PLoS ONE: selectiner Mediate småcellet lungekræft Systemisk Metastase

Abstrakt

Metastase dannelse er den vigtigste årsag til den ekstremt dårlig prognose i småcellet lungekræft (SCLC) patienter. De molekylære interaktion partnere regulerer metastase-dannelse i SCLC er stort set ukendt, men fra andre tumor organer, som det er kendt, at tumorceller bruger adhæsionsmolekylerne af leukocytadhæsion kaskade at fastgøre til endotel ved stedet for den fremtidige metastase. Anvendelse af den humane OH-1 SCLC linje som model, fandt vi, at disse celler udtrykte E- og P-selectin bindingssteder, som kunne være delvis tilskrives selectin bindende kulhydrat motiv sialyl Lewis A. Desuden protein backbones kendt bære disse glycotopes i andre cellelinjer, herunder PSGL-1, CD44 og CEA kunne påvises i

in vitro

in vivo

vokset OH1 SCLC celler. Ved intravital mikroskopi af murine mesenteriale vaskulatur kunne vi fange SCLC celler, mens rullende langs karvæggene viser, at SCLC celler efterligne leukocyt rullende adfærd i form af selectin og selectinligandprotein interaktion in vivo indikerer, at denne mekanisme faktisk kan være vigtigt for SCLC celler til frø fjernmetastaser . Følgelig dannelse af spontane fjerne metastaser blev reduceret med 50%, når OH-1-celler blev xenotransplanteret ind E- /P-selektin-deficiente mus sammenlignet med vildtypemus (p = 0,0181). som metastasedannelse ikke blev fuldstændig ophævet i selektin-deficiente mus, vi konkluderede imidlertid, at denne adhæsion kaskade er overflødig, og at andre molekyler ifølge denne kaskade mediere metastasedannelse samt. Ved hjælp af flere af disse adhæsionsmolekyler som interaktion partnere formentlig gøre SCLC celler så højt metastatisk

Henvisning:. Heidemann F, Schildt A, Schmid K, Bruns OT, Riecken K, Jung C, et al. (2014) selectiner Mediate småcellet lungekræft Systemisk Metastase. PLoS ONE 9 (4): e92327. doi: 10,1371 /journal.pone.0092327

Redaktør: Andreas-Claudius Hoffmann, vesttyske Cancer Center, Tyskland

Modtaget: November 22, 2013; Accepteret: 21 februar 2014; Udgivet: April 3, 2014

Copyright: © 2014 Heidemann et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Bundesministerium für Bildung und Forschung (TOMCAT indrømme nummer 01EZ0824, https://www.bmbf.de/) og Landesexzellenzinitiative Hamburg (Nanoteknologi i Medicin – NAME). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Lille celle lungekræft (SCLC) repræsenterer i øjeblikket 13% af alle typer lungekræft og er den mest aggressive af alle lunge tumor enheder [1]. På grund af den hurtige tumor fordobling tid og tidlig hæmatogen spredning, den 5-års overlevelsen er fortsat under 5% med en median overlevelse på kun et par måneder [2], [3]. SCLC metastaserer typisk til hjerne, lever, knoglemarv eller binyrerne. Fordi dannelsen af ​​metastaser er generelt den førende årsag til kræft død og baseret på det faktum, at terapeutiske fremskridt i SCLC ikke påfaldende øge overlevelsen af ​​patienterne på lang sigt er en mere detaljeret indsigt i den metastatiske kaskade af SCLC presserende behov.

Metastase – som et kendetegn for kræft – er en flertrinsproces begyndende med den ukontrollerede vækst af en primær tumor celle, der overvinder basalmembranen og udsender angiogene signaler, således at nye blodkar vokser ind i den primære tumor cellemassen [4], [5]. En undergruppe af tumorceller frigør fra den primære tumor og ind i kredsløbet. De cirkulerende tumorceller brug for at flygte fra blodstrømmen at invadere bindevæv af en fjern organ. Derfor cirkulerende tumorceller interagere med normalt endotel på stedet for målorganet i en leukocyt-lignende måde. Når de har transmigrated endothelium og har slået sig ned i bindevævet stroma, tumorceller nødt til at opdele igen for at danne en klinisk påviselig metastase [6], [7].

Leukocytter bruge en kaskade af celleadhæsion molekyler til at vedhæfte og der vandrer endotelceller for at indgive i bindevæv stroma ved stedet for en inflammation. Denne adhæsion kaskade består af en række indbyrdes forbundne trin starter med tethering, efterfulgt af valsning, adhæsion, intraluminal gennemgang og afsluttes med paracellulær eller transcellulær migrering af endotelceller [8]. Den indledende leukocyt rullende på den luminale overflade af endotelceller medieres på endotel side ved en klasse af carbohydratbindende proteiner kaldet E- og P- selectiner. Disse to selectiner binder til deres carbohydratligander på leukocytterne i en Ca

2 + – afhængig måde. Den kulhydrat determinant består af sialyl Lewis

X eller sialyl Lewis

A tetrasaccharider [9]. Kendt selectin ligand transporterer protein rygrade er PSGL-1, ESL-1 og CD44 [10]. Ud over leukocytter [11], har cirkulerende tumorceller vist sig at udtrykke de kendte selectinligander [6], [7], [12]. For eksempel kan proteinet backbones PCLP-1 og CEA (CEACAM5) på kolon og prostatacancerceller glycosyleres med carbonhydratstrukturer, der binder til E-selectin [13], [14], [15].

den hypotese, at metastasedannelse medieres af selectiner understøttes af flere spontane metastase modeller for humane tumorceller xenotransplanteret i immunsvækkede mus. HT29 coloncarcinomceller [16] samt DU4475 brystcarcinomceller [17] transplanteret ind E- /P- selectin deficiente mus viste en signifikant nedsat antal spontane metastaser i lungen sammenlignet med selectin-udtrykkende vildtypemus. Det kunne også påvises, at peritoneal metastase af pancreas adenocarcinom blev reduceret i E- /P- selektin-deficiente mus [18].

Nylige undersøgelser af OH-1-cellelinien, der repræsenterer den klassiske SCLC fænotype [19], viste en fast adhæsion af OH-1-celler til en e-selectin-fusionsproteinet under fysiologiske flow betingelser. OH-1 celler vises selectin bindingssteder samt sialyl Lewis x og PSGL-1 [20]. Derfor vores undersøgelse med fokus på påvirkning af selectiner i udviklingen af ​​metastaser i SCLC og deres mulige selectinligander på SCLC celler.

Materialer og metoder

Cell linje

human småcellet lungecancer cellelinje OH-1 blev opnået fra pleural effusion og venligst stillet til rådighed af Uwe Zangemeister-Wittke (University of Bern, Farmakologisk Institut).

OH-1 celler dyrket

in vitro

anvendelse af RPMI 1640-medium (Gibco /Life Technologies, Paisley, Skotland) suppleret med 10% varmeinaktiveret føtalt bovint serum (FBS, Gibco), 2 mM L-glutamin (Gibco), 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin (Gibco) under standard cellekultur tilstand (37 ° C, 100% relativ fugtighed, 5% CO

2).

Lentiviral transduktion

For bioluminescens billedbehandling og intravital mikroskopi OH -1-LUC /mCherry celler, der udtrykker luciferasen fra

Photinus pyralis

og det fluorescerende protein mCherry blev dannet. Til dette formål Luc2 cDNA (Addgene Plasmid # 24337) blev klonet i 3

rd generation HIV1 afledt SIN vektor Lego IC2-Puro

+ [21]. Udover mCherry som markørgen, denne lentiviral vektor udtrykker puromycin N-acetyl-transferase, der giver resistens til puromycin. Lentivirale partikler blev frembragt som beskrevet [22]. Kort fortalt 293T-celler blev co-transficeret med vektor-plasmidet LeGO-IC2-Puro

