PLoS ONE: Molekylær virkningsmekanisme og rolle TP53 i Følsomhed til Novel Epothilon Sagopilone (ZK-EPO) i A549 ikke-småcellet lungekræft Cells

Abstrakt

Sagopilone, en optimeret fuldsyntetisk epothilon , er en mikrotubuli-stabiliserende forbindelse, som har vist stor

in vitro

in vivo

aktivitet mod en bred vifte af humane tumor-modeller. Vi analyserede forskellen virkningsmekanisme sagopilone i ikke-småcellet lungecancer cellelinier

in vitro

. Sagopilone hæmmede spredning af ikke-småcellet lungekræft-cellelinjer ved lavere nanomolær koncentration. Behandlingen med sagopilone forårsagede stærke forstyrrelser i cellulær cytoskeletorganisation. Der blev observeret to koncentrationsafhængige fænotyper. På 2,5 nM sagopilone eller 4 nM paclitaxel opstå aneuploid fænotype mens en mitosestandsning fænotype blev induceret med 40 nM sagopilone eller paclitaxel. Interessant behandling med 2,5 nM af sagopilone effektivt inhiberede celleproliferation, men – sammenlignet med høje koncentrationer (40 nM) – kun marginalt induceret apoptose. Behandling med en høj versus en lav koncentration af sagopilone eller paclitaxel regulerer en ikke-overlappende sæt af gener, hvilket indikerer, at begge fænotyper være meget forskellige fra hinanden. Gener involveret i G2 /M faseovergang og spindlen samling checkpoint, ligesom Cyclin B1 og BUBR1 blev opreguleret ved behandling med 40 nM sagopilone. Uventet, også gener involveret i DNA-skade responset blev opreguleret under denne behandling. I modsætning hertil behandling af A549-celler med en lav koncentration af sagopilone afslørede en opregulering af direkte transkriptionelle målgener af TP53, ligesom CDKN1A, MDM2, GADD45A, FAS. Knockdown af TP53, som inhiberede den transskriptionelle induktion af TP53 målgener, førte til en betydelig stigning i apoptose induktion i A549-celler ved behandling med en lav koncentration af sagopilone. Resultaterne viser, at aktivering af TP53 og dens downstream effektorer som CDKN1A ved lave koncentrationer af sagopilone er ansvarlig for den relative apoptose modstand A549 celler og kan udgøre en mekanisme af resistens over for sagopilone

Henvisning:. Winsel S, Sommer A, Eschenbrenner J, Mittelstaedt K, Klar U, Hammer S, et al. (2011) Molekylær virkningsmekanisme og rolle TP53 i Følsomhed til Novel Epothilon Sagopilone (ZK-EPO) i A549 ikke-småcellet lungekræft Cells. PLoS ONE 6 (4): e19273. doi: 10,1371 /journal.pone.0019273

Redaktør: Wael El-Rifai, Vanderbilt University Medical Center, USA

Modtaget: August 19, 2010; Accepteret: 31 marts 2011; Udgivet: 29 April, 2011

Copyright: © 2011 Winsel et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Arbejdet blev finansieret af Bayer Healthcare (www.bayerhealthcare.com). De finansieringskilder havde en rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, og udarbejdelse af manuskriptet. Alle forfatterne er ansatte eller tidligere ansatte i Bayer Healthcare. Yde støtte i detaljer: S. Winsel, J. Eschenbrenner, K. Mittelstaedt modtaget kommercielle forskningsbevillinger fra Bayer Healthcare; A. Sommer, U. Klar, S. Hammer, J. Hoffmann er nuværende eller tidligere beskæftiges af Bayer Healthcare og hold patenter på Bayer Healthcare samt aktier på Bayer

Konkurrerende interesser:. Forfatterne har læst tidsskriftets politik og har følgende konflikter: virksomheden havde en rolle i denne undersøgelse i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre og forberedelse af manuskriptet. Alle forfatterne er ansatte eller tidligere ansatte i Bayer Healthcare. Yde støtte i detaljer: S. Winsel, J. Eschenbrenner, K. Mittelstaedt modtaget kommercielle forskningsbevillinger fra Bayer Healthcare; A. Sommer, U. Klar, S. Hammer, J. Hoffmann er nuværende eller tidligere beskæftiges af Bayer Healthcare og hold patenter på Bayer Healthcare samt aktier på Bayer. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle de PLoS ONE politikker på datadeling og materialer.

Introduktion

Lungekræft er en af ​​de førende årsager til kræft død på verdensplan, da det ofte er kun diagnosticeret på fremskredne stadier og viser en høj grad af resistens over for de kemoterapeutiske regimener anvendte. [1] – [5]. Sagopilone (SAG) er en helsyntetisk epothilon, i klinisk udvikling, der blev optimeret til at overvinde begrænsninger ofte forbundet med taxaner, konventionelle tubulinbindende midler (TBA’er) som f.eks MDR medierede resistente mekanismer [6]. SAG har vist høj

in vitro

in vivo

aktivitet i en række tumormodeller sammenlignet med paclitaxel (PAC) og andre almindeligt anvendte kemoterapeutiske stoffer [6]. Med stærke anti-tumor aktivitet blevet observeret i NSCLC (ikke-småcellet lungekræft) cellelinjer

in vitro

og primære humane NSCLC mus xenograftmodeller kan SAG give en potentiel ny behandling mulighed for NSCLC [7].

Flere undersøgelser beskriver prædiktive markører for respons for NSCLC cellelinier, som ekspression af excision reparation cross-komplementering gruppe 1 (ERCC1) genet for platinforbindelser [8] eller den epidermale vækstfaktor receptor (EGFR) mutationsstatus for EGFR tyrosin-kinase-inhibitorer (gefitinib og erlotinib) [9]; [10]. Med hensyn til resistens over for TBA’er, viste rapporter om cellelinier udvalgt til PAC modstand gennem langtidsdyrkning i nærvær af lægemidlet forøgede niveauer af TUBB3 (beta lll-tubulin) proteinekspression [11]. Derimod deres patupilone (epothilon B) resistent modstykke, inkuberet på samme måde, viste lav TUBB3 proteinekspression [11]. Disse data antyder, at TUBB3 bidrager til den cellulære resistens overfor PAC men ikke til epothilon. Som følge heraf er der behov for andre markører, der kan forudsige SAG respons.

Mutationer i tumorsuppressorgener, som spiller en central rolle i cellulære respons på DNA beskadigelse, cellecyklusregulering, og apoptose [12] , blev fundet i ca. 50% af alle NSCLC tilfælde [13]. Imidlertid har den rolle, TP53 som reaktion på TBA’er som PAC blevet anfægtede: Nogle grupper rapporterede ingen sammenhæng mellem TP53 mutationsstatus og følsomhed over for PAC [14]; [15], mens andre observeret, at manglen på TP53 aktivitet resulterede i øget kemosensitivitet til PAC [16]; [17]. Disse resultater tyder på, at TP53 mutationsstatus og ændret TP53 aktivitet kunne påvirke følsomheden af ​​celler til SAG. For at løse dette spørgsmål, har vi analyseret indflydelse TP53 på evnen af ​​SAG at inducere apoptose i en NSCLC model

in vitro

.

Identifikationen af ​​lagdeling biomakers eller lægemiddel- eller narkotika mål -relaterede respons markører kan betydeligt forbedre resultatet af behandlingen, og vil føre til et skift til mere skræddersyede terapier mod specifikke sygdomstilstande typer [18]. Den optimale behandling til patienter, der lider af NSCLC vil i stigende grad afhængige af biomarkør analyse for at identificere den patientgruppe, der vil drage størst fordel af en bestemt mono- eller kombinationsbehandling. Ikke desto mindre, biomarkør identifikation og validering stadig en stor udfordring [19], og det er derfor vigtigt at ledsage udviklingen af ​​nye terapeutiske midler til patienter med NSCLC med forskning på patientens lagdeling og identifikation og validering af kliniske biomarkører, som kan forudsige respons. Som led i denne proces, er det vigtigt at forstå, hvordan aktiviteten af ​​lovende nye agenter er påvirket af ændringer i vigtige cellulære veje, og vice versa.

Formålet med vores translationel program var at undersøge aktiviteten af ​​SAG

in vitro

i et panel af NSCLC cellelinjer, at analysere dets virkningsmekanisme og sammenligne dem med virkningerne af PAC og at undersøge mulige resistensmekanismer samt prædiktorer for respons baseret på genekspression profilering.

Materialer og metoder

Celler og forbindelser

Humane lunge karcinom cellelinjer (A549, NCI-H1437, NCI-H23, NCI-H522, NCI-H226, NCI H460) blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC) og dyrket ifølge anbefalede protokoller. SAG blev syntetiseret ved Bayer Healthcare Laboratories gennem samlede synteser. PAC blev købt fra Sigma-Aldrich (München, Tyskland). pan-caspaseinhibitor ZVAD.fmk den blev købt fra Bachem, (Heidelberg, Tyskland). Alle medier og kosttilskud til cellekultur blev erhvervet fra Biochrom AG (Berlin, Tyskland). Stamopløsninger blev fremstillet som tidligere beskrevet [20]. Til selektion af stabilt transducerede cellelinjer Hygromycin blev indkøbt fra Roche (Mannheim, Tyskland).

Tumor-celleproliferationsassay

Virkningen af ​​SAG eller PAC om spredning af lungekræft blev vurderet ved anvendelse af en celleproliferationsassay baseret på farvning af celler med krystalviolet som beskrevet tidligere [20]. IC50-værdier blev beregnet ud fra tre uafhængige eksperimenter under anvendelse af Sigmaplot software (SPSS, Friedrichsdorf, Tyskland).

In vitro

analyse af virkninger på cytoskelettet, cellecyklussen og apoptose

A549-celler blev inkuberet med vehikel (ethanol 0,1%), 2,5 nM eller 40 nM SAG i 20 timer, fikseret med 4% paraformaldehyd og farvet med et monoklonalt muse-anti-α-tubulin-antistof (1:1000) (Sigma-Aldrich ), Alexa Fluor® 488-bundet gede-anti-muse-IgG sekundært antistof (1:250) (Invitrogen Inc., Carlsbad, CA, USA) og DRAQ5 (Biostatus, Leicestershire, UK), ifølge standard protokoller. Faste og farvede celler blev analyseret ved anvendelse af et Zeiss LSM 510 META mikroskop (Carl Zeiss, Jena, Tyskland) forsynet med en plan-Apochromat® 63x /1.4 (olie DIC) mål. Zeiss LSM-software (version 3.0 SP3) blev anvendt til konfokal billeddannelse.

Fluorescens-aktiveret cellesorterer (FACS) -analyse blev udført for at bestemme cellecyklusfordeling af SAG- eller PAC-behandlede celler. Celler blev inkuberet med SAG ved de angivne koncentrationer eller køretøj i 18 timer, fikseret med 70% ethanol og farvet med 50 pg /ml propidiumiodid (PI) (Sigma-Aldrich). Cellulært DNA-indhold blev bestemt ved flowcytometri under anvendelse af BD FACSCalibur ™ (Becton, Dickinson and Company, San Jose, CA, USA) og blev analyseret med CellQuest ™ software (Becton, Dickinson and Company). For at undersøge apoptose ved FACS, blev A549-celler inkuberet i 72 timer med de angivne koncentrationer af SAG eller køretøj, trypsiniseret og farvet med DiOC

6 (3) (3,3′-dihexyloxacarbocyanine iodid) (Invitrogen Inc.) og PI som beskrevet før [21].

Kvantitativ realtids-PCR og Western Blot

RNA blev ekstraheret under anvendelse af RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland), cDNA blev dannet ved anvendelse SuperScript First Strand Synthesis System (Invitrogen Inc.). Real-time PCR blev udført med genekspression assays fra Applied Biosystems: p21 (# Hs00355782_m1), TP53 (# Hs00153340_m1), cyclin B1 (# Hs00259126_m1), BUBR1 (Hs00176169_m1), FAS (Hs00163653_m1), GADD45A (Hs00169255_m1), MDM2 ( Hs00242813_m1), og HPRT (# 4326321E) som endogen kontrol. Reaktioner blev sat op i tre eksemplarer hjælp TaqMan FAST Universal PCR Mastermix og registreres i en 7500 Fast Real-Time PCR-system (Applied Biosystems). Den relative ekspression af hvert gen blev kvantificeret i henhold til den sammenlignende tærskel cyklus metode (ΔΔ

Ct-metoden) med lige amplifikationseffektiviteter af målet og den endogene kontrol.

