beskrevet udtrykt, var rekombinant His-mærket humant AURKA probet på ProtoArray ™ human protein microarrays på syv koncentrationer (0, 0,5, 1,0, 5,0, 10, 50 og 100 ng /pl) i to eksemplarer. Det skal bemærkes, at EGFR-L861Q, men ikke EGFR-WT, blev indledningsvis identificeret til at interagere med AURKA. (B) HEK293T blev co-transficeret med Myc-EGFR (EGFR-WT, EGFR-L858R og -L861Q mutanter) og Flag-AURKA [AURKA-WT og AURKA-kinase dead (KD)]. Efter transfektion i 48 timer blev celleekstrakter underkastes co-immunpræcipitering med et anti-FLAG M2 affinitet gel. Proteinekspression blev bestemt ved immunoblotting med anti-Myc og anti-FLAG-antistoffer. Det viste, at begge EGFR-WT og muteret EGFR associerer med AURKA-WT og AURKA-KD. Lignende resultater blev observeret i mindst tre uafhængige forsøg. (C) The EGFR-AURKA interaktion med eller uden EGF-stimulering (10 ng /ml i 10 minutter) blev bestemt via

in situ

PLA i A549 (EGFR-WT) og H1975 (EGFR-L858R-T790M mutationer ). Både EGFR-WT og -L858R mutant var forbundet med AURKA under EGF stimulering. Kvantificeringen af ​​

in situ

PLA-signaler blev vist til højre. (D) De phosphoryleringssteder af EGFR-Thr654 og -Ser1046 matchede substrat konsensus sekvenser for AURKA. (E) H1975 celler viste mere indlysende fosforylering på EGFR-Thr654, EGFR-Ser1046 og AURKA-Thr288 i nocodazol-anholdt M-fase end i interfase.

EGFR-Thr654 og EGFR-Ser1046 kamp AURKA fosforylering konsensussekvenser

Fordi AURKA forbundet med EGFR, vi næste undersøgt, om AURKA phosphorylerer EGFR på Thr654 og Ser1046. De omkringliggende sekvenser for de EGFR phosphoryleringssteder på Thr654 og Ser1046 er RHIVRKRT

654LRRLLQE og DSFLQRYS

1046SDPTGAL hhv. De AURKA phosphoryleringsmotiver indeholder R-X-S /T, K-X-S /T, K-R-X-S /T, R-R-X-S /T og R-X-X-S /T (X angiver enhver aminosyre) [45]. Baseret på disse motiver, EGFR-Thr654 matches R-X-X-S /T konsensussekvens og EGFR-Ser1046 matches R-X-S /T konsensussekvens af AURKA (figur 4D). Selvom EGFR-Thr654 blev rapporteret at være phosphoryleret af proteinkinase C (PKC) [42] kan PKC ikke være den eneste kinase, der phosphorylerer EGFR på denne rest. Fordi kinaseaktiviteten af ​​AURKA stigninger i M-fase [46], vi først betegnet phosphorylering af endogen EGFR-Thr654 og EGFR-Ser1046 ved M-fase i A549 og H1975-celler. H1975 celler demonstrerede mere indlysende phosphorylering af EGFR-Thr654, EGFR-Ser1046 og AURKA-Thr288 end A549 celler. I modsætning hertil EGFR-Tyr1068 demonstrerede samme phosphorylering mønster i M-fase og interfase (figur 4E), som antyder, at ekspressionsmønstre for phosphoryleret EGFR-Thr654 og EGFR-Ser1046 var den samme med den for AURKA især i EGFR-mutant celler .

EGFR-Thr654 og EGFR-Ser1046 fosforylering sker senest EGFR-Tyr1068 fosforylering efter EGF stimulering

phosphorylering af EGFR-Tyr1068 efter EGF stimulering observeret ved 0, 2, 5, 10 og 30 minutter i H1299-celler udtrykker EGFR-WT var hurtigere end phosphorylering af Thr654 og Ser1046. Phosphorylering af EGFR-Tyr1068 toppede 2 minutter efter EGF-stimulering, men EGFR-phosphorylering ved Thr654 og Ser1046 toppede ved 10 minutter efter EGF-stimulering (figur 5A). I modsætning hertil EGFR-L858R celler, var der ingen forskel i fosforylering kinetikken mellem Thr654 og Ser1046 (figur S5). Således EGFR tyrosinphosphorylering sker før andre serin /threonin-phosphorylering ved Thr654 og Ser1046, som bestod med den tidligere undersøgelse af EGFR serin /threonin-phosphorylering med tidsforsinkelse [21], [22].

