PLoS ONE: -fucosylerede Glykaner i α1-syre-glycoprotein for Overvågning behandlingsresultater og prognose af kræftpatienter

Abstrakte

En standard behandlingsmulighed for avanceret fase kræft er kirurgisk resektion af maligne tumorer efter med adjuverende kemoterapi og strålebehandling. Derudover kan neoadjuverende kemoterapi anvendes, hvis det kræves. Under tidsforløbet af behandlinger, patienter generelt følger computertomografi (CT) overvågning, samt ved tumormarkør diagnose. øjeblikket, er dog fortsat, tidlig tegn på tilbagefald og /eller metastase af tumorer med en klinisk relevant biomarkør en stor terapeutisk udfordring. Især har der ikke været nogen valideret biomarkør til forudsigelse behandlingsresultater i terapeutiske sammenhænge. For nylig har vi set på glycoformer af serum α

1-syre-glycoprotein (AGP) ved hjælp af en krydset affinoimmunoelectrophoresis med to lektiner og et anti-AGP antistof. De primære glykanstrukturer af AGP blev også analyseret ved et massespektrometer og en hidtil ukendt software i et stort antal patienter med forskellige cancerformer. Derfor blev den relative forekomst af α1,3fucosylated glycaner i AGP (FUCAGP) fundet at være signifikant høj i kræftpatienter i forhold til de raske kontroller. Desuden blev påfaldende forhøjede niveauer af FUCAGP fundet hos patienter med dårlig prognose, men ikke hos patienter med god prognose. I den aktuelle undersøgelse blev niveauer af FUCAGP i serumprøver fra forskellige cancerpatienter analyseret og 17 patienter, herunder 13 som havde fået foretaget kemoterapi blev fulgt i flere år efter operationen. FUCAGP niveau bestemmes flittigt ved anvendelse af en massespektrometer blev fundet at ændre sammen med sygdomsprognose samt med reaktioner på behandlinger, navnlig til forskellige kemoterapier. Derfor FUCAGP niveauer, der måles under opfølgning af patienter efter operation syntes at være klinisk relevant biomarkør for behandling indgriben

Henvisning:. Yazawa S, Takahashi R, Yokobori T, Sano R, Mogi A, Saniabadi AR, et al. (2016) -fucosylerede Glykaner i α1-syre-glycoprotein for Overvågning behandlingsresultater og prognose af kræftpatienter. PLoS ONE 11 (6): e0156277. doi: 10,1371 /journal.pone.0156277

Redaktør: Pankaj K. Singh, University of Nebraska Medical Center, UNITED STATES

Modtaget: Marts 1, 2016 Accepteret: 11 maj 2016; Udgivet: 13 juni 2016

Copyright: © 2016 Yazawa et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er inden papiret

finansiering:.. forfatterne har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at ingen konkurrerende interesse eksisterer

Introduktion

forekomsten af ​​tumorassocieret ændring af glykanstrukturer i glycoproteiner og glycolipider udtrykkes på tumorcelleoverfladen, som fører til sekretion af sådanne molekyler med afvigende glycaner i plasmaet som tumor-associerede antigener er kendt [ ,,,0],1,2]. I mellemtiden har en række tumorassocierede, glycan-baserede antigener, der allerede blevet isoleret og valideret til fortrinsvis forudsige tilstedeværelsen af ​​tumorer hos patienter, og nogle har fundet klinisk anvendelse som tumormarkører, herunder carcinoembryonisk antigen (CEA) [3,4] , kulhydrat antigen 19-9 (CA 19-9) [5,6], α-fetoprotein (AFP) [7,8], cancerantigen 125 (CA125) [9,10], sialyl Lewis Xi (SLX-i) [11,12] og sialyl-Tn (STN) [13,14] antigener. Disse biomarkører afspejler fremskridt tidligere bestræbelser på at opdage ondartede svulster og følge deres prognose under behandling intervention. Men da de diagnostiske beføjelser disse markører ofte er begrænset af lav følsomhed og høj falske positive satser, er diagnosen blevet gennemført, i kombination med alternative biomarkører at fremskynde positive satser og nøjagtighed i praksis indstillinger. For eksempel i bugspytkirtelkræft, er en kombination assay af serum CEA, CA 19-9 og CA 242 kendt for at have forbedret specificitet og følsomhed af diagnose og prognose af bugspytkirtlen kræftpatienter [15]. er også blevet søgt Kombinerede anvendelser af multi tumormarkører i andre kræftpatienter [16-19]. synes imidlertid den kliniske værdi af tumorassocierede antigener i serumprøver, at være begrænset som tumormarkører i patienter med gastrisk og lungekræft, navnlig når et tidligere klinisk fase overvejes. Eftersom niveauet af sådanne antigener udskilles fra tumorer celler i plasmaet ikke er tilstrækkelige til at nå et positivt område [20,21], vi har været på udkig efter en egnet og pålidelig ny biomarkør.

Blandt glycosyl forbindelser fundet i glycan-baserede tumorassocierede antigener, α1,3fucosyl rester bundet til GlcNAc rester er en af ​​de mest almindelige strukturer, der er udtrykt i tumorceller med meget rigelige og afvigende eksistens i plasma og /eller serum som lex (Galβ1,4 [Fucα1,3 ] GlcNAc), sialyl Lex (NeuAcα2,3Galβ1,4 [Fucα1,3] GlcNAc), sialyl LeX-i (NeuAcα2,3Galβ1,4 [Fucα1,3] GlcNAcβ1,3Galβ1,4GlcNAc), poly Lex ((Galβ1,4 [ ,,,0],Fucα1,3] GlcNAc)

n) og LeY (Fucα1,2Galβ1,4 [Fucα1,3] GlcNAc) antigener [1, 22-24] (fig 1).

Et molekyle AGP besidder fem glycankæder herunder diantennary, triantennær og tetraantenne glykaner hhv. Alle muligheder er vist i parentes, og ‘*’. Den fælles kerne struktur består af [Man]

3 [GlcNAc]

2. * Gentagne

N

-acetyllactosamine struktur [(Galβ1,4GlcNAc)

n] vedlagt. Se detaljerne i tekst.

α

1-syre-glycoprotein (AGP) er en stor plasma glycoprotein med en molekylvægt på 41-43 kD og med stærkt forgrenede

N

-sammenkædede glycaner, som er syntetiseret i og secerneres fra leveren til plasma [25]. Den potentielle fysiologiske betydning af AGP er blevet undersøgt som et akut-fase-protein, og ikke kun kvantitative ændringer af molekylet, men også kvalitative ændring af sine glykanstrukturer er blevet undersøgt i forbindelse med inflammation, graviditet, østrogenbehandling, kræft, leversygdomme og autoimmune sygdomme som rheumatoid arthritis [25-32]. Strukturelle analyser af AGP glycaner har afsløret, at de består af fem kompleks form

N

-bundne glycankæder herunder diantennary, triantennær og tetraantenne glykaner, og sialyleringen sker på de fleste af de terminale Gal-rester i hver fire kæder. Den (sialyl) LeX determinant er til stede på lactosamin (Galβ1,4GlcNAc) strukturer i både tri- og tetraantenne glycaner og langstrakte tetraantenne dem med gentagne lactosamin strukturer som vist i fig 1 [25,33]. For nylig undersøgte vi AGP glycoformer i et stort antal serumprøver fra kræftpatienter samt raske kontrolpersoner ved hjælp af en krydset affinoimmunoeleoctrophoresis (CAIE) med Con A lektin,

Aleuria aurantia

lektin (AAL) og anti-AGP antistof [34]. Følgelig blev patienter med fremskreden malign sygdom, der havde AGP glycoformer indeholdende stærkt forgrenede og fucosylerede glycaner i lange perioder efter kirurgisk indgreb sig at have en dårlig prognose. I modsætning hertil blev patienter, som havde AGP glycoformer uden sådanne ændringer forventes at have en god prognose uanset deres kliniske faser. Desuden serum AGP niveauer i præoperative patienter var signifikant højt sammenlignet med niveauet hos raske kontroller. Der blev imidlertid ikke åbenlyse forskel ses mellem patienter med hensyn til serum AGP-niveauer og deres klinisk-patologiske funktioner, herunder deres prognose efter operation. Derudover er der i vores seneste undersøgelse [35], udviklede vi et nyt system til omfattende analyse af serum AGP glycaner ved hjælp af et massespektrometer og en hjemmelavet software (AGPAS) tillader meget hurtig bestemmelse af primære strukturer af AGP glycaner. Det var altså vist, at ændringer i AGP glycaner efter operation faktisk kunne bruges som en ny biomarkør for overvågning og forudsige patienternes prognose. Blev nemlig relative forekomst af fucosylerede tri- og tetraantenne glycaner i AGP molekyle (FUCAGP) fundet at være signifikant højere hos cancerpatienter i sammenligning med raske kontroller. Desuden blev stærkt forhøjede niveauer af FUCAGP findes specifikt i patienter med dårlig prognose, men ikke hos patienter med god prognose. Da AGP niveauer blev fundet at reagere på ændringer i kliniske hændelser, vi også fokuseret på serum AGP niveauer samt FUCAGP i de samme serumprøver fra 30 patienter med forskellige cancere. Blandt disse, 17 patienter, herunder 13 patienter, som gennemgik kemoterapi blev fulgt i en lang periode efter operation på grundlag af deres klinisk-patologisk tilstand.

Formålet med den aktuelle undersøgelse var at evaluere FUCAGP som en ny glycan-baserede biomarkør til at forudsige kliniske resultater sammen med patienternes respons på medicin herunder forskellige kemoterapi.

Materialer og metoder

Materialer

Blodprøver blev opnået fra patienter med forskellige typer af maligniteter (n = 30 ), som blev indlagt på Gunma Universitetshospital (Maebashi, Japan) sammen med retningslinje for informeret samtykke og godkendelse fra den etiske komité i Gunma University Graduate School of Medicine. Denne undersøgelse blev godkendt af den etiske komité i Gunma University Graduate School of Medicine, og skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle donorer. Alle kliniske stadier blev bestemt af TNM klassifikation af maligne tumorer [36]. De består af patienter med gastrisk (n = 9), colon (n = 8), lunge (n = 5), spiserør (n = 4), lever (n = 2), rektum (n = 1) og bugspytkirtel (n = 1) cancer (figur 2). Blandt dem, blev 17 patienter, herunder 13 dem, som gennemgik forskellige kemoterapier fulgt op under lange præ- og postoperative perioder og blev udforsket detaljeret som beskrevet nedenfor (tabel 1). Blodprøver blev også opnået fra frivillige, raske kontroller (n = 21). Serumprøver blev fremstillet i en flere timer efter blodtapning og blev opbevaret ved -80 ° C indtil anvendelse. HiTrap DEAE FF, HiTrap SP FF og HiTrap Afsaltning blev købt fra GE Healthcare (Amersham Place, UK). PNGase F var fra Roche Applied Science (Indianapolis, USA). BlotGlyco blev opnået fra Sumitomo Bakelite, Co. (Tokyo, Japan). Human AGP og 2,5-dihydroxybenzoesyre blev indkøbt fra Sigma (St. Louis, MO, USA). Trypsin, DTT og andre organiske midler til BlotGlyco blev opnået fra Wako Pure Chemical Co. (Tokyo, Japan). Anti-humant AGP kaninserum blev opnået fra DAKO (Carpinteria, CA, USA) og peroxidase-konjugeret anti-humant AGP var fra Abcam (Cambridge, UK). Tumorassocierede antigener i serumprøver målt i denne undersøgelse var CEA, cytokelatin 19 fragmenter (CYFRA), CA 19-9, neuron specifik enolase (NSE), pladecellecarcinom (SCC) og SLX-i. Niveauer af hvert antigen blev bestemt ved en ELISA under anvendelse af Cobas systemet (Roche for CEA, CYFRA, CA 19-9 og NSE), arkitekten systemet (Abbot for SCC) og ved en RIA (Otsuka for SLX-i) ved at følge fabrikantens instruktioner. Standard afskæringsværdier for hvert antigen blev sat til 5,0 ng /ml for CEA, 2.8ng /ml for CYFRA, 37 U /ml for CA 19-9, 12 ng /ml for NSE, 1.5ng /ml for SCC og 38 U /ml for SLX-i.

FUCAGP, relative forekomst af fucosylerede tri- og tetraantenne glycaner i AGP blev opnået fra MS-analyse. AGP-koncentrationer blev bestemt med en ELISA. † Et emne (patient N i figur 3) blev udelukket. Prøver opnået ved en (*) og to (◆) postoperative dage. #Patients Undergik neoadjuverende kemoterapi. Kliniske faser af hver patient blev vist i parentes. Lodret bjælke angiver cut-off niveau af FUCAGP sat i denne undersøgelse.

Bestemmelse af serum AGP niveauer

AGP niveauer i serumprøver blev målt ved en sandwich-ELISA ved hjælp anti-humant AGP-antistof og peberrodsperoxidase-konjugeret anti-humant AGP som tidligere beskrevet [34]. Resultater fra ELISA af AGP koncentrationer i raske kontrolgruppe viste, at afskæringsværdien var 807μg /ml [34].

Oprensning af serum AGP

AGP blev oprenset fra 0,5 ml serumprøver baseret på den tidligere metode [35] med en mindre ændring til hurtig og bekvem procedure rensning. Således er en nyudviklet enhed (AGP-prep-DOCK) bestående af direkte forbundet fem søjler, nemlig en HiTrap udblødning, en HiTrap DEAE FF, to HiTrap afsaltning og en HiTrap SP kolonner, blev oprettet. Det blev strømmet med et sæt af forskellige pufferopløsninger [35] ved hjælp af en programmeret pumpe lavpunkt trevejshanen forbundet med respektive kolonner. Ved at bruge AGP-prep-DOCK blev oprenset AGP opløsning opnået fra den endelige HiTrap SP-søjle inden for kort tid, og på samme renhed som beskrevet tidligere [35]. Det rensede AGP blev anvendt til fremstilling af mærket

N

-glycans efterfulgt af massespektrometrisk analyse.

Forberedelse og mærket

N

-glycans af AGP

N

-Glycans og mærket

N

-glycans af AGP blev fremstillet i overensstemmelse med protokollen af ​​glycosyleringen kit (BlotGlyco) med en mindre ændring som tidligere [35] beskrevet. Kort beskrevet blev prøverne fordøjet med trypsin og PNGase F, og den resulterende

N

-glycans blev mærket ved hjælp af BlotGlyco. Efter mærkning med aoWR reagens blev en nøjagtig ms af hver glycan ændret således: MW af mærkede glycan = [en nøjagtig ms] – [H

2O (18,0105)] + [aoWR (447,223)] + [CH

3 (14.0156) xn] + [H (1,0078)], hvor n angiver antallet af

N

-acetylneuraminic-rester.

massespektrometrisk analyse af

N

-glycans af AGP

en pi af prøven blev blandet med 1 pi af matricen opløsning (10 mg af 2,5-dihydroxybenzoesyre i en blanding af 300 pi acetonitril og 700μl destilleret vand). Så en pi af den blandede opløsning blev deponeret på en MALDI target plade (Ground stål BC, Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Tyskland) og fik lov til at tørre. Massespektrometriske data blev opnået under anvendelse af et MALDI-TOF /TOF ultrafleXtreme (Bruker) i reflektoren, positiv ion-mode typisk summen 20.000 skud. Alle spektre i massen vifte af m /z 1.000 til 5.000 blev opnået og deisotopic masser for hver top plukket blev eksporteret som en masse top liste med hver værdi af både det geometriske tyngdepunkt masse og det tilsvarende område til den hjemmelavede, drift software, AGPAS nylig udviklet [35].

Identifikation af

N

-glycans af AGP

Hver glycan molekyle blev forkortet ved hjælp af en fire-cifret nummer, der angiver antallet af galactose ( Gal),

N

-acetylglucosamine (GlcNAc), fucose (Fuc) og

N

-acetylneuraminic syre (NeuAc) rester bestående af hver glycan undtagen den fælles kerne struktur ([mannose (Man) ]

3 [GlcNAc]

2) (figur 1). Fire hundrede og halvtreds-tre teoretisk forudsagte glycaner og 154 denatureret glycaner maksimalt forudsagt til at blive givet ved mærkning proces blev udtrukket til at udgøre den database AGPAS [35]. Alle de primære strukturer af AGP glycaner blev derfor tildelt hurtigt, og desuden blev ikke blot den relative forekomst af hver glycan men også af fucosylerede tri- og tetraantenne glycaner (FUCAGP) samtidig beregnet ved hjælp af deres tilsvarende areal. Cut-off værdi på FUCAGP var vilkårligt sæt ved middel + standardafvigelse af raske kontrolpersoner (= 25,01) som beskrevet tidligere [35]. En bedre version med nogle forbedringer for tildeling af glykaner i AGPAS blev anvendt i denne undersøgelse, og den relative forekomst af glycaner totalt ramt var 76,18 ± 8,27% (n = 298).

Patienter og behandlinger

Serumprøver fra 30 patienter med forskellige maligniteter og i forskellige kliniske stadier ses i figur 2 blev opsamlet før og efter kirurgiske indgreb. Blandt disse blev 17 patienter med gastrisk, spiserør, lunge- og colon adenokarcinomer fulgt til lange postoperative dage (bælg). Standarden adjuverende kemoterapi og forskellige kemoterapier herunder neoadjuverende kemoterapi (primær systemisk kemoterapi, PSC) blev gennemført i 13 af de 17 patienter i henhold til deres individuelle regimer med op til den fjerde linje i behandling (tabel 1). Disse 17 patienter blev klassificeret i 5 undergrupper baseret på deres prognostiske form som følger. Patienter, der fik kemoterapi (Chemo /+) eller ingen kemoterapi (Chemo /-) behandling og døde med en kort overlevelse efter operation (Short overlevelse); patienter, der døde med en forlænget overlevelse efter gentagne behandlinger af kemoterapi (Long overlevelse); patienter, som gennemgik kemoterapi, reagerede godt og overlevede i follow-up perioden (Alive, Chemo /+); patienter, der overlevede uden kemoterapi behandling under opfølgningsperioden (Alive, Chemo /-).

Bestemmelse af en

FUT6

gen mangelfuld patient

Genomisk DNA blev ekstraheret fra perifere blodprøver ved standard phenol-chloroform ekstraktion metode.

FUT6

genlocus blev PCR-amplificeret med ty-1 og ty-2 primere [37]. Nucleotidsekvenser af PCR-produkterne blev bestemt ved en direkte sekvens ved hjælp af specifikke primere for målet.

Resultater

Niveauer af FUCAGP og AGP i serumprøver fra kræftpatienter og raske kontroller

N

-glycans af AGP i serumprøver fra præoperative patienter med forskellige maligniteter og i forskellige kliniske stadier (n = 30) og fra raske kontroller (n = 21) blev analyseret ved et massespektrometer. Ved hjælp af den AGPAS software, blev relative forekomst af hver glycan bestemmes samtidigt og derefter, relative forekomst af fucosylerede tri- og tetraantenne glycaner i AGP (FUCAGP) blev opnået (figur 2). Relativt lave niveauer af FUCAGP blev fundet i fire af de otte patienter, hvis prøver blev opnået ved én dag efter operationen (POD). Endvidere en af ​​de to patienter (patient E i tabel 1), der gennemgik neoadjuverende kemoterapi (OSP) viste det laveste niveau af FUCAGP (18,17%). Men niveauer af FUCAGP i kræftpatienter var stadig betydeligt høje sammenlignet med raske kontroller (middelværdi ± standardafvigelse .: 32,25 ± 6,89 vs. 20,70 ± 6,61;

P

0,05). Niveauer af serum AGP koncentration i de samme prøver blev også sammenlignet i både patienter og raske kontrolpersoner, og signifikante forhøjede niveauer blev fundet i patienter (gennemsnit ± SD 2507,33 ± 1093,14 vs. 1119,75 ± 456,65;.

P

3313 (a), 3312 (b), 4413 (c), 4414 (d), 4424 (e), 4412 (f), 4423 (g) og 3323 (h). Se detaljerne i tekst.

Diskussion

Proteiner ændres hyppigt posttranslationelt og mere end halvdelen af ​​alle proteiner i naturen er glycosylerede [39] resulterer i at være til stede som glycoproteiner med kovalent bundet glycaner med meget heterogene og forskelligartede strukturer. Det må derfor være plausibelt, at disse glycaner har betydelige konsekvenser og ansvar for opbygning og funktion af sådanne glycoproteiner. Det er blevet almindeligt anerkendt, at glykaner spiller vigtige roller i ikke kun protein foldning og clearance, men også celle til celle interaktion, genkendelse og binding selv [40-42] sammen med hyppige forekomster af ændringer i glycaner.