Proteiner blev udvundet ved hjælp af M-PER pattedyrprotein Extraction Reagent (Pierce, Perbio Science, Bonn, Tyskland). Proteinkoncentrationerne af lysaterne blev bestemt med BCA Protein Assay Kit (Pierce) ifølge producentens instruktioner. Lige store mængder proteiner blev separeret på en 4-12% Bis-Tris-gel (Invitrogen) i en XCell Surelock elektroforese kammer (Invitrogen) fyldt med MOPS SDS-løbebuffer og overført til en PVDF-membran (Invitrogen) ifølge producentens instruktioner. Efter blokering af uspecifikke bindingssteder blev membranen probet med antistoffer specifikke for CDKN1A (Abcam, # 16767), TP53 (BD ​​Pharmingen, # 15801A), BUB1B (BD Transduction Laboratories, # 612.502), cyclin B1 (BD Pharmingen, # 554.176 ), γH2AX (upstate, # 05-636), PARP (BD Pharmingen, # 551.024), phospho-Ser /Thr-MPM-2 (upstate # 05-368), og GAPDH (Advanced immunkemiske # RGM2 /klon 6C5) som ladningskontrol.

RNA-ekstraktion til genekspression analyse

A549-celler blev podet i 10 cm celle dyrkningsplader og fastgøres natten. Cellerne blev derefter behandlet med medium indeholdende enten 2,5 nM SAG, 40 nM SAG, 4 nM PAC eller 40 nM PAC henholdsvis køretøj (ethanol 0,1%), eller forblev ubehandlede i 18 timer. Totalt RNA blev ekstraheret under anvendelse af RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland), der indbefatter en DNase I (Qiagen) trin for at fjerne genomisk DNA. Total RNA blev kontrolleret for integritet ved hjælp af RNA LabChips på Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies Inc., Palo Alto, CA, USA), og koncentrationen blev bestemt på en NanoDrop spektrofotometer (Peqlab, Erlangen, Tyskland). Alle RNA-prøver havde høje RNA integritet tal [22] større end 9,5.

Affymetrix GeneChip® analyse

One-Cycle eukaryot Target Mærkning Kit (Affymetrix Inc., Santa Clara, CA, USA ) blev anvendt ifølge producentens instruktioner. Kort fortalt 2 ug høj kvalitet total RNA blev revers-transkriberet under anvendelse af en T7 mærket oligo-dT primer for første-streng cDNA syntese-reaktion. Efter RNase H-medieret anden streng cDNA syntese, den dobbeltstrengede cDNA blev oprenset og tjente som template til efterfølgende

in vitro

transkriptionsreaktion som genererer biotinmærket komplementær RNA (cRNA). Den biotinylerede cRNA blev derefter ryddet op, fragmenteret og hybridiseret til GeneChip HGU133Plus2.0 udtryk arrays (Affymetrix, Inc., Santa Clara, Californien, USA.), Som indeholder 54675 probe sæt. De GeneChips blev vasket og farvet med streptavidin-phycoerythrin på en GeneChip Fluidik Station 450 (Affymetrix). Efter vask blev arrays scannet på en Affymetrix GeneChip 3000 scanner med autoloader. I alt 30 HGU133Plus2.0 arrays blev forarbejdet med n = 5 biologiske gentagelser for alle behandlingsgrupper.

