PLoS ONE: Kræft-associerede fibroblaster Fremme spredning af endometriecancer Cells

Abstrakt

Endometriecancer er den mest almindeligt diagnosticeret gynækologisk malignitet på verdensplan; Endnu tumormikromiljøet, især fibroblastceller omgiver cancerceller, er dårligt forstået. Vi etablerede fire primære kulturer af fibroblaster fra humane endometriecancer væv (cancer-associerede fibroblaster, cafeer) ved hjælp af antistof-konjugeret magnetisk perle isolation. Disse relativt homogene fibroblastkulturer udtrykte fibroblast markører (CD90, vimentin og alpha-glatmuskelactin) og hormonale (østrogen og progesteron) receptorer. Konditionerede medier indsamlet fra CAF inducerede en dosisafhængig proliferation af både primære kulturer og cellelinier af endometriecancer

in vitro

(175%) sammenlignet med ikke-behandlede celler, i modsætning til dem fra normal endometrial fibroblastcellelinie line (51%) (

P

0,0001). Disse effekter blev ikke observeret i fibroblast kultur stammer fra godartede endometrie hyperplasi væv, hvilket indikerer specificiteten af ​​CAF i at påvirke endometriecancer celleproliferation. For at bestemme mekanismen bag de differential fibroblast effekter, sammenlignede vi aktiveringen af ​​PI3K /Akt og MAPK /Erk veje i endometriecancer-celler efter behandling med normal fibroblasts- og CAF-konditionerede medier. Western blot-analyse viste, at ekspression af begge phosphorylerede former af Akt og Erk var betydeligt nedreguleret i normale fibroblaster-behandlede celler, men opreguleret /opretholdt i cafeer-behandlede celler. Behandling med specifikke inhibitorer LY294002 og U0126 vendt CAF-medieret celleproliferation (

P

0,0001), hvilket tyder på en rolle af disse veje i modulering endometriecancer celleproliferation. Rapamycin, som er rettet mod en nedstrøms molekyle i PI3K pathway (mTOR), undertrykte også CAF-induceret celleproliferation ved at inducere apoptose. Cytokin profilering analyse afslørede, at CAF secernerer højere niveauer af makrofag kemoattraktant protein (MCP) -1, interleukin (IL) -6, IL-8, RANTES og vaskulær endotelvækstfaktor (VEGF) end normale fibroblaster. Vores data tyder på, at i modsætning til normale fibroblaster, kan CAF udvise en pro-tumorigen virkning i progressionen af ​​endometriecancer, og PI3K /Akt og MAPK /Erk-signalering kan repræsentere kritiske regulatorer i hvordan endometriecancer-celler reagerer på deres mikromiljø.

Henvisning: Subramaniam KS, Tham ST, Mohamed Z, Woo YL, Mat Adenan NA, Chung i (2013) Cancer-associerede fibroblaster Fremme spredning af endometriecancer Cells. PLoS ONE 8 (7): e68923. doi: 10,1371 /journal.pone.0068923

Redaktør: John W Glod, Robert Wood Johnson Medical School, USA

Modtaget: 8. februar 2013; Accepteret: 3 juni 2013; Udgivet: 26 Jul 2013

Copyright: © 2013 Subramaniam et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde er finansieret af University Malaya Research Grants RG336 /11HTM (Chung), UM HIR /MOHE /mED-12 (Chung) og HIR-MOHE E-00.025-20.001 (Mohamed). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Endometriecancer (EF) er den sjette mest almindeligt diagnosticeret kræft blandt kvinder globalt, med cirka 288.000 nye tilfælde og 50,327 dødsfald forekommer på verdensplan hvert år [1]. Det er den mest almindelige gynækologisk malignitet i USA med et skøn over 47,100 nye tilfælde diagnosticeret i 2012 [2]. Af betydning er forekomsten og dødeligheden for EF været stigende i de udviklede lande og udviklingslande og forventes at stige yderligere med den stigende aldrende befolkning og forekomsten af ​​fedme [3]. Selv de fem-års overlevelse for EF er 85%, en delmængde af endometrie tumorer udviser en aggressiv fænotype, kendetegnet ved høj histologisk kvalitet, regional lymphovascular invasion og fjernmetastaser. Prognosen for disse tumorer er relativt fattige, med fem-års overlevelse spænder fra 16 til 66% [4].

Ca. 90% af EF-tilfælde er sporadiske og inddeles i type 1 og type 2, i henhold til deres ætiologi og klinisk opførsel [5]. Type 1 EF repræsenterer flertallet af sporadiske tilfælde, der tegner sig for 70-80% af nye tilfælde [5]. Type 1 kræftformer, for det meste endometrioide i histologi, er ofte lav kvalitet tumorer med en gunstig prognose. Disse kræftformer ofte til stede med PTEN, K

ras

og beta-catenin mutationer og forøget ekspression af østrogen receptor [6]. Det foreslås, at overdreven udsættelse østrogen kan føre til atypisk endometriehyperplasi (EH), en godartet tilstand af proliferativ endometrial kirtel [7,8]. Endvidere har atypisk EH været stærkt forbundet med invasiv EF i op til 62% endometriske biopsiprøver, hvilket antyder, at atypisk EH kan være den direkte precursor til endometrioide type 1 EF [9]. Ikke desto mindre er den primære årsag til behandlingssvigt i både type 1 og 2 livmoderkræft er en fjern spredning af primære tumorer (metastase) [10]. Den mekanisme, der fører til denne aggressive transformation endnu ikke er fastlagt. undersøgelser af andre tumortyper tyder imidlertid på, at de omkringliggende fibroblaster kan have vigtig rolle i tumor progression [11,12].

I den kvindelige reproduktive tarmkanalen, kan fibroblaster fremme epitel udvikling og differentiering [13,14]. De er ansvarlige for ekstracellulær matrix remodellering og producerer parakrine vækstfaktorer, som kontrollerer celleproliferation, overlevelse og død [15]. Faktisk har bidrag cancerassocierede fibroblaster (CAFS) i progressionen af ​​forskellige cancertyper blevet undersøgt, for eksempel i prostatacancer [16-18], pancreascancer [12], hoved- og halscancer [19] og bryst kræft [20]. I disse tumormodeller, CAF forøget tumorcelleproliferation, invasion og kemoresistens. Desuden er CAF også menes at have store roller i modulering tumor angiogenese, immun celle infiltration og metastatisk kolonisering [21-23]. Inddragelsen af ​​fibroblaster i progressionen af ​​EF, imidlertid relativt under-undersøgt.

Karakterisering af fibroblast faktorer i endometriecancer, mens få, er hovedsageligt fra patologiske analyser. Hepatocytvækstfaktor og c-Met-ekspression blev signifikant korreleret med højere stadier af EF, selvom ikke var prognostiske af ringere overlevelse [24]. En anden undersøgelse observeret, at CXCR4 ekspression var signifikant højere i tumorer med muskelkraft infiltration, en indikator for metastase [25]. Interessant med primære kulturer fra endometriske væv, Arnold et al viste, at udskillelsen fra normale endometriske fibroblastceller inhiberede proliferationen af ​​Ishikawa-celler, en human EF-cellelinje [26]. Denne iagttagelse blev yderligere understøttet af Zhao gruppe, hvori de foreslog, at denne anti-proliferative virkning kan skyldes inhibering af PI3K signalering [27]. Ikke desto mindre er det stadig uvist, om CAF i EF vil udstille en anti-tumor ejendom som med normale endometriske fibroblaster, eller en pro-tumor karakteristisk som med CAF fra andre tumortyper.

Derfor, i denne undersøgelse, vi etablerede flere primære kulturer af humane endometriske fibroblastceller fra EF væv, at undersøge virkningerne af CAF på EF-celleproliferation. Vi viste desuden, at der i modsætning til normale endometrie fibroblaster, CAF forfremmet EF celleproliferation, dels ved at modulere PI3K /Akt og MAPK /Erk signalveje. Vi testede også anvendelsen af ​​rapamycin, en mTOR-inhibitor, som et potentielt terapeutisk middel i inhibering CAF-medieret celleproliferation. Undersøgelsen giver nye beviser belyse den pro-tumorigen rolle fibroblaster i tumorgenese af EF.

Materialer og metoder

Kemi og reagenser

U0126 og LY294002 blev indhentet fra celle Signaling Technology (MA, USA), og rapamycin (sirolimus) blev købt fra Clearsynth Labs (Mumbai, Indien).

Etik erklæring

undersøgelsen blev godkendt af Etisk Komité University Malaya Medical Centre (Ref nr 865,19). Skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle deltagere.

Humane væv og cellelinier

Væv fra fire livmoderkræft og en hyperplasi væv blev opnået fra kvinder, der gennemgår operation for at fjerne svulsten del af endometriet. Ca. 1 g af væv blev transporteret til laboratoriet i medier bestående af RPMI1640 (Life Technologies, NY, USA) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) (Life Technologies, NY, USA) og 1% penicillin /streptomycin (Life Technologies , NY, USA). Væv blev hakket til størrelsen af ​​1 mm

3 og derefter fordøjet med 2 mg /ml collagenase II for EF væv og med collagenase I for hyperplasi væv (Worthington, New Jersey, USA) i en rotator i 1 time ved 37

° C. Indlæg fordøjelse, blev vævene vasket og dyrket i RPMI1640 medium suppleret med 10% FBS og 1% penicillin /streptomycin ved 37

° C. Kulturer blev opretholdt af medier skifter hver 72 timer og sub-dyrket efter at sammenflydning. Humane endometriske cancercellelinier, ECC-1 (CRL-2923) og HEC-1-A (HTB 112) og immortaliseret human normal endometrial fibroblast cellelinje, T-HESC (CRL-4003) blev indkøbt fra American Type Culture Collection (Bethesda , MD, USA) og blev dyrket i medier ifølge producentens protokol.

isolering af primære epitel og stromaceller

Alle dyrkede primære celler opnået fra kirurgiske væv blev underkastet stromal celle isolation ved anvendelse af anti -fibroblast magnetiske mikroperler (Miltenyi Biotech, Köln, Tyskland). Kort fortalt, 1×10

6 celler blev centrifugeret ved 300x

g

i 10 minutter. Cellepellets blev derefter resuspenderet i 100 pi puffer indeholdende en slutkoncentration på 0,5% bovint serumalbumin og 2 mM ethylendiamintetraeddikesyre opløst i pH 7,2, calcium og magnesium fri phosphatbufret saltvand og inkuberet med 20 pi humant anti-fibroblast mikroperler antistof (Miltenyi Biotec, CA, USA) i 1 time. Celler blev derefter separeret under anvendelse af MiniMACS ™ celleseparator (Miltenyi Biotec, CA, USA). Isolerede celler blev derefter fortsat dyrkes i de ovennævnte medier. Epitelceller population blev også høstet anvendelse af en lignende metode, under anvendelse af humant CD326 (EpCAM) magnetiske mikroperler antistof (Miltenyi Biotec, CA, USA).

Flowcytometrianalyse

Dyrkede celler blev trypsinbehandlet og 1×10

6 enkelt cellesuspension blev blokeret med 10% normalt gedeserum (Biowest, Nuaille, Frankrig) før farvning med AlexaFluor 647 (AF647) -konjugeret human epithelial celleadhæsionsmolekyle (EpCAM) og PE-konjugeret humant CD90 antistoffer (Biolegend, San Diego, USA). Isotypekontroller blev anvendt, var AF647 muse IgG2b, κ og PE muse IgG1, κ hhv. Farvning blev derefter analyseret under anvendelse af BD FACSCanto II flowcytometer og resultaterne blev vist under anvendelse af FACS DiVa software (BD Bioscience, Californien, USA).

Kvantitativ real time polymerasekædereaktion (QRT-PCR)

Total RNA blev ekstraheret fra dyrkede celler under anvendelse af TRIzol (Invitrogen, Californien, USA) og 1 ug RNA blev omdannet til cDNA under anvendelse DYNAMO cDNA syntesekit (Finnzymes, Vantaa, Finland). Sekvens for primere anvendt til at detektere epiteliale cellemarkører (EpCAM, E-cadherin, cytokeratin 8) og fibroblast cellemarkører (alfa-glatmuskelactin (α-SMA) og vimentin) er anført i tabel 1. QRT-PCR blev udført under anvendelse af ABI StepOne Plus (Applied Biosystem, Californien, USA) i 35 cykler ved hjælp 5x HOT FIREPol EvaGreen qPCR Mix (Solis Biodyne, Tartu, Estland), 10 pmol /pl forward og reverse primer, 10 ng /ul cDNA skabelon og PCR-kvalitet H

2O. Assays blev udført mindst tre gange, og middelværdierne blev anvendt til at beregne de relative ekspressionsniveauer under anvendelse af (t) fremgangsmåde ΔΔC. Ekspressionsniveauer blev først normaliseret til husholdning GAPDH gen. Dernæst blev gen testet i epitelceller ekspression sammenlignet med den tilsvarende mRNA-niveauet observeret på en repræsentativ fibroblastceller (T-embryonale), og på samme måde blev disse gener rapporteret udtrykt i fibroblastceller forhold til deres tilsvarende mRNA-niveauet i et repræsentativt epitelceller ( ECC-1).

Gene

Primere

Kilde

EpCAMForward5′-AATGTGTGTGCGTGGGA-3 ‘[79] Reverse5′-TTCAAGATTGGTAAAGCCAGT-3’E-cadherinForward5′-TTTGTACAGATGGGGTCTTGC-3’ [80] Reverse5 ‘-CAAGCCCACTTTTCATAGTTCC-3’Cytokeratin 8Forward5′-CTGGTGGAGGACTTCAAGAAC-3′ [81] Reverse5′-GACCTCAGCAATGATGCTGTC-3’αSMAForward5’-GACGAAGCACAGAGCAAAAGAG-3 ‘[82] Reverse5′-TGGTGATGATGCCATGTTCTATCG-3’VimentinForward5′-TGGCACGTCTTGACCTTGAA-3′ [83 ] Reverse5’-GGTCATCGTGATGCTGAGAA-3’Table 1.

Primere sekvenser

anvendt til QRT-PCR.

CSV Hent CSV

Udarbejdelse af fibroblastceller aircondition medier

fibroblastceller var podes og dyrkes i komplette medier i 24 timer, før der dyrkes i medier indeholdende 2% FBS for de følgende 72 timer. Konditioneret medium blev indsamlet ved brug af Amicon ultra centrifugal filtre (Merck Milipore, Massachusetts, USA) ved centrifugering ved 5000x

g dele på 4

° C i 1 time. Protein i den koncentrerede medium blev kvantificeret ved anvendelse af Bradford-assay (Biorad, CA, USA).

Methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) assay

proliferation af epitelceller blev vurderet med methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) prøve. Kort beskrevet blev celler podet i komplette medier ved 1-3 x10

3 celler /brønd i plader med 96 brønde. 24 timer efter podning blev cellerne behandlet med enten komplette medier, medier med 2% FBS, fibroblast-konditionerede medier og /eller inhibitorer i 72 timer. Ved afslutningen af ​​behandlingen blev 20 pi MTT-opløsning (5 mg /ml) tilsat til hver brønd. Følgende 4 timers inkubation ved 37

° C blev 100 pi 10% natriumdodecylsulfat tilsat for at opløse de formazankrystaller efter yderligere 4 timers inkubation ved 37

° C. Absorbans blev målt ved anvendelse spektrometer ved 575 nm med reference på 650 nm.

Total proteinekstraktion og western blotting

ECC-1-celler blev podet ved 1×10

4 celler /brønd i 6- brønds plader i komplette medier. 24 timer efter podning blev cellerne behandlet med enten komplette medier, medier med 2% FBS, fibroblaster-konditionerede medier og /eller inhibitorer i 72 timer. Proteinlysater blev opsamlet ved skrabning af cellerne i kold lysebuffer indeholdende slutkoncentration på 0,1% Triton-X, 0,1% SDS, 50 mM Tris, 150 mM NaCl, 1 x phosphatase og 1x proteaseinhibitorer. Proteinkoncentration blev kvantificeret under anvendelse af Bradford-assay (Biorad, CA, USA). Ca. 20 ug protein blev opløst på 10% natriumdodecylsulfat polyacrylamidgelelektroforese før bliver overført til polyvinylidendifluoridmembran. Anvendte antistoffer var kanin-anti-human Akt, phospho-Akt, Erk, phospho-Erk og β-actin (Cell Signaling Technology, USA). Blots blev visualiseret ved hjælp af ECL prime western blotting afsløring reagens (Amersham, GE Healthcare Lifesciences, Sverige) ved hjælp af gel dokumentationssystem (Biospectrum 410, UVP) og Vision Works LS software (CA, USA)

enzymmaerket assay (ELISA)

niveauerne af fosforyleret-Akt og phosphoryleret-Erk i ECC-1 celler behandlet med 1 pg /pl konditioneret medium fra T-embryonale menneskelige stamceller og CAF blev kvantificeret ved anvendelse af ELISA kits (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA). Kort fortalt blev 96-brønds plader coatet med fortyndet indfangende antistof natten over, før blokering og inkubering med cellelysater i 2 timer hver. Fortyndet detektionsantistof blev inkuberet i 1 time forud for inkubation af sekundært antistof i yderligere 30 minutter. TMB-substrat blev derefter tilsat til hver brønd i 15 minutter til farveudvikling før termineret med STOP opløsning. Absorbans blev aflæst ved 450 nm bølgelængde under anvendelse spektrometer (Tecan Systems, CA, USA). De viste data var gennemsnit på mindst tre gentagelser normaliseret med aflæsninger fra ECC-1 celler behandlet med medier, der indeholder 2% FBS.

Identifikation og måling af cytokinniveauer

Cytokiner udskilles af normale fibroblaster (T -HESC) og cancerassocierede fibroblaster (CAF af EC6, 7 og 11) blev målt ved anvendelse Raybiotech Quantibody Humant cytokin Array (Raybiotech, Georgia, USA) ifølge producentens protokol. Kort fortalt blev konditionerede medier fremstillet fra 72 timer-dyrkede fibroblaster som beskrevet ovenfor. 100 ug protein fra hver fibroblast sekretion blev tilsat til respektive matrix brønd og inkuberet natten over ved 4 ° C. Hver brønd blev vasket, inkuberet med rekonstitueret antistof cocktail i 2 timer ved stuetemperatur, vasket igen, før tilsætning af Cy3-konjugeret streptavidin. Efter yderligere omfattende vask, blev fluorescens signal målt ved hjælp af Agilent High Resolution Microarray Scanner (C-model), og rå signal data blev udtrukket fra TIFF-billede med GenePixPro 6.1 før analyseret med Q-Analyzer. Cytokinniveauer fra hver fibroblast sekretion blev sammenlignet med medium indeholdende 2% FBS (kontrol). De viste data for hver prøve var gennemsnitligt fluorescensintensitet fra fire array-brønde.

Statistisk analyse

Statistisk analyse, der har vurderet forskellene mellem kontrol- og forsøgsgruppen blev udført ved hjælp af Students

t

-test på IBM SPSS Statistics 20. En

P

-værdi. 0,05 blev anset for at være statistisk signifikant

Resultater

Isolering af cancer-associeret fibroblast celler fra humane endometriecancer væv

at etablere primære fibroblastceller fra endometrie væv, humane endometriecancer (EF) væv (EC6, 7, 11 og 14) blev fordøjet med collagenase, efterfulgt af celleisolering hjælp magnetiske perler konjugeret med anti-fibroblast-antistof. For EF6 og EF14, var negativt udvalgte celler derefter udsat for anti-CD326 konjugerede magnetiske perler til tilsætning af epitelial modstykke. De isolerede epitel og fibroblastceller blev betegnet som “Ep” og “Fib«, henholdsvis. Som vist i figur 1, var der en klar forskel i morfologi mellem epitelceller (EC6-Ep og EF14-Ep) og fibroblastceller (EC6-Fib, EF7-Fib, EC11-Fib, EF14-Fib). Epitelceller udviste rosenblad-formet morfologi og tendens til at vokse i kolonier, mens stromacellerne viste langstrakte spindelformede funktioner

hematoxylin eosin (H og E) farvning af væv og fase kontrast billeder af etablerede primære celler isoleret fra endometriecancer: EF6 (A), EF14 (B), EF7 (C) og EF11 (D). Forstørrelse: 100x. Efterfølgende blev disse spaltet med collagenase og dyrket, før epitel- og fibroblast celleisolering hjælp CD326 (EpCAM) og anti-fibroblast mærkede magnetiske perler.

For at bestemme renheden af ​​de isolerede epiteliale og fibroblast cellekulturer farvede vi cellerne med både epitel markør, Alexa Fluor 647-konjugeret EpCAM og fibroblast markering, PE-konjugerede CD90-antistoffer. Human endometrial adenocarcinoma cancercellelinie, ECC-1 viste høj ekspression af EpCAM (98%), mens, humant normalt endometrisk fibroblast cellelinje, T-HESC demonstreret høj ekspression af CD90 (74%) (figur 2A, D). Farvning med isotype antistofkontroller udviste minimal binding, hvilket indikerer specificitet af de primære antistoffer (data ikke vist). Epitelceller isoleret fra EC6 og 14 (EC6-Ep og EF14-Ep) viste moderat ekspression af EpCAM (55%) uden tegn på CD90-ekspression, hvilket indikerer, at dette epitel kultur ikke var forurenet med fibroblastceller (figur 2B, C). I modsætning hertil fibroblastceller isoleret fra EF væv (EC6-Fib, EF7-Fib, EC11-Fib, og EF14-Fib) var negative for EpCAM ekspression men yderst positivt for fibroblast markør CD90 (75-81%), hvilket indikerer, at de isolerede fibroblastceller var relativt ren og fri for epitelcelle kontaminering (Figur 2E-H). Alle de primære celler, der anvendes lå under passage 10 efter kultur, opretholde den tættest fænotype til de primære væv.

Flowcytometrianalyse af primære epitelceller og fibroblastceller isoleret fra endometriecancer væv blev udført efter mærkning celler med CD326-antistof -konjugeret med AlexaFluor647 og CD90-antistof-konjugeret med PE. Epitelial endometrial cellelinie, ECC-1 (A), primære epitelceller EC6-Ep (B) og EF14-Ep (C), normal endometrial stromal cellelinie, T-HESC (D) og primære fibroblastceller, EC6-Fib ( E), EF7-Fib (F), EF11-Fib (G) og EF14-Fib (H).

Molekylær karakterisering af endometrie primære kulturer

for yderligere at karakterisere den isolerede epitel- og fibroblastceller, udførte vi kvantitativ RT-PCR til at bestemme ekspressionen af ​​adskillige epitel- og fibroblast markører. Epithelial EC6-Ep og EF14-Ep-celler udviste høj ekspression af EpCAM, cytokeratin 8 og E-cadherin, med lav ekspression af vimentin og α-SMA (figur 3A, B). Ekspressionsniveauet vist blev normaliseret med niveauet af GAPDH. I modsætning hertil fire fibroblastceller isoleret fra endometriecancer væv (EC6-Fib, EF7-FIB, EC11-fib og EF14-FIB) viste større ekspression af vimentin og α-SMA, med lav ekspression af EpCAM, E-cadherin og cytokeratin 8 (Figur 3A-C). Disse data antydede, at vi var kunnet isolere relativt rene epitelceller med deres fibroblast kolleger fra de endometriecancer væv.

Totalt RNA blev underkastet kvantitativ real-time PCR-analyse af epiteliale markører (EpCAM, cytokeratin 8, E -cadherin), fibroblast markører (alfa-glatmuskelactin (αSMA), vimentin) (A-C), estrogen receptor 1 og 2 (ER1, 2), progesteron-receptor (PR), gestagen-associeret endometrial protein (PAEP) og matrixmetalloproteinase 1 og 9 (MMP1, 9) (D-F). Data gennemsnit; fejlsøjler, ± S.E.M. De viste data er repræsentative for tre uafhængige forsøg.

Derudover har vi også fastslået, at både epitel og fibroblastceller fra EF væv udtrykte varierende grader af østrogen og progesteron receptorer (ER1, ER2 og PR) (figur 3D-F), i overensstemmelse med den observation, at EF er hormon-responsive tumorer. Vi målte mRNA ekspression af tre almindeligt secernerede proteiner ved endometrium, progestagen-associeret endometrial protein (PAEP) og matrixmetalloproteinase 1 og 9 (MMP1, 9) i disse celler. Som vist i figur 3D-F, blev PAEP hovedsagelig udtrykt af fibroblaster, og større MMP1 ekspression blev observeret sammenlignet med den af ​​MMP9 i både epitel- og fibroblastceller. Tilsammen vores data kraftigt antydet, at disse primære epitel og fibroblastceller blev bevare deres

in vivo

fænotyper.

Differential effekter af endometrie fibroblast sekretion på endometriecancer celler

Det tidligere er blevet vist, at sekreter fra normale endometriske fibroblastceller var vækstinhiberende til endometriecancer cellelinje, Ishikawa-celler [26]. Konsekvent, konditionerede medier fra normal endometrial fibroblast T-HESC cellelinje inhiberede proliferationen af ​​ECC-1 og HEC-1A, på en dosis-afhængig måde (figur 4A, B). Ved 2 pg /pl, observerede vi en signifikant 51% og 69% vækstinhibering i ECC-1 og HEC-1A, hhv. Tilsvarende primære endometriecancer-celler, EC6-Ep og EF14-Ep var også vækst inhiberes af T-HESC konditionerede medier (EC6-Ep: 60%; EF14-Ep: 67%). (Figur 4C, D)

ECC-1 (A) og HEC-1A (B) cellelinjer og EC6-Ep (C) og EF14-Ep (D) primære endometriecancer-celler blev testet med konditionerede medier fremstillet fra cancerassocierede fibroblaster (EC6-Fib , EF7-Fib, EC11-Fib og EF14-Fib) og normal endometrial fibroblast cellelinje (T-HESC) i 72 timer. Cellelevedygtighed blev undersøgt under anvendelse MTT-assay og blev normaliseret med kontrol (medium indeholdende 2% FBS). CAF er vist, er gennemsnittet af alle de fire cancerassocierede fibroblaster testet. Data gennemsnit; fejlsøjler, ± S.E.M. *,

P

0,005 ;. **,

P

0,0001. De viste data er repræsentative for tre uafhængige forsøg.

For at bestemme og sammenligne virkningerne af cafeer sekreter på endometriecancer celler, vi høstet konditioneret medie fra 72 timer-dyrkede fibroblastceller, og derefter behandlet ECC-1 og HEC-1A humane endometriske cancercellelinier i 72 timer. Interessant, konditioneret medie fra cancer-associerede fibroblaster (EC6-Fib, EF7-FIB, EF11-fib og EF14-FIB) inducerede en kontrasterende effekt: de bevoksninger af både de primære endometriecancer celler (EC6-Ep og EF14-Ep) og de kommercielle endometriecancer-celler (ECC-1 og HEC-1A) blev markant forøget på en dosis-afhængig måde (Figur 4A-D). Større effekter blev set med ECC-1 og HEC-1A cellelinjer end i primære kulturer, EC6-Ep og EF14-Ep. Blandt CAF, EF-11-Fib demonstrerede de mest vækstfremmende virkning, der spænder 135% til 274% vækst i forhold til ubehandlede celler. Når disse individuelle CAF virkninger blev kombineret (mærket som CAF), der var en signifikant forskel på procent cellevækst medieret af CAF og T-HESC ved 2 pg /pl behandling (

P

0,05) (figur 4A -D).

for at udelukke, at den CAF-vækstfremmende virkninger skyldtes vores cellekultur procedurer, vi isolerede fibroblaster fra en atypisk hyperplasi væv, en godartet endometrium tilstand, ved hjælp af lignende fremgangsmåde. De isolerede fibroblaster (EH-FIB) udviste tilsvarende fibroblastisk morfologi

in vitro

, og udtrykte høje CD90 (65%) (figur 5A-C). Ved hjælp af konditionerede medier fra disse celler, vi undersøgte deres virkninger på celledeling af både kræft cellelinier (ECC-1 og HEC-1A) og primære epitelceller (EC6-Ep og EF14-EP). Som vist i figur 5D, havde EH-Fib konditionerede medier ikke signifikant påvirker proliferationen af ​​ECC-1 og HEC-1A-celler. Men når den blev testet på primære epitelceller EC6-Ep og EF14-Ep, EH-Fib inhiberede vækst på en dosis-afhængig måde, med et gennemsnit på 69% ved 2 ug /pl koncentration (figur 5D). Disse data antyder, at de vækstfremmende effekter ved CAF er specifik og ikke skyldes selektion ved vores eksperimentelle procedure.

Hematoxylin og eosin-farvning (A) og fase kontrast billede (B) af fibroblastceller isoleret fra human atypisk hyperplasi væv (EH-Fib); Forstørrelse, 100x. (C) Flowcytometrianalyse af EH-Fib farvet med epitelial markør CD326-Alexa Fluor 647 og fibroblast markør CD90-PE. (D) Cell levedygtighed assay bestemmelse af virkningerne af EH-Fib konditioneret medier på endometriecancer cellelinier (ECC-1 og HEC-1A) og primære epitelceller (EC6-Ep og EF14-Ep) efter 72 timers behandling. Data gennemsnit; fejlsøjler, ± S.E.M. *,

P

0,01. De viste data er repræsentative for tre uafhængige forsøg.

Aktivering af PI3K /Akt og MAPK /ERK veje i cancer-associeret fibroblast-medieret endometriecancer proliferation

For at belyse mekanismen bag den vækstfremmende virkninger af CAF sekretion på EF, vi bestemt aktivering af P 3K /Akt og MAPK /Erk, to store overlevelse veje impliceret i endometriecancer. I overensstemmelse med tidligere undersøgelse [27], behandling af normal fibroblast T-hESC-konditionerede medier markant reduceret phospho-Akt og phospho-Erk proteinekspression i ECC-1-celler, som vist med Western blot og ELISA-analyser (figur 6A, B). I modsætning hertil blev phospho-Akt proteinniveau moderat forhøjet når ECC-1-celler blev behandlet med EC6-Fib, EF7-Fib, EC11-Fib og EF14-Fib (figur 6A, B). Desuden CAF-behandlede ECC-1 celler viste også øget niveau af phospho-Erk, når der sammenlignes med dem, der blev behandlet med kontrol medier (figur 6A, B).

(A) Western blot analyse af phosphorylated- Akt (Ser473) og -Erk proteinekspression i ECC-1 celler efter behandling med enten normale endometrie fibroblast T-embryonale celler eller cancer-associerede fibroblastceller (EC6-Fib, EF7-FIB, EC11-fib og EF14-FIB). Densitometrianalyse sammenlignet den relative ekspression niveauet af p-Akt og p-Erk til deres totale proteinniveau. (B) Kvantitativ analyse af phosphoryleret-Akt (Ser473 og Thr308) og phosphorylerede-ERK-niveauer i ECC-1-celler efter behandling med enten T-HESC eller CAF, i sammenligning med celler behandlet med kontrol (medium indeholdende 2% FBS). ECC-1 (C) og EC6-Ep (D) celler blev behandlet med enten PI3K pathway selektiv inhibitor (LY294002) eller Erk pathway selektiv inhibitor (U0126) i nærvær af cancerassocierede fibroblaster konditionerede medier (1 pg /pl) for 72 timer. De viste data er cellelevedygtighed efter normaliseret med kontrol (medier, der indeholder 2% FBS). Data gennemsnit; fejlsøjler, ± S.E.M. *,

P

0,05; **,

P

0,0001. De viste data er repræsentative for to uafhængige forsøg.

For yderligere at undersøge den funktionelle rolle af PI3K /Akt og MAPK /ERK veje i CAF-medieret celleproliferation, vi næste behandlet ECC-1 og EC6-Ep celler med PI3K selektiv inhibitor (LY294002) og Erk selektiv inhibitor (U0126) i nærvær af EC6-Fib og EC11-Fib konditionerede medier i 72 timer. Både LY294002 og U0126 væsentligt reduceret CAF-medieret celleproliferation i disse celler (

P

0,0001) (figur 6C, D). Især U0126 forårsagede en større vækstinhiberende virkning i EC-celler behandlet med EC11-Fib konditionerede medier. Virkningerne af LY294002 og U0126 i inhibering endometriecancer celleproliferation var kun tydelig i nærvær af CAF sekretion medier, da disse inhibitorer påvirkes minimalt celleproliferation i kontrolmedium (Figur S1). Disse inhibitorer også udøvede lignende virkninger på andre EF-celler, