PLoS ONE: Wnt /β-Catenin Signaling Forbedrer cyclooxygenase-2 (COX2) transkriptionsaktivitet i Gastric Cancer Cells

Abstrakt

Baggrund

Øget ekspression af cyclooxygenase-2-enzymet (COX2) er en af ​​de vigtigste karakteristika ved mavekræft (GC), som er en førende dødsårsag i verden, især i Asien og Sydamerika. Selvom Wnt /β-catenin signalvejen har været involveret i den transkriptionelle aktivering af COX2 genet, den præcise mekanisme modulerende dette svar er stadig ukendt.

Metodologi /vigtigste resultater

Her er vi studerede den transkriptionelle regulering af COX2 genet i GC cellelinier og vurderes, om dette fænomen moduleres af Wnt /β-catenin signalering. Vi først undersøgt ekspressionen af ​​COX2 mRNA i GC celler og fundet, at der er en differentieret udtryk mønster i overensstemmelse med et højt nukleart-lokaliserede β-catenin. Farmakologisk behandling med enten lithium eller valproinsyre og molekylær induktion med oprenset kanoniske Wnt3a signifikant forøget COX2 mRNA-ekspression i en dosis- og tidsafhængig måde. Serial deletion af en 1,6 Kbp COX2 promotorfragmentet og GAIN- eller tab-af-funktion eksperimenter tilladt os at identificere en minimal Wnt /β-catenin responsiv region bestående af 0,8 Kbp af COX2 promotoren (pCOX2-0.8), som viste maksimale respons i gen-reporter assays. Aktiviteten af ​​denne pCOX2-0.8 promotor region blev yderligere bekræftet ved site-directed mutagenese og DNA-protein bindingsanalyser.

Konklusioner /Betydning

Vi konkluderer, at pCOX2-0.8 minimal promotor indeholder en hidtil ukendte funktionelle T-celle faktor /lymfoid enhancer faktor (TCF /LEF) -svar element (TBE sted II; -689 /-684), der reagerer direkte til forbedret Wnt /β-catenin signalering og som kan være vigtige for indtræden /progression GC

Henvisning:. Nuñez F, Bravo S, Cruzat F, Montecino M, De Ferrari GV (2011) Wnt /β-Catenin Signaling Forbedrer cyclooxygenase-2 (COX2) transkriptionsaktivitet i Gastric Cancer Cells. PLoS ONE 6 (4): e18562. doi: 10,1371 /journal.pone.0018562

Redaktør: Moray Campbell, Roswell Park Cancer Institute, USA

Modtaget: 5. november 2010; Accepteret: 11. marts 2011; Udgivet: April 6, 2011

Copyright: © 2011 Nuñez et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af CTI-cancer, Programa Bicentenario en Ciencia y Tecnología (PBCT) – Comisión Nacional de Investigación Científica y Tecnológica (CONICYT) tilskud nummer PBCT-6 fra den chilenske regering (MM og GVD). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

mavekræft (GC) er en multifaktoriel sygdom, præget af meget maligne neoplasmer i maveslimhinden, og repræsenterer den næststørste årsag til kræft død over hele verden med den højeste udbredelse i Asien og Sydamerika [1], [ ,,,0],2], [3]. Miljømæssige associerede risikofaktorer omfatter kost, snus forbrug, fedme og

Helicobacter pylori

infektion [4]. Adskillige mutationer i tumorsuppressorgener, herunder P53, adenomatøs polypose coli (APC), E-cadherin og RUNX3 [3], [5], samt i onkogener såsom K-RAS, HER2 og β-catenin [3], [6], [7], er blevet dokumenteret i GC. Desuden overekspression af forskellige gener er dokumenteret, herunder WNT2B [8], TC1 (C8orf4) [9], og cyclooxygenase 2 (COX2) enzym, som katalyserer afgørende skridt i produktionen af ​​prostaglandin E2, en vigtig mediator af ledinflammation [10], [11].

det er blevet observeret, at ekspressionen af ​​COX2 genet øges signifikant i humane gastrisk adenocarcinom væv, sammenlignet med parrede gastriske mucosale prøver blottet af cancerceller [10 ]. Sådan forøget ekspression er blevet foreslået at påvirke intensiteten af ​​invasion, størrelse, lymfeknudemetastaser, tumorudvikling og dårlig prognose [4], [12], [13]. I denne henseende store mængder data beskriver kemo-forebyggende og anticancer aktivitet af ikke-steroide anti-inflammatoriske lægemidler (NSAID), herunder selektive COX2 hæmmere som potentielle behandlinger for GC [10], [11], [14].

transkriptionel kontrol af COX2 genet afhænger af den molekylære maskineri interagere med COX2 promotoren, som synes at blive styret gennem aktiviteten af ​​forskellige signalveje [15], [16], [17]. Faktisk blev det i første omgang fastslået, at CRE (-59 /-53), NF-IL6 (-132 /-124) og NF-KB (-233 /-214) konsensus sekvenser i COX2 promotor var nødvendige for ekspression af gen [16]. Efterfølgende funktionelle undersøgelser i COX2 promoteren identificeret en række regulatoriske elementer, der deltager i transskription af genet, herunder AP-1, AP-2, Sp-1, C /EBPβ [18], [19], [20] og proteiner tilhører T-Cell faktor /Lymfoid enhancer faktor (TCF /LEF) familien af ​​transkriptionsfaktorer, som er afgørende for Wnt /β-catenin signaltransduktion [21].

Wnt /β-catenin signalvej er bredt anerkendt som spiller en stor rolle i human sygdom, især i starten og udviklingen af ​​kræft [22], [23], [24]. Interessant nok har nylige eksperimenter i GC afledte celler vist forholdet mellem COX2 ekspression og inhibering af glycogensyntasekinase-3β (GSK3p) enzym [25], som er en vigtig Wnt komponent, der phosphorylerer β-catenin og fremmer den efterfølgende nedbrydning via proteasomet [26]. Forholdet mellem Wnt /β-catenin og COX2 udtryk i forskellige cancer celle modeller understøttes yderligere af følgende undersøgelser. For det første er det blevet observeret i brystepiteliet at Wnt /β-catenin spiller en indirekte virkning på COX2 transkription, som kan være medieret af opregulering af et formidlende faktor PEA3 [27]. For det andet, og i modsætning til en indirekte virkningsmekanisme, Araki og cols. [21] rapporterede, at i colon cancerceller der er en induktion i COX2-ekspression gennem en β-catenin /TCF afhængig mekanisme, og delvist karakteriseret en konsensus TCF /LEF-bindingssted (TBE: core CTTTG) placeret 1.079 bp opstrøms fra transkriptionsstart site i COX2 promotor. For det tredje blev det observeret, at i kolon kræftpatienter og afledte cellelinjer der er en sammenhæng mellem overekspression af Wnt pathway-associerede proteiner LEF-1 og Pontin52 /TIP49a og opregulering af COX2 udtryk [28]. Endelig hjælp chondrocytter, er det blevet påvist, at LEF-1, sammen med β-catenin, reguleret COX2-ekspression ved direkte binding af LEF-1 /β-catenin-komplekset til 3’UTR region af COX2 genomiske locus [29] . Derfor er der i øjeblikket ikke et klart billede af, om Wnt-signalering er involveret i COX2 genekspression, eller som dets rolle i GC indtræden /progression. Her søgte vi at forstå, hvorvidt der er en direkte regulering af COX2 genekspression via Wnt /β-catenin signalering og identificere Wnt /β-catenin regulatoriske elementer i promotorregionen af ​​COX2 gen, som kan opregulere COX2 transkription i GC-celler.

Materialer og metoder

Celler og dyrkningsbetingelser

Humane cellelinier MKN45 (japansk Indsamling af Research Bioressourcer, Japan), N87, SNU1, SNU16, KATOIII, AGS, WI38 og HEK293 (American Type Culture Collection, Rockville, MD) blev anvendt i denne undersøgelse. MKN45, N87, SNU1 og KATOIII celler blev dyrket i RMPI medie (Gibco); AGS i F12K-medium (Hyclone); WI38 i EMEM (Gibco); og HEK293 i DMEM (Gibco). Dyrkningsmedier blev suppleret med 10% FBS (Gibco) (AGS med 20%) og 1% penicillin /streptomycin. Cell-linjer blev holdt ved 37 ° C i 5% CO

2 og mættet fugtighed.

plasmider og mutagenese

SuperTOPFlash-luciferase og pRL-TK renilla- luciferase plasmider [30], den konstitutive aktive β-catenin (S33Y) [31], og de dominerende negative ΔTCF4 ekspressionsplasmider [32] er blevet beskrevet tidligere. Kimære COX2-promotor-luciferase-fragmenter blev frembragt ved PCR fra humant genomisk DNA under anvendelse af specifikke primere indeholdende restriktionssteder og efterfølgende indsat i pGL3-Basic Vector (Promega). Mutationerne i TBE-II-stedet (-689 /-684) af COX2 promotoren blev genereret under anvendelse af primere pCOX-0,8-TBEMUT med QuickChange site-directed mutagesis kit (Stratagene). Konstruktioner blev verificeret gennem direkte sekventering (ABI-3130 Genetic Analyzer, Applied Biosystems). Primere sekvenser er beskrevet i tabel S1.

Semikvantitativ og Real Time RT-PCR

Totalt RNA blev ekstraheret i RNase-frit betingelser under anvendelse TRIZOL (Invitrogen) og 2 ug af RNA blev revers transkriberet med 200 U of SuperScript II revers transkriptase (RT) (Invitrogen) ved anvendelse af 500 ng oligo (dT) primere. Eksperimentel bestemmelse af COX2, c-myc og CCND1 mRNA niveauer blev udført ifølge [33]. Kort fortalt blev cDNA’er underkastet Real-Time PCR i en iCycler iQ System (Bio-Rad Laboratories). Hver 25 gl reaktionsvolumen indeholdt 1 enhed af Platinum Taq DNA-polymerase (Invitrogen), 1X reaktionspuffer (20 mM Tris-HCI pH 8,4, og 50 mM KCI), 1,5 mM MgC

2, 2,5 ug BSA, 0,01% glycerol , 200 uM dNTP’er, 0.3X SYBR Green opløsning og 0,4 pM af specifikke primere (se tabel S1). PCR-betingelser blev fastsat som følger: 90 sekunder ved 94 ° C og derefter 30 cykler af 30 sekunder ved 94 ° C, 30 sekunder ved 62 ° C og 30 sekunder ved 72 ° C. Alle reaktioner blev udført i tre eksemplarer og resultaterne opnået for hvert gen blev normaliseret til de, der opnås sideløbende med β-actin. Kvaliteten af ​​RNA og PCR-produkter blev overvåget gennem hele eksperimenterne via elektroforese på 1% agarosegeler, farvet med ethidiumbromid.

Induktion af Wnt /β-catenin signalvejen

Wnt signalering var farmakologisk induceret i MKN45 celler podet i 6 brønds dyrkningsplader ved 80-90% konfluens (dvs. 1, 2, 4 og 8 timers inkubation) enten med 10-20 mM LiCI (Sigma) eller 5-10 mM af valproinsyre (VA; Sigma) som tidligere beskrevet [34], [35]. Derefter blev cellerne opsamlet til mRNA-ekstraktion og realtid-PCR bestemmelse som beskrevet ovenfor. Tilsvarende blev MKN45 celler stimuleret i 2 timer med 200 og 400 ng /ml oprenset Wnt3a-protein. Oprensning af Wnt3a blev udført som beskrevet [36].

transkriptionsaktivitet af COX2 promotoren

Aktivitet af COX2 promotoren blev målt i 80-90% konfluent MKN45, AGS, WI38 og HEK293 celler podet i 6 brønds kulturplader. Kort fortalt blev celler co-transficeret under anvendelse Fugene (Roche) i 24 med pCOX2-luciferase eller pSuperTOPFlash reportere og enten konstitutiv aktiv β-catenin (S33Y) [31] eller dominant negative ΔTCF4 [32] konstrukter. PRL-TK Renilla luciferase plasmid blev anvendt som en intern kontrol. Firefly og renilla luciferaseaktiviteterne blev bestemt ved hjælp af den dobbelt-Luciferase Reporter Assay (Promega) i en Victor-3 multiplate læser instrument (Perkin Elmer), som tidligere [30] beskrevet. Relative luciferaseaktiviteter blev udtrykt ved at dividere ildflueluciferase aktivitet med renilla luciferaseaktiviteten for hver prøve (N = 3, hver i tre eksemplarer).

Chromatin immunopræcipitation (chip) analyser

chip blev udført i MKN45 celler som beskrevet tidligere [37]. Fraktionen af ​​nukleare β-catenin bundet enten til TBE websteder I, II, III eller IV i den humane COX2 promotoren blev immunfældet med anti β-catenin antistoffer (Santa Cruz) og vurderet af realtid-PCR under anvendelse af specifikke primere (Tabel S1) . Derudover den del af den RNA-polymerase II (Pol-II) og acetylerede histoner H3 og H4 (H3ac og H4ac) bundet enten til TBE-II-regionen (-793 /-594) eller det proximale område (-118 /+ 62 ) af COX2 promotoren blev ligeledes vurderet (anti-Pol-II, Santa Cruz, H3ac og H4ac, Upstate). Som en positiv kontrol anvendte vi c-myc TBE site [38]. Antistofspecificitet blev analyseret med normalt kanin-IgG (Santa Cruz).

Elektroforetisk mobilitet (EMSA)

EMSA blev udført ved anvendelse af oligonukleotider indeholdende enten vildtype COX2 TBE-II-konsensussekvens (se tabel S1) eller tidligere rapporterede mutante TBE-sekvenser [39]. Kort fortalt, vildtype og muterede

32P-mærkede oligonukleotider blev inkuberet i bindingsbuffer med nukleare ekstrakter af MKN-45-celler i 30 minutter ved 30 ° C. Efterfølgende blev DNA-proteinkomplekser adskilles fra frie oligonukleotider på en 5% ikke denaturerende polyacrylamidgel. Efter elektroforese blev gelen tørret og eksponeret for film i 1 dag. Visualisering af radioaktive bånd blev analyseret ved autoradiografi. Bindingsspecificiteten blev kontrolleret ved at inkubere DNA-proteinkomplekser i nærvær af et overskud af ikke-mærket vildtype- eller muterede oligonukleotider [21], [39].

Statistisk analyse

Hver forsøg blev gentaget mindst tre gange med tre gentagelser. Data er vist som middelværdi ± SD. Multiple gruppe sammenligninger blev udført ved envejs ANOVA under anvendelse af Statistica 9.0 software.

P

. 0,05 blev betragtet som signifikant

Resultater

COX2 udtryk korrelerer med nukleare β-catenin-niveauer i GC celler

Vi oprindeligt fastlagt udtrykket niveauer af COX2 mRNA i human GC cellelinier MKN45, N87, SNU1, SNU16, KATOIII og AGS [40], [41], [42], samt WI38 fibroblaster anvendes her som en kontrol cellelinie [43], undersøger om de blev korreleret med Wnt /β-catenin signalering. Som afbildet i figur 1, var stærke niveauer af COX2 ekspression observeret så tidligt som 26 cykler PCR-amplifikation i metastatiske cellelinier MKN45, SNU16 og KATOIII, og også i AGS cellelinie, som er afledt fra en primær tumor. Dette resultat er i overensstemmelse med COX2 ekspressionsniveauerne tidligere påvist i MKN45, KATOIII og AGS celler [44], [45], [46]. I modsætning hertil COX2 mRNA-niveauer var enten meget lav i WI38 fibroblaster eller uopdaget i N87 og SNU1 celler (figur 1A), hvilket antyder, at denne forskel ekspressionsmønster ikke er forbundet med metastatiske stadier eller niveauet af celletransformation. Bemærkelsesværdigt blev nuklear β-catenin-niveauer tæt forbundet med COX2-ekspression, da blev observeret høje niveauer af proteinet i MKN45, AGS, SNU16 og KATOIII celler, sammenlignet med N87, SNU1 og WI38- celler (Figur 1B), hvilket indebærer en rolle for Wnt signalering i COX2 mRNA-ekspression i GC celler.

(A) COX2 mRNA-ekspression i kontrol (WI38) og GC cellelinier (MKN45, AGS, SNU1, SNU16, KATOIII og N87). Totalt RNA blev ekstraheret fra dyrkede celler og semikvantitativ RT-PCR blev anvendt til bestemmelse COX2 og p-actin RNA-niveauer som en intern kontrol. Seksogtyve cykler blev valgt som et passende PCR-cyklus. (B) Nukleare niveauer af β-catenin-protein i den samme celle-linjer, som vist i (A), blev undersøgt gennem Western Blot-analyse under anvendelse af kerneekstrakter. Den TFIIB generelle transskription faktor blev anvendt som en intern kontrol.

Styrkelse af COX2 udtryk via Wnt /β-catenin signalering

For at undersøge, om Wnt kaskade er involveret i COX2 udtryk, MKN45 celler blev farmakologisk stimuleret for forskellige tidsperioder (dvs. 1, 2, 4 og 8 h) med enten lithium (LiCl) eller valproat (VA), da begge lægemidler er tidligere blevet vist at modulere Wnt signalering via hæmning af GSK3p aktivitet og dermed øge nukleare niveauer af β-catenin [34], [35]. Interessant, observerede vi en markant forøgelse af COX2-ekspression induceret af 10-20 mM LiCI eller 5-10 mM VA, der begyndte kort efter inkubering med forbindelserne og som toppede efter to timers behandling (figur 2A). Tidstro bestemmelse af COX2 mRNA-niveauer i MKN45 celler behandlet på lignende måde med LiCI eller VA (2 h) indikerede, at COX2 var signifikant opreguleret (Figur 2B), og at denne virkning blev parallel med den ene observeret på Wnt /β-catenin-målgener c-myc [47] og cyclin D1 [48]. Dernæst for at udelukke muligheden for, at det observerede fænomen afspejlede ikke-specifikke effekter af lægemidler, der virker på proteiner, der påvirker forskellige signalsystemer kaskader, vi påføres direkte en fuldt funktionel renset Wnt3a protein til MKN45 celler (se metoder). Disse forsøg viste klart, at 200-400 ng /ml oprenset Wnt3a signifikant forøget COX2 mRNA ekspression efter korte perioder med inkubation (figur 2), delvist forklare den hurtige virkning af LiCI og VA og støtte en direkte sammenhæng mellem kanoniske Wnt /β-catenin aktivering og stimulering af COX-2-transkription i GC-celler.

(A) COX2 mRNA ekspressionsniveauer i MKN45 celler behandlet i 1 til 8 timer med enten 10-20 mM af lithium (LiCI) eller 5-10 mm af valproinsyre (VA) blev evalueret via RT-PCR. Som en indre kontrol blev p-actin niveauer bestemmes. (B) Q-PCR for COX2, c-myc og CCND1 mRNA-ekspression stimuleres farmakologisk med lithium (LiCI) og valproat (VA) i løbet af 2 h (øverste panel). Bundplade, Q-PCR for COX2 i MKN45 celler stimuleret med renset Wnt3a i 2 timer. Q-PCR-resultater blev udtrykt som relative mængde (DRN) og p-actin mRNA-niveauer blev anvendt som den indre kontrol. Hvert tal svarer til mindst 3 uafhængige forsøg. Statistisk signifikans blev bestemt ved ANOVA test (* p 0,05, ** p 0,01)

Identifikation af nye TBE sites i promotoren af ​​COX2 genet

Tidligere studier indikeret. at en Wnt /β-catenin responsiv TBE websted (konsensus kerne: CTTTG) er placeret ved -1079 /-1074 bp opstrøms fra det transkriptionelle startsted (TSS) af det humane COX2 genet [21] (sted IV, figur 3A, se også fig S1). Yderligere scanning af 1600 bp opstrøms sekvens fra TSS [49] tilladt os at identificere 3 nye formodede TBE sites: -877 /-872 bp (site III sense orientering), -689 /-684 bp og -318 /-313 bp (websteder II og i, fig både i antisense-orientering) (figur 3A), som ikke er konserveret mellem det humane og murine COX2 generne (figur S1). Vi klonede derfor 1.600 bp segment fra det humane COX2 promotor (pCOX2), inklusive alle fire TBE sites, ind i pGL3-basisk vektor fusioneret til luciferasegenet, der skal anvendes efterfølgende i reporter assays (figur 3A). Bemærkelsesværdigt, parallel transfektion af 10 ng af denne konstruktion i MKN-45 og HEK293-celler afslørede, at pCOX2 viste en signifikant højere (9 gange) basal promotoraktivitet i MKN45 celler (figur 3B og C). Vi antager, at denne højere pCOX2 basal promotoraktivitet kunne relateres til det forhøjede indhold af nuklear β-catenin i denne GC cellelinje (figur 1B). Derfor MKN45 og HEK293-celler blev co-transficeret med pCOX2 i nærværelse af lavere doser af en konstitutiv aktiv β-catenin-protein (S33Y) [31]. Som observeret i figur 3, blev pCOX2 aktivitet faktisk forøget i begge celletyper, hvilket antyder, at β-catenin kan binde og derefter aktivere TCF /LEF transkriptionsfaktorer på de funktionelle TBE sites inden for pCOX2 promotoren.

(A) skematisk tegning, der viser den genomiske sammenhæng med ca. 1.6 Kbp fra det transkriptionelle startsted (TSS) af den humane COX2 promotoren, herunder placeringen af ​​kendte transkriptionelle regulatorer (hvide bokse) og positionen af ​​de tre hidtil ukendte TCF /LEF-bindende elementer (TBE: core CTTTG; sorte bokse) bestemt

i silico

. (B 0,05, ** p 0,01). Nukleare niveauer af β-catenin-protein blev undersøgt i samme cellelinier gennem Western blot-analyse (højre panel). Den TFIIB generelle transskription faktor blev anvendt som en intern kontrol.

Bidrag af TBE websteder til COX2 promoter aktivitet i GC celler

For at dissekere bidrag Wnt /β-catenin responsiv TBE steder på den transskriptionelle aktivitet af COX2 promotor fire pCOX2 deletioner konstruktioner blev genereret: pCOX-1,2 (-1123 /+ 35 bp); pCOX-0,8 (-741 /+ 35 bp); pCOX-0,65 (-582 /+ 35 bp); og pCOX-0,4 (-371 /+ 35 bp) (figur 4A). Disse konstruktioner blev efterfølgende analyseret for deres aktivitet gennem transiente transfektioner i MKN45 og AGS-celler, ved hjælp af WI38- fibroblaster som en kontrol cellelinie. I overensstemmelse med de endogene COX2 ekspressionsniveauer i disse GC cellelinjer (figur 1A), pCOX2 deletioner bibeholdt forskellige niveauer af aktivitet i MKN45 og AGS celler (figur 4B og C). I modsætning hertil blev der ikke promotoraktivitet påvises i WI38 fibroblaster (figur 4D), selv når transfektions- doser i disse celler blev forhøjet 8 gange (dvs. fra 50 til 400 ng) (figur S2). Vigtigt er det, og efter aftale med tidligere rapporter [50], WI38 celler effektivt udtrykt luciferase-reporter konstruktion, der indeholder promotoren for p21 genet (figur S2), hvilket indikerer, at den molekylære maskiner er ansvarlig for at fremkalde COX2 transskription i disse kontrol celler ikke er aktiv . Yderligere forsøg viste, at transfektion i MKN45 og AGS celler med pCOX2-0.8 konstrukt, som har 859 bp deleteret fra 1,6 Kb pCOX2 reporter (figur 4A), resulterede i en signifikant stigning i promotoraktivitet sammenlignet med pCOX2-1.2 reporter (Figur 4A-C). Som sås ingen signifikante forskelle mellem 1,6 Kb pCOX2 og pCOX2-1.2 konstruktioner (figur S3), har vi ikke foretaget yderligere analyser med større konstruktion. Vigtigt er, pCOX2-0.8 repræsenteret minimumsstørrelsen promotorfragmentet udviser den maksimale basale aktivitet, eftersom yderligere deletion af enten 159 eller 370 bp fra 5′-enden, som det er tilfældet med den pCOX2-0.65 eller pCOX2-0.4 konstruktioner, henholdsvis , faldt mere end 2 gange niveauerne af pCOX2 basale aktivitet. Disse resultater indikerer, at området på mellem 0,8 og 0,65 Kbp opstrøms for TSS af COX2 genet, og som indeholder et nyt TBE respons element (TBE site II -689 /-684), kan være et centralt element i reguleringen af det basale niveau af COX2 genekspression i GC-celler.

(A) Skematisk repræsentation af pCOX2 deletioner. (B-D), Gene reporter assay i MKN45 (B), AGS (C) og WI38 (D) cellelinier transient transficeret med 50 ng pCOX deletioner (pCOX2-1.2; pCOX2-0.8; pCOX2-0.65 og pCOX2-0.4) og 50 ng af tom vektor. I alle eksperimenter blev celler transficeret med 1 ng PRL-SV40 Renilla som en intern kontrol. Promotoraktivitet blev normaliseret som forholdet mellem ildflueluciferase og Renilla luciferaseenheder. RLU: Relative luciferaseenheder. Hvert tal svarer til mindst tre uafhængige forsøg. Statistisk signifikans blev bestemt ved ANOVA test (* p 0,05, ** p 0,01)

opregulering af pCOX2-0.8 via Wnt /β-catenin signalering

Vi næste undersøgt. virkningen af ​​Wnt /β-catenin signalering på det hidtil ukendte TBE sted II. Vi transficerede MKN45 celler med pCOX2-0.8 reporterkonstruktionen og co-udtrykkes den konstitutive aktive β-catenin S33Y protein observere, at der var en signifikant (2 gange) forøgelse af den transskriptionelle aktivitet af pCOX2-0.8. Denne β-catenin-medieret stigning var specifik, da den pCOX2-0.4 konstruktionen ikke blev stimuleret i denne β-catenin overekspression tilstand (figur 5A og B). For at kontrollere for Wnt /β-catenin signalering i MKN45 celler anvendte vi Wnt /β-catenin responsiv SuperTOPFLASH (STF) reporter bærer 12 kopier af en TBE i tandem [32], som blev transfekteret alene eller i nærvær af plasmidet kodende for mutanten β-catenin S33Y protein. Interessant, mens co-ekspression med den mutante β-catenin S33Y protein i MKN45 celler var i stand til at forbedre (1,9 gange) aktiviteten af ​​STF reporter, høje niveauer af basal STF-aktivitet blev detekteret i fravær af den mutante β-catenin (figur 5C). Dette resultat er i overensstemmelse med vores tidligere fund af høje niveauer af endogen nukleare β-catenin i denne celle-type (se figur 1B), og bekræfter, at dette nukleare faktor er funktionel. For yderligere at bekræfte dette fund, udførte vi identiske eksperimenter i HEK293-celler og opnåede det væsentlige lignende resultater men i dette tilfælde opnåedes en klar dosis-respons-kurve, når pCOX2-0.8 blev transficeret i nærvær af stigende koncentrationer af den konstitutivt aktive β-catenin S33Y protein (Figur S4). Derudover fandt vi, at STF aktivitet i HEK293 celler var meget lydhøre over for niveauerne af den exogene mutant β-catenin (figur S4C).

Gene reporter analyser i MKN45 celler forbigående transficeret med enten 10 ng pCOX2-0.8 ( A) eller pCOX2-0.4 (B), plus 5-10 ng β-catenin S33Y og 10 ng af tom vektor som kontrol. (C) SuperTOPFlash (STF; 10 ng) blev co-transficeret med 10 ng af β-catenin S33Y som en positiv kontrol for Wnt /β-catenin signaleringsaktivitet. (D) Effekt af en dominerende negativ TCF-4 (ΔTCF) konstruere på aktiviteten af ​​pCOX2-0.8. MKN45 celler blev forbigående co-transficeret med 50 ng pCOX2-0.8 og 20-50 ng ΔTCF. (E) Sammenligning mellem aktiviteten af ​​vildtype pCOX2-0.8 og en mutant MpCOX2-0.8 konstrukt, der indeholder muterede rester i TBE sted II i pCOX2-0.8 promotoren som baggrund. Celler blev transficeret med stigende koncentrationer af pCOX2-0.8, MpCOX-08, eller lige store mængder af tom vektor som en kontrol. I alle forsøgene 1 ng PRL-SV40 Renilla blev transficeret som en intern kontrol. Promotoraktivitet blev normaliseret som forholdet mellem ildflueluciferase og Renilla luciferaseenheder. RLU: Relative luciferaseenheder. Hvert tal svarer til mindst tre uafhængige forsøg. Statistisk signifikans blev bestemt ved ANOVA test (* p 0,05, ** p 0,01)

For yderligere at undersøge virkningerne af Wnt /β-catenin vej på aktiviteten af ​​pCOX2-0.8. vi udført tab-af-funktion eksperimenter med en dominant negativ TCF4 (ΔTCF)-konstruktionen, der koder for en transkriptionsfaktor mangler 30 rester fra sin aminoterminal, og det er ikke i stand til at binde β-catenin [32]. Vi fandt, at i MKN45 celler ΔTCF ekspression reduceret de høje niveauer af pCOX2-0.8 basal transkription i en dosisafhængig måde (figur 5D). Dette resultat bekræfter den centrale rolle, TCF /LEF transkriptionsfaktorer blandt regulatorer af aktiviteten af ​​pCOX2-0.8 promotorsekvensen, og yderligere støtter ideen om, at TBE-stedet II (-689 /-684) er involveret i respons på Wnt /β-catenin signalering.