Expression analyser blev udført med Expressionist Pro 4.0 software (Genedata AG, Basel, Schweiz). Kvaliteten af ​​datafiler (CEL-format), der indeholder sonde niveau ekspression data blev kontrolleret og forfinet ved hjælp af ekspressionistisk Refiner software (Genedata AG). Det raffinaderi proces blev udført ved gruppering af prøver på funktionen intensitet niveau. Dette gør det muligt at identificere mulige outliers på funktionen intensitet niveau. Efterfølgende blev raffineret CEL filer kondenseret med MAS5.0 algoritme (Affymetrix) og LOWESS normaliseres ved hjælp af alle eksperimenter som reference. De normaliserede udtryk data sæt blev fyldt i Cobi databasen (Genedata) og analyseret med Genedata Expressionist software. Princip Component Analysis (PCA) og hierarkisk klyngedannelse blev udført med ekspressionistisk Analyst Pro 4.0 software (Genedata). En gyldig værdi andel analyse blev udført for hver gruppe (4 af 5 probe sæt skulle vise et signal), og de resulterende grupper af probe sæt blev forenet. Disse data blev udsat for en række parvise sammenligninger ved hjælp af Expressionist Analyst Pro 4.0 software (Genedata). Statistiske analyser omfattede parvise sammenligninger mellem SAG- eller PAC behandlede prøver og vehikelbehandlede prøver. Probe sæt blev anset for at blive reguleret, hvis de var uden for ellipsoiden region i Volcano plot anvendelse af følgende tærskler: Volcano plot: 5x-gange ændring og P-værdi 1 × 10-5 fra T-test for 40 nM SAG og PAC; til 2,5 nM SAG og 4 nM PAC 3 gange forandring og P-værdi 5 × 10-3. Venn skæringspunktet analyser af signifikant regulerede gener blev udført for at identificere gener reguleres almindeligvis ved forskellige behandlinger ved hjælp af Expressionist Analyst Pro 4.0 software. Pathway analyser blev udført med GeneGo Metacore (St. Joseph, MI, USA) database og software-værktøjer. Alle Affymetrix cel-fil data er tilgængelige via ArrayExpress tiltrædelse nummer E-mtab-377.

Kloning af shRNA konstruerer

BLOCK-iT RNAi Designer algoritme (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA ) blev anvendt til at analysere TP53 mRNA (GenBank deponeringsnummer, NM_000546.4) og identificere tre målsekvenser for shRNA, dvs. shTP53_1 (sense) 5′-GCATCTTATCCGAGTGGAAGG-3 ‘og 5′-CCTTCCACTCGGATAAGATGC-3′; shTP53_2 (sense) 5’-GACTCCAGTGGTAATCTAC-3 ‘og 5′-GTAGATTACCACTGGAGTC-3′; shTP53_3 (sense) 5’-GCGCACAGAGGAAGAGAATCT-3 ‘og 5′-AGATTCTCTTCCTCTGTGCGC-3’. De målsekvenser for en ikke-specifik kontrol shRNA (ikke-målrettet shRNA) var shCtrl1 (sense) 5′-TAAGGCTATGAAGAGATAC-3 ‘og 5′-GTATCTCTTCATAGCCTTA-3′ og shCtrl2 (sense) 5’-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3 ‘og 5 ‘-ACGTGACACGTTCGGAGAA-3’.

Komplementære syntetiske DNA-oligonukleotider blev hybridiseret og indsat i pENTR /U6-vektoren (Invitrogen). shRNA kassetter blev rekombineret ved Gateway kloning ind i en modificeret pLenti-6 destinationsvektor (pGT3, Invitrogen) til generering lentiviral shRNA ekspressionskonstruktioner shCtrl1, shCtrl2, shTP53_1, shTP53_2, og shTP53_3. Alle konstruktioner blev bekræftet ved DNA-sekventering på Tjenesterne i Molekylær Biologi (SMB), Berlin, Tyskland.

Produktion af lentivirus og transduktion af A549 celler

293FT celler blev transficeret med forskellige pGT3 ekspressionsvektorer indeholder TP53 shRNAs eller non-mål kontrol shRNA. Lentivirus produktion blev udført i overensstemmelse med den BLOCK-iT U6 RNAi indtastning Vector Kit Brugervejledning (Invitrogen). A549 celler blev inficeret med lentivirus rekombinant for shTP53_1, shTP53_2, shTP53_3, eller ikke-target kontrol shRNAs shCtrl1 og shCtrl2 henholdsvis og valgt med hygromycin (100 ug /ml). Individuelle kloner blev ekspanderet og testet for TP53- knockdown effektivitet ved QRT-PCR (data ikke vist) og immunblotting.

Resultater

Sagopilone virkningsfuldt inhiberer proliferation af NSCLC-cellelinier i det nanomolære område

Den anti-proliferative aktivitet af SAG og PAC blev undersøgt i 6 ikke-småcellet lungekræft cellelinier af forskellige undertyper (adenokarcinom: A549, NCI-H1437, NCI-H23, NCI-H522, planocellulært karcinom: NCI -H226; storcellet lungecarcinom: NCI-H460) ved anvendelse af en

in vitro

proliferationsassay (figur 1A).. SAG inhiberede lunge tumor celleproliferation i alle cellelinjer, med IC50-værdier fra 0,2 til 3.3 nM, og var effektivt til sub-nanomolære koncentrationer (≤1 nM) i fem af de seks cellelinier. Desuden SAG var konsekvent mere effektiv end PAC.

1A, SAG og PAC hæmme spredning af lungekræft-cellelinjer. Seks forskellige lungecancer-cellelinjer blev behandlet med SAG eller PAC i 72 timer. Proliferation blev målt med krystalviolet assay. Gennemsnitlige EC50 værdier som mål for halvmaksimal vækstinhibering og standardafvigelser er vist. 1B, Immunfluorescensfarvning af α-tubulin (grøn) og DNA (rød) i A549 lungecancerceller efter inkubering med enten vehikel (0,1% ethanol), 2,5 nM eller 40 nM SAG. Scale bar = 20 um. Repræsentative billeder af interfase og mitotiske celler er vist. 1C, FACS-analyse af A549 celler behandlet med køretøj, 2,5 og 40 nM SAG eller 4 nM og 40 nM PAC i 18 timer afslørede G2 /M anholdelse ved 40 nM SAG eller PAC og øget antal celler med 2 N og 2 N DNA-indhold og berigelse i G

0 /G

1 fase af cellecyklus ved 2,5 nM SAG eller 4 nM PAC. 1D, Induktion af apoptose ved stigende koncentrationer af SAG i A549-celler. A549-celler blev inkuberet i 72 timer med køretøjet, eller 2,5 nM, 5 nM, 10 nM, 40 nM eller 100 nM synke. Yderligere blev cellerne farvet med 3,3′-dihexyloxacarbocyanine iodid (DiOC6 (3)) og propidiumiodid for FACS måling. Hvide søjler angiver middelværdien procentdelen af ​​celler karakteriseret ved fald i A ^ m (A ^ m lav) og sorte søjler angiver celler med ATm lav og høj propidiumiodid signal (PI + og A ^ m lav) på grund af plasmamembran brud. Gennemsnittet af tre uafhængige forsøg og standardafvigelsen er givet.

Sagopilone forstyrrer cytoskeletale funktioner og inducerer apoptose i A549-celler Salg

Yderligere forsøg på den generelle virkemåde af SAG blev udført med A549 som model cellelinie. Vehikelbehandlede A549-celler viste en normal mikrotubulus spredning i interfaseceller og typiske bipolære spindler med congressed kromosomer på metafaseplade i mitotiske celler (fig. 1B). I modsætning hertil, når A549-celler blev inkuberet med 40 nM SAG mærket mikrotubulus bundling i interfase-celler var synlig som førte til en unormal spindel organisation i metafase-celler, med flere spindel poler, flere plader af congressed kromosomer, og en uregelmæssig kromosomale alignment. Disse cellulære effekter var dosisafhængige og også set efter inkubation med 2,5 nM SAG, men i mindre omfang.

Virkninger af SAG og PAC på cellecyklusprogression blev målt i A549 celler

in vitro

med FACS-analyse (fig. 1C og supplerende fig. S1). To forskellige fænotyper blev observeret: Lave koncentrationer af Sag eller PAC (0,5-5 nM og 2-7 nM) inducerede aberrerende celledeling resulterer i dannelsen af ​​en forøget procentdel af aneuploide celler med en DNA-indhold 2N eller 2N, men kun en lille stigning i procentdelen af ​​celler i G2 /M-fasen. En anden fænotype blev observeret ved højere koncentrationer af SAG og PAC ( 10 nm): Her en dramatisk stigning i procentdelen af ​​celler i G2 /M-fasen blev observeret (Fig 1C og supplerende Fig S1..). For alle yderligere analyser af de to forskellige fænotyper, blev to koncentrationer ansat som inducerer enten aneuploid fænotype, dvs. 2,5 nM SAG eller 4 nM PAC eller mitosestandsning fænotype, dvs. 40 nM SAG eller PAC.

En koncentration -afhængige induktion af apoptose ved SAG blev observeret i FACS-analyse efter 72 timers inkubation. Interessant behandling med lave koncentrationer af SAG (2,5, 5 og 10 nM) effektivt inhiberede celleproliferation men inducerede kun lidt apoptose, hvorimod den høje koncentration SAG behandlinger (40 nM og 100 nM) medførte udtalt induktion af apoptose i A549-celler ( fig. 1D).

Stærke virkninger af høj koncentration, men ikke af lav koncentration sagopilone-behandling på ændringer i hele genomet genekspression i A549-celler

RNA blev isoleret fra A549-celler, ubehandlede , vehikelkontrol-behandles, såvel som behandlet med hver af SAG to koncentrationer (2,5 nM og 40 nM) og PAC (4 nm og 40 nm) i 18 timer og hybridiseret til Affymetrix HGU133Plus2.0 arrays. blev opnået høj kvalitet genekspression data. En principal komponent analyse (PCA) baseret på ekspressionen af ​​alle generne afslørede to hovedgrupper: En klynge indeholdt den ubehandlede, vehikel-behandlede og lav koncentration SAG (2,5 nM) – eller PAC-behandlede (4 nm) prøver, hvorimod behandlede prøver med høje koncentrationer (40 nM) af Sag eller PAC dannet et separat klynge (fig. 2A, 2B), hvilket viser, at behandling med en lav lægemiddel af Sag eller PAC inducerede kun relativt små genekspression ændringer i forhold til de ubehandlede prøver, hvorimod en høj lægemiddelkoncentration på SAG eller PAC inducerede stærkere genekspressionssystemer ændringer.

2A og 2B. Princip Component Analysis (PCA) af microarray data for A549 celler ubehandlet (grå), køretøj-behandlede (mørkegrå), eller behandlet med 2,5 nM (blå) eller 40 nM SAG (mørkeblå) og 4 nM (grøn) eller 40 nM PAC (mørkegrøn) i 18 timer. Hver plottet kugle repræsenterer udtrykket profil af en individuel prøve med n = 5 uafhængige biologiske gentagelser på fremskrivning af data på de første tre hovedkomponenter, der tegner sig for det meste af variabiliteten i de data (mærkede akser). Visninger fra to forskellige vinkler (fig. 2A, 2B) er vist at visualisere clustering.

Parrede t-tests sammenligne hver behandlingsgruppe med vehikel-behandlede grupper blev udført, og resultaterne vises som Volcano plot (Supplerende fig. S2), der afbilder betydning som en funktion af folden ændring. Fire gen lister blev genereret med de tærskelværdier parametre for P-værdi og fold ændring af de høje og lave koncentrationer behandlinger af begge forbindelser var som beskrevet i tabel 1, sammen med det samlede antal og antallet af op- og ned-regulerede gener. Genet lister opnået fra de statistiske tests blev sammenlignet under anvendelse Venn-diagram. Fra i alt 503 gener reguleres med 40 nM PAC og 593 med 40 nM SAG blev 391 gener både reguleret af begge behandlinger, hvilket indikerer et lignende sæt af gener, der berøres af en høj koncentration af begge TBA’er. En Gene Ontology (GO) analyse af de 391 regulerede gener med GeneGo Metacore software afslørede en lignende forekomst og rangorden af ​​biologiske processer (data ikke vist), hvilket indikerer en meget lignende virkningsmekanisme for begge TBA’er ved høj koncentration. I modsætning hertil, når man sammenligner de 593 gener, der reguleres af 40 nM SAG med de 221 gener, der berøres af behandling med 2,5 nM af det samme stof, kun 41 gener var almindeligt reguleret af både narkotika koncentrationer og en mager ni gener var almindeligt reguleret af 40 nM ( [32]. [35]. [37]. [15]. [45].