+ – Luc2, og emballagen plasmiderne pHCMV-VSV-G, pMDLg /pRRE og pRSV-Rev ved calciumphosphat-udfældning. Supernatanterne indeholdende lentivirale partikler blev opsamlet 24 timer efter transfektion. Funktionelle titere blev målt ved FACS-analyse 3 dage efter transduktion af 293T-celler. For lentiviral transduktion af OH-1-celler 1 x 10

5 celler /ml blev udpladet i plader med 24 brønde. Den næste dag supernatanter indeholdende viruspartikler og 8 pg /ml Polybrene (Sigma) blev tilsat i 24 timer. For udvælgelse af transducerede OH-1-celler, blev regulært dyrkningsmedium suppleret med 2,5 ug /ml puromycin.

Flowcytometri

For at vurdere bindingssteder og deres protein skeletter celler på cellen overflade af OH-1-celler, blev dyrket OH-1-LUC /mCherry celler fritliggende med Cell Dissociation Buffer (Gibco, Carlsbad, USA) og farvet for sialyl Lewis A (Abcam, fortynding 1:1000), CEA (Cell Signalling, fortynding 1:200), CD44 (ABD Serotec, fortynding 1:1000), PSGL-1 (Santa Cruz, fortynding 1:200), E- og P-selectin bindingssteder sig ved hjælp E- og P-selectin fusionsproteiner (R IgG2a for CD44 og NCAM; IgM for sialyl Lewis A) blev inkuberet i parallel. Antistoffet ekspression blev bestemt med FACS Calibur flowcytometer (Becton Dickinson, Heidelberg, Tyskland) og analyseret med Win MDI 2.9 software.

In vivo

dyrket OH-1-celler fra en primær OH- 1-Luc /mCherry tumor blev undersøgt ved FACS-analyse. Celler blev dobbeltmærket for anti-CEA og en human E- eller P-selectin fusionsprotein.

Intravital konfokal mikroskopi

I intravital mikroskopi, tarm blev dissekeret i Ketamin /Xylazin (230 mg /kg og 20 mg /kg legemsvægt) bedøvede pfp /rag2 mus og mesenteriale vener blev visualiseret ved et konfokalt mikroskop udstyret med en resonant scanner (Nikon A1R). At inducere ekspressionen af ​​E- og P-selectiner på den apikale overflade af endotelceller, modtog musene en i.p. injektion af murin TNF-a tre timer før undersøgelse. OH-1-LUC /mCherry celler blev injiceret via en carotid vene kateter, og 30 konfokal billeder pr sekund blev registreret. Samtidig blev mesenteriale vener observeret og mCherry-mærket OH-1-celler visualiseret ved fluorescens belysning og konstateret for 15 min med planen fluo olie x40 /1,3 NA objektiv og med laseren excitationsbølgelængde på 561 nm og emission filter 595 nm for mCherry, og med excitationsbølgelængden af ​​638 nm og emission filter 640 nm for refleksion mode. Senere blev den erhvervede data analyseres. Leukocytter blev identificeret som ikke-fluorescerende rullende objekter, OH-1-LUC /mCherry celler som røde fluorescerende celler. Hver rullende tilfælde af OH-1-LUC /mCherry celler under optagelsen blev bestemt. Desuden blev den rullende hastighed af leukocytter og tumorceller beregnet (NIS-elementer). Optagelser er vedlagt som supplerende video.

Xenotransplantation af OH-1 og OH-1-LUC /mCherry celler i immunsvækkede mus

Alle dyr blev holdt i et patogen-frit miljø med filter top bure , fodres med sterilt vand og mad ad libitum og konstant observeret og vægtet. Alle manipulationer blev udført under aseptiske betingelser. For podning blev OH-1 eller OH-1-LUC /mCherry celler trypsineret og levedygtige celler (5 x 10

6) blev suspenderet i 1 ml FCS-frit celledyrkningsmedium. Hver immundefekte mus (stammer: PFP /rag2, E /P-selektin mangelfuld PfP /rag2, SCID) modtog en 200 pi portion af denne suspension injiceres subkutant mellem skulderbladene og samtidig være bedøvet med CO

2 /O

2 – anæstesi. I begyndelsen af ​​forsøget mus blev mellem 15 og 27 uger og vægte varierede mellem 17,4 g og 32,4 g.