Endelig til direkte fat rolle TBE sted II i Wnt /β-catenin-medieret regulering af COX2 promotoren, indførte vi ved site-directed mutagenese en ændring i 2 nøgle nukleotider af konsensus sekvensen af ​​TBE site II kerne (dvs. pCOX2-0.8: CTTTG; MpCOX2-0.8: CCTCG). Disse ændringer har vist tidligere at afskaffe Wnt /β-catenin-medieret transkription [39]. Med transient transfektion undersøgelser viste, at mutation af TBE sted II faldt betydeligt (2-3 gange) den basale aktivitet af pCOX2-0.8 konstruktion i MKN45 celler (figur 5e) sammenlignet med vildtype-pCOX2-0.8 promotorkonstruktionen. Desuden og efter aftale til vores tidligere resultater, mutation af dette TBE websted II næsten fuldstændigt blokeret β-catenin-medieret forstærkning af pCOX2-0.8 konstruktion (figur S4). Taget sammen indikerer disse resultater, at TBE sted II (-689 /-684) er en funktionel komponent i COX2 genet transkriptionel regulering.

β-catenin binder til COX2 genpromotorregion indeholdende TBE sted II

Fordi en transkriptionelt aktiv konformation af kromatinstrukturen reflekteres af et forhøjet niveau af histonacetylering [51], vi udfældet tværbundne kromatin-fragmenter (gennemsnitlig størrelse 300-500 bp) isoleret fra MKN45 celler ved anvendelse af polyklonale antistoffer specifikke for acetylerede histoner H3 og H4. Ligeledes har vi registreret binding af RNA-polymerase II (Pol II) som en parameter der normalt forbindes med transkriptionsaktivitet. Vi undersøgte berigelse i vore præcipitater af to promotorsekvenser: den proksimale promotor (PP) region (-118 /+ 62 fra TSS) og det distale område (-793 /-594) af COX2 promotoren indeholdende konsensus TBE sted II ( -689 /-684). Navnlig blev TBE sted II målrettet siden tidligere forsøg indikerede præferentiel binding af β-catenin til denne promotor region (figur S5). Som en positiv kontrol, vi evalueret bindende på TBE-stedet i promotoren af ​​c-myc-gen (-1447 /-1144 fra TSS), som tidligere var beskrevet i colon cancerceller [38].

Acetyleret histoner H3 og H4 og polymerase II-enzymet blev fundet at binde i den proximale promotorregion (figur 6A), hvilket indikerer, at chromatinstruktur omkring COX2 promotoren i MKN45 celler er i en åben konformation, således i overensstemmelse med vores tidligere resultater som viser, at den COX2 genet er aktivt omskriver. Navnlig blev β-catenin-protein immunpræcipiteret fra MKN45 prøver meste i forbindelse med promotorregionen spænder over -684 /-689 TBE-sekvensen i COX2 genet (figur 6B). Denne faktor var næsten upåviselig ved den proximale promotorregion, hvilket indikerer, at endogent nukleare β-catenin primært rekrutteres til TBE sted II i disse GC celler. Som forventet blev endogene β-catenin tilsvarende bundet til c-myc promotor TBE site, på niveauer, der er sammenlignelige med dem, der observeres i COX2 genpromotoren (figur 6C).

(A-C) chip assays i MKN45 celler ved anvendelse af specifikke antistoffer for β-catenin (β-cat), polymerase II (Pol), H3 og H4 acetyleret histoner (H3ac; H4ac) og immunoglobulin G (IgG). Kvantificering blev udført ved real time PCR under anvendelse af specifikke primere for den proksimale promotor (PP) region (A), TBE sted II (-689 /-684) i den humane COX2 promotor (B) og en TBE sted inden i c-myc promotor, som en positiv kontrol (C). (D) EMSA assay i kerneekstrakter fra MKN45 celler. DNA-protein-komplekser dannet ved inkubering kerneekstrakter (N.E.) fra MKN45 celler med radiomærkede prober indeholdende den intakte og et muteret TBE sted II (bane 3 og 5) blev løst i native polyacrylamidgeler med 5% og åbenbaret gennem autoradiografi. For at bestemme specificiteten af ​​bindingen en 50 gange overskud af ikke-radioaktivt mærket vildtype (linje 4) og mutant (6 og 7) oligonucleotider blev tilsat. Bane 1 og 2 svarer til vildtype og mutant radiomærkede oligonukleotider uden inkubering med N.E. Disse tests er repræsentative for tre uafhængige forsøg.