(A) phosphorylering af EGFR-Tyr1068 var hurtigere end for EGFR-Thr654 og EGFR-Ser1046 under EGF (10 ng /ml) stimulation. (B) Cellerne blev serumudsultet i nærvær af VE-465 (1 nM eller 100 nM), som er en AURKA inhibitor, i 16 timer og derefter behandlet med EGF (10 ng /ml) i 10 minutter. Phosphorylering af EGFR-Thr654 og EGFR-Ser1046, men ikke pEGFR-Tyr1068, blev undertrykt af VE-465. (C) Cellerne blev serumudsultet i nærvær af Iressa (10 uM) i 16 timer og derefter behandlet med EGF (10 ng /ml) i 10 minutter. Iressa, hvilket er en EGFR-inhibitor, blev anvendt til at overvåge EGFR-signalering i H1299-celler der stabilt udtrykker EGFR-WT og EGFR-L858R mutant. Phosphoryleringen af ​​AURKA på Thr288 blev undertrykt af Iressa i begge cellelinier. (D) H1975-celler blev behandlet med VE-465 og /eller Iressa (10 uM) i 16 timer. VE-465 og Iressa kan undertrykke pEGFR-Thr654 og -Ser1046 i H1975.

AURKA inhibitor undertrykker EGFR serin /threoninphosphorylering

For at undersøge forholdet mellem EGFR serin /threonin phosphorylering og AURKA, en AURKA inhibitor (VE-465), der undertrykker AURKA aktivitet som målt ved Thr288 phosphorylering [47], men proteinniveauet af AURKA, blev påført overvåge phosphorylering af EGFR-Thr654 og EGFR-Ser1046 samt EGFR signalvejen (Pakt-Ser473). Under VE-465 behandling, phosphorylering af EGFR-Thr654 og -Ser1046 faldt, men EGFR-Tyr1068 phosphorylering blev ikke påvirket (figur 5B), hvilket indikerer, at phosphorylering af EGFR-Thr654 og EGFR-Ser1046 blev reguleret af AURKA kinaseaktivitet.

Iressa er en EGFR-inhibitor, der undertrykker AKT-vejen og hæmmer AURKA fosforylering

for at vurdere reguleringen af ​​EGFR og AURKA i EGFR signalvejen, blev en EGFR inhibitor (Iressa), der anvendes til at blokere EGFR autophosphorylering og dens nedstrøms signalering. Iressa undertrykte AURKA aktivitet og phosphorylering af EGFR-Thr654 og EGFR-Ser1046 (figur 5C), hvilket tyder på, at AURKA kan tjene som en downstream mål af EGFR. Foruden de EGFR-overudtrykkes celler, vi viste også phosphoryleringsstatussen af ​​EGFR-Thr654 og -Ser1046 i endogen L858R mutantceller (H1975) under behandling af VE-465 og Iressa (figur 5D). Fald i pEGFR-Thr654 og -Ser1046 blev observeret i H1975 med VE-465 behandling. Selvom Iressa hæmmede pEGFR-Thr654 og -Ser1046 i H1975, kombinationen af ​​Iressa og VE-465 kan endvidere nedsætte pEGFR-Thr654 og -Ser1046 i H1975, hvilket betyder, at disse to pEGFR steder blev reguleret af både EGFR og AURKA kinase aktivitet.

IHC-analyse af AURKA, pEGFR-Thr654 og pEGFR-Ser1046 i fase i lungeadenokarcinom

for yderligere at vurdere forholdet mellem AURKA og EGFR fosforylering blev 25 stage i lungeadenokarcinom prøver udsat for IHC farvning af pEGFR-Thr654, pEGFR-Ser1046 og AURKA (figur 6). Atten af ​​disse NSCLC prøver havde

EGFR

mutationer som bestemt ved sekvensanalyse af

EGFR

tyrosin kinase domæner. Ekspressionen af ​​pEGFR-Ser1046 og AURKA var signifikant højere i tumorer end i det tilstødende normale væv (p = 0,001) af 25 NSCLC-patienter (tabel 2). Desuden udtryk for AURKA viste en positiv sammenhæng med en betydelig korrelationskoefficient med pEGFR-Thr654 (p 0,05) og pEGFR-Ser1046 (p 0,001) hos patienter med

EGFR

mutant, men ikke med

EGFR

-WT, som analyseret ved Spearman ikke-parametrisk korrelation test (tabel 3). Sammenfattende denne immunkemiske farvning indikerer en mulig forbindelse mellem AURKA og muteret EGFR via -Thr654 og -Ser1046.

Hver kolonne angiver en patient og hver række angiver et antistof. Den IHC intensitet i patienter blev defineret som 0, 1 og 2 for AURKA, pEGFR-Thr654 og pEGFR-Ser1046 farvning. Vejviser

Som konklusion, samspillet mellem AURKA og EGFR-L858R mutant kan forklare forskellen i signalveje mellem

EGFR

-WT og mutant celler, som ofte observeres i NSCLC patienter, og kan således give værdifulde oplysninger til terapeutiske anvendelser.

diskussion

dysregulering af EGFR-aktiverede veje er ofte forbundet med receptor-mutationer og forudsiger reaktion på tyrosinkinaseinhibitorer i NSCLC-patienter [48], [49]. Profilen af ​​EGFR fosforylering i

EGFR

mutant lunge kræftceller fortsat uklart. I denne undersøgelse, vi (1) analyseres systematisk endogene EGFR phosphoryleringsassays ændringer for at identificere afhængighed særskilt EGF i forskellige

EGFR

genotyper i lungekræft celler; (2) viste en ny relation mellem AURKA og EGFR, hvilket kan være medieret via en AURKA-fremkaldte fosforylering arrangement på EGFR-Thr654 og -Ser1046 i lungekræft celler; og (3) bestemt udtryk for AURKA, EGFR-Thr654 og EGFR-Ser1046 i lunge adenocarcinom væv. Disse data understreger behovet for yderligere analyse for forholdet mellem EGFR og AURKA i

EGFR

-mutant patienterne og giver ny indsigt i den terapeutiske anvendelse af AURKA inhibitorer i lungekræftpatienter.

EGFR- Thr654 vides at blive phosphoryleret af PKC og er involveret i negativ regulering af EGFR-signalering efter EGF-stimulering [50], [51]. Endvidere er den phosphorylering af EGFR ved rest Thr654 blev rapporteret at være forbundet med strålingsinduceret nuklear EGFR translokation, som fremmer celleproliferation og metastase ved at øge transkriptionen af ​​cyclin D1, iNOS og B-Myb [52] – [54]. Efter cellen udsættes for ioniserende stråling, DNA-afhængig kinase (DNA-PK) interagerer med nuklear EGFR og reparationer ikke-homologe endesammenslutning DNA-double strengbrud, som forårsager radioresistance i radioterapi. I den foreliggende undersøgelse, EGFR-Thr654 var konstitutivt phosphoryleret i EGFR-L858R mutant celler. Det ville være interessant at undersøge, om EGFR-Thr654 fosforylering påvirker radioresistance under strålebehandling i EGFR-L858R mutant celler. Desuden har vi også vist, at en AURKA inhibitor formindskede phosphorylering af EGFR-Thr654, som kunne give en potentiel mulighed for en ny klinisk strategi med en AURKA inhibitor.

Cellular stressfaktorer, såsom TNF-α og UV-bestråling , er blevet rapporteret at inducere phosphorylering af EGFR-Ser1046 via p38 MAPK og derefter forårsage EGFR desensibilisering ved EGF stimulering og endocytose [55], [56]. I ligand-induceret EGFR aktivering, flere tyrosinrester, fx Tyr-1045 og Tyr-1068, primært phosphoryleret. Grb2 binder derefter til phosphoryleret tyrosin at aktivere MAPK’er. Efterfølgende MAPK’er phosphorylerer serin /threonin-rester, såsom Ser-1046 på EGFR som en feedback-kontrol. Phosphorylering af EGFR-Ser1046 af p38 blev også for nylig bestemt til at være en vigtig signal, der forhindrer pro-apoptotiske kløvning af caspase og PARP på TNF stimulation [57]. Upon EGF-stimulering, er EGFR kun lidt phosphoryleret i Ser1046 at tilvejebringe en anti-apoptose virkning [57]. I denne undersøgelse viste vi, at EGFR-Ser1046 fosforylering er EGF-uafhængige i EGFR-L858R mutant celler, hvorimod EGFR-Ser1046 fosforylering er EGF-afhængig i EGFR-WT celler. Således, uanset om EGFR-Ser1046 fosforylering i EGFR-L858R mutant celler resulterer i en anti-apoptotiske effekt berettiger yderligere undersøgelser.

H1299-EGFR-L858R celler har en lavere EGFR niveau end i H1299-EGFR-WT celler; dog EGF-uafhængig basale phosphoryleringsniveauerne i L858R celler på flere Ser, Thr, og Tyr-rester er stærkere end i EGFR-WT-celler (figur 3). Dette indikerer, at mens L858R mutant receptor viste en lavere ekspressionsniveau, var det hyper-phosphoryleret end vildtype-receptoren. Desuden er EGFR L858R mutant kendt for at være mere aktiv end EGFR-WT i tidligere undersøgelse [16]. Samlet set EGFR fosforylering i L858R celler var mindre lydhøre over for EGF. Dette kan skyldes de højere basale phosphoryleringsniveauerne af mutant receptor eller på grund af dets lavere ekspressionsniveau. Fordi EGFR-signalering kan øge protein ekspression af AURKA [34], [35], AURKA også regulere EGFR phosphorylering. Her viste vi, at EGFR-AURKA interaktion kun skete efter EGF-stimulering (figur 4C), hvilket indebærer, at AURKA kunne deltage i EGFR signalering kaskade. I nocodazol-anholdt M-fase, viste EGFR-mutant celler mere indlysende fosforylering på EGFR-Thr654, EGFR-Ser1046 og AURKA-Thr288 end celler, der udtrykker EGFR-WT (Figur 4E). EGFR aktivering forekommer gennem AKT pathway og EGFR kan opregulere AURKA ekspression ved at aktivere den translationelle maskineri via AKT pathway [35]. Den AURKA hæmmer VE-465 undertrykte AKT-vejen og hæmmede EGFR serin /threonin fosforylering, især i celler, som bærer

EGFR

mutationer, men påvirkede ikke EGFR tyrosinphosphorylering (figur 5B). Når cellerne blev behandlet med EGFR-inhibitor Iressa at blokere EGFR autophosphorylering, phosphoryleringen af ​​AURKA forsvandt (figur 5C), hvilket antyder, at EGFR-mutanter konstitutivt kan aktivere phosphorylering og forbedre nedstrøms signalering at fremme carcinogenese. Dog skal forholdet mellem AURKA, EGFR-WT og mutant EGFR evalueres yderligere for at identificere terapeutiske mål for lungecancerpatienter.

Sammenfattende ved profilering EGFR-phosphorylering i vildtype og mutant lungecancerceller, vi identificeret en sammenhæng mellem

EGFR

mutationer og phosphorylering af EGFR-Thr654 og -Ser1046, der var forbundet med AURKA udtryk i patienter med lungecancer og kan udløses af AURKA. Samspillet mellem EGFR og AURKA i

EGFR

mutation celler antyder, at AURKA hæmmere kan have terapeutisk effekt. Vi forventer, at denne undersøgelse vil fremme udviklingen af ​​en effektiv terapeutisk strategi for lungekræft.

Materialer og metoder

cellelinjer, cellecyklus synkronisering og EGF stimulering

etablering af H1299 kloner stabilt udtrykker en tom vektor (H1299-Vec), blev EGFR-WT (H1299-EGFR-WT) eller EGFR-L858R mutant (H1299-EGFR-L858R) beskrevet tidligere [16]. A549 (med EGFR-WT), H1975 (med endogent muteret EGFR-L858R-T790M) og H1299 stabile kloner blev dyrket i RPMI-1640-medium, og A431-celler blev holdt i DMEM suppleret med 10% dødelig bovint serum (FBS), 100 U penicillin, 0,1 mg /ml streptomycin, og 2 mM L-glutamin. Alle cellekulturreagenser var fra Invitrogen. At synkronisere cellecyklussen af ​​A549 og H1975 lungecancer-cellelinjer, eksponentielt voksende celler blev inkuberet med 100 ng /ml nocodazol (Sigma) i 16 timer. Til stimulering af cellerne med EGF blev cellerne serum-udsultet i 16 timer, efterfulgt af en 10 minutters behandling med EGF (10 ng /ml) i serum-frit medium.

Immunoblotting analyse

cellelysaterne (50 ug) blev underkastet SDS-polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) og efterfølgende overført til polyvinylidenedifluoride (PVDF) membran (Millipore) ved anvendelse af Bio-Rad transfersystemet. PVDF-membranen blev blokeret med 5% fedtfri skummetmælk (BD Bioscience) ved stuetemperatur i 1 time efterfulgt af inkubation med det primære antistof ved 4 ° C natten over. Alle phospho-polyklonale EGFR antistoffer (pEGFR-Thr654, pEGFR-Thr669, pEGFR-Ser671, pEGFR-Ser774, pEGFR-Tyr845, pEGFR-Tyr974, pEGFR-Tyr992, pEGFR-Tyr1045, pEGFR-Ser1046, pEGFR-Tyr1086, pEGFR-Tyr1101