Magnetic resonance imaging (MRI) og bioluminescens imaging (BLI) af primære tumorer og spontane metastaser

til påvisning af spontane fjerne metastaser

in vivo

, OH-1-LUC /mCherry celler blev subkutant injiceret i SCID-mus (n = 3). Hvid pels af SCID-mus med en Balb /c baggrund lettet påvisning af luminescens signal afledt fra luciferase-positive OH-1-LUC /mCherry celler. MRI og BLI blev udført 18 dage efter tumorcelleimplantation. For MR billeddannelse en 7-Tesla Bruker Clinscan dyr MRI scanner (Bruker BioSpin MRI GmbH, Ettlingen, Tyskland) samt en todimensional turbo spin-ekko (TSE) sekvens (aksial orientering af MR-billeder) blev anvendt samtidig regulering af murine kropstemperatur med et termoelement varmesystem. For bioluminescens billeddannelse blev luciferin (Sigma-Aldrich) injiceret intraperitonealt (150 mg Luciferin /kg legemsvægt) og fotonemission blev målt med IVIS 200-system (Xenogen, CA, USA). Den 54

th dagen efter OH-1-LUC /mCherry celle injektion, blev den primære tumor kirurgisk resektion og efterfølgende forarbejdet til histologi. På dag 117 luminescens signaler målt

in vivo

en anden gang. Kort efter blev musene til sidst bedøvet med Ketamin /Xylazin (400 mg /kg og 35 mg /kg legemsvægt) og den primære tumor og organer (lunge, hjerte, ben) blev fjernet til

ex vivo

luminescens billeddannelse og derefter bearbejdet for histologi. For alle de nævnte procedurer undtagen at ofre, mus, hvor bedøvet med inhaleret isofluran (1,5-2%).

metastaserende af OH-1-LUC /mCherry og OH-1 celler i selectin-deficiente mus og vildtypemus

immundeficient PFP /rag2 mus og E /P-selektin-deficiente pfp /rag2 mus blev anvendt [17]. For metastaserende af OH-1-celler 3 pfp /rag2 og 5 E /P-selectin deficient PfP /rag2 Mus (27 til 32 uger gamle) blev anvendt. Musene blev aflivet, da de undlod at UKCCCR sundhed score system eller tumorer begyndte at danne sår. De primære tumorer og lunger blev skåret ud og fikseret i 4% formalin til yderligere undersøgelse.

For metastaserende af OH-1-LUC /mCherry celler 20 PfP /rag2 og 20 E /P-selektin mangelfuld PfP /rag2 mus (15 til 27 uger gamle) blev anvendt. Mellem dag 32 og 41 efter OH-1-LUC /mCherry celle injektion, blev den primære tumor kirurgisk resektion og efterfølgende forarbejdet til histologi. Dyr levede indtil de mislykkedes UKCCCR sundhed score system, og de blev til sidst bedøvet med Ketamin /xylazin (400 mg /kg og 35 mg /kg legemsvægt) og luciferin var i.p. anvendt. Lung, ben og hjerte blev fjernet for

ex vivo

luminescens billedbehandling og derefter behandlet for immunhistokemi

Histologi

For hæmatoxylin /eosin (H . 50% af tumorcellerne var moderat eller intenst farvede

Statistisk analyse

Overlevelseskurver blev konstrueret ved anvendelse af Kaplan-Meier-metoden og sammenlignet ved log-rank prøve. En to-halet P 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. Statistiske analyser blev udført ved hjælp af softwaren GraphPad Prism (Graphpad Software, Inc., CA, USA.)

Etik Statement

Den metode for udførelse af dyreforsøg var i overensstemmelse med de UKCCCR retningslinjer for dyrs velfærd i kræftforskning. Forsøget blev overvåget af den institutionelle dyrevelfærd officer og godkendt af den lokale licensudstedende myndighed (Behörde für Soziales, Familie, Gesundheit und Verbraucherschutz;. Amt für Gesundheit und Verbraucherschutz, Hamburg, Tyskland, projekt nr 92/09).

Resultater

adhæsionsmolekyleekspression af OH-1 SCLC celler dyrket

in vitro

først undersøgte vi forekomsten af ​​E- og P-selectin bindingssteder, som var begge er til stede på OH-1-celler dyrket

in vitro

(fig. 1). For yderligere at analysere beskaffenheden af ​​disse bindingssteder, vi undersøgt for tilstedeværelsen af ​​E- og P-selectin ligand sialyl Lewis A, som også var til stede. Næste vi analyseret for protein rygraden i kendte sialyl Lewis A og sialyl Lewis X luftfartsselskaber nemlig CEA, PSGL-1 og CD44, som også var til stede. Derudover undersøgte vi OH-1 for yderligere celleoverflademolekyler vides at være involveret i metastaser i andre kræft enheder end SCLC. EpCAM, Muc18 samt den neuronale adhæsionsmolekyle kunne også detekteres NCAM på et højt ekspressionsniveau.

OH-1-celler, som en cellelinje af neuroektodermal oprindelse, er positive for NCAM og EpCAM, hvilket kunne være påvist ved flowcytometri analyse og kan således tjene som en markør for disse celler, når de dyrkes i mus. Celler udviser binding til E- og P-selectin fusionsprotein. Glycosyleringen motiv sialyl Lewis A, en bindingspartner anerkendt af selectiner, kunne detekteres med CA19-9 antistof. De cellelinie OH-1 udviser flere kendte proteiner, som er kendt for at være protein backbone for selectin bindende kulhydratrester såsom PSGL-1, MUC18, CD44 og CEA. Isotypekontroller vises som stiplede linjer.

E- og P-selectin binding af SCLC celler dyrket

in vivo

Ved brug af FACS-analyse (fig. 2) det undersøgt om

in vivo Salg dyrket OH-1-celler af primære xenotransplanterede tumorer har opretholdt evnen til at binde til selectiner fusionsproteiner. Celler høstet fra primær OH-1-LUC /mCherry tumorer blev dobbelt mærket med anti-CEA og en menneskelig E- eller P-selectin kimære. Næsten alle celler (78%) var begge positive for anti-CEA-farvning og E-selectin binding (fig. 2). Dobbelt farvning af anti-CEA og human P-selectin kimære afslørede, at 36% af cellerne var begge positive for P-selectin binding og CEA (Fig. 2C).

Isolated OH-1-Luc /mCherry celler af primære tumorer blev farvet parallelt mod CEA og E- eller P-selectin binding og FACS analyseret. (A) OH-1-LUC /mCherry celler viste ingen binding til isotype og FC-kimære kontroller. (B) Næsten alle celler var CEA og E-selectin binding positiv, derimod (C) to tredjedele af cellerne var P-selectin binding negativ. Isotypekontroller vises som stiplede linjer.

In vivo

opførsel af cirkulerende SCLC celler

OH-1-LUC /mCherry celler rullende på TNF-α behandlet karvægge som leukocytter blev identificeret under anvendelse hurtigt intravital konfokal mikroskopi (figur 3A og Movie S1). Da vi også fundet rullende leukocytter, blev den rullende hastighed af begge celletyper målt. Leukocytter viste en gennemsnitlig rullende hastighed på ca. 50 um /s og OH-1-LUC /mCherry celler fra 350 um /sek (Fig. 3B). Således er den gennemsnitlige rullende hastighed af OH-1-LUC /mCherry celler var ca. syv gange hurtigere end for leukocytter, hvilket indikerer, at SCLC celler efterligner leukocytter rullende adfærd imidlertid i mindre vedhæftende effektivitet.

Rolling adfærd af indsprøjtet fluorescerende OH-1-LUC /mCherry celler (mCherry, rød) i mesenteriske årer (refleksion tilstand, grå) blev visualiseret i realtid med høj hastighed konfokal intravital billeddannelse. (A) rulning af en OH-1-LUC /mCherry celle blev observeret over 27 sekunder. (B) Mean rullende hastighed af injicerede OH-1-LUC /mCherry celler og endogene leukocytter i mesenteriske årer bestemtes med høj hastighed intravital billeddannelse (Nikon A1R konfokalt mikroskop). Målestok:. 500 um for (F) og (H), 50 um for (G)

SCLC metastatiske steder i immundefekte mus

For at undersøge spontan metastase site af SCLC celler OH-1-LUC /mCherry celler blev injiceret subkutant i SCID mus som en xenograft. For at ikke-invasivt verificere OH-1-LUC /mCherry primær

in vivo

tumorvækst, MR og bioluminescens billeddannelse blev udført. På dag 18 efter OH-1-LUC /mCherry podning eksistensen af ​​OH-1-LUC /mCherry primær tumor, der fremstod som en hyper intensiv læsion i T2-vægtede aksiale MR-billeder blev demonstreret på inokulationsstedet beliggende mellem scapulae (fig. 4A). De tilsvarende bioluminescens viste billeder luminescens signaler afledt af OH-1-LUC /mCherry tumorer (fig. 4B). Da det primære tumorvækst var for hurtig til at lokalisere de små metastaser i en ikke-invasiv måde, blev den primære tumor reseceret på dag 54 efter OH-1 inokulering og 63 dage senere blev musene undersøgt igen efter

in vivo

luminescens. Luminescens-signaler kunne påvises i det område, som snude, øvre bryst og venstre bagben (fig. 4C). For at validere tilstedeværelsen af ​​metastaser væv på disse steder blev skåret efter at ofre af dyrene og bioluminescens blev undersøgt igen

ex vivo

. Intensive signaler kunne efterprøves i lungerne (fig. 4D) og knæleddet (fig. 4E), mens hjertet ikke viste noget signal (fig. 4D). For at bekræfte at bioluminiscerende områder var faktisk metastaser, blev histologisk undersøgelse udført. Vital tumorceller i OH-1-LUC /mCherry tumor var placeret omkring en central nekrose (fig. 4F). Lunge- og knoglemetastaser kunne bekræftes ved siden raske væv.

OH-1-LUC /mCherry celler blev subkutant implanteret (A) og dyrket som en primær tumor (a) i 18 dage på stedet mellem skulderbladene (b) med en hyper-intensive udseende på en todimensional turbo spin-ekko (TSE) sekvens (MR-billeder i aksial retning) og en positiv bioluminescens signal (b) af den tilsvarende OH-1-LUC /mCherry tumor som i panel A. Den primære tumor blev fjernet kirurgisk 51 dage efter OH-1-LUC /mCherry celle injektion. (F) Tilsvarende paraffinsnit af resekterede tumoren afslørede levende tumorceller (e) omkring en central nekrose (f). (C) Luminescens signaler af metastaserende OH-1-LUC /mCherry celler in vivo kunne påvises inden for områderne snude, distale femur og bryst 117 dage efter injektion. Organer blev fjernet og bioluminescerende signaler blev bekræftet ex vivo. (D) Lungerne viste flere luminescens pletter (c), mens hjerte (d) ikke viste nogen tegn på luminescens. (G) H 0,0001) (fig 5B og tabel 2.). Lunger og ben blev fjernet og analyseret separat for bioluminescens intensitet. Vi kunne vise en signifikant forskel mellem organer fra vægt (n = 12), og vælg mus (n = 18) med reduceret bioluminescens signal i lungerne (fig. 5C) og ben (fig. 5D) fra selektin-defekte mus i forhold til WT mus indikerer et stærkt begrænset metastatisk belastning i selectin deficiente mus (Mann-Whitney-test, p = 0,0003).

OH-1-LUC /mCherry celler blev subkutant injiceret i E- /P-selectin double knockout-mus (vælg) eller vildtype kuld mus (wt) og deraf tumorer dyrket i 31-41 dage. Tumorer blev resektion og vægtet. (A) Ingen statistisk forskel om tumor vægt kunne bestemmes (Studerende t-test, p = 0,5025). Tumor resektion mus levede indtil de nåede end point kriterier. (B) Kaplan Meier overlevelse kurve viser faldt betydeligt median overlevelse vægt (n = 20) mus sammenlignet med vælge (n = 20) mus (log-rank test, p 0,0001). Organerne blev fjernet og en signifikant forskel sammenligne wt (n = 12) og vælg mus (n = 18) blev bestemt i form af bioluminescens af de fjernede lunger (C) og ben (D) (Mann-Whitney-test, p = 0,0003 ). I en parallel tilgang OH-1 celler blev subkutant injiceret i udvalgte (n = 5) eller wt (n = 3) mus og tumorer dyrkes for 36-65 dage. Organer blev fjernet, og tumoren blev bestemt. Der var ingen statistisk signifikant forskel i vægten af ​​de primære OH-1 tumorer mellem musestammer (e) (studerende t test, p = 0,6489). Antallet af spontane lungemetastaser i udvalgte og wt mus blev bestemt. Bemærk, at antallet af metastaser statistisk var signifikant reduceret med 50% i udvalgte mus i sammenligning med vildtype mus (F) (studerende t test, p = 0,0181).

For at udelukke indflydelse lentiviral transduktion på metastaser satsen vi analyserede forældrenes OH-1 cellelinje i en parallel tilgang. OH-1-celler blev injiceret subkutant i vælge (n = 5) eller wt (n = 3) mus og tumorer dyrket i 36-65 dage. Lunger og primære tumorer blev fjernet, og tumoren blev bestemt. Den gennemsnitlige tumorvægt (fig. 5E) var 1,53 g (n = 3) i vildtype og 1,72 g (n = 5) i selectin- dobbelt-deficiente mus. Der var ingen statistisk signifikant forskel i vægten af ​​de primære OH-1 tumorer mellem musestammer (studerende t test, p = 0,6489). Desuden er alle mus udviklede spontane mikrometastaser til lungen. Imidlertid er antallet af metastaser til lungerne signifikant forskellig mellem vildtype og E /P-selectin-deficiente mus stamme. Antallet af metastaser varierede i vildtype mus varierede mellem 47.560 og 72165 (betyder: 61076) og i E /P-selectin dobbelt-mangel mus metastaser lå mellem 16790 og 53317 (betyder: 28446) (. Figur 5F). Bemærk, at fraværet af E- og P- selectiner faldt antallet af spontant udviklede lungemetastaser med 50% (studerende t-test, p = 0,0181).

immunhistokemisk påvisning af selectinligandproteinet rygrad SCLC celler

in vivo

For at undersøge, at selectinligander og yderligere celleoverflademolekyler blev udtrykt

in vivo

i primære tumorer og metastaser, vi har analyseret deres udtryk ved immunhistokemi (fig. 6). Den etablerede selectinligandproteinet CEA kunne påvises i primære tumorer og endda observeret med en forøget ekspression i lunge og knoglemetastaser. CD44 og EpCAM, vides at være til stede i en række forskellige tumor enheder, blev også udtrykt i tumor og lungemetastaser i høj grad. Desuden blev SCLC markørproteinet PGP 9.5, også kendt som UCH-L1, rigeligt udtrykt i celler af den primære tumor, lunge- og knoglemetastaser.

Primært OH-1 tumor samt spontan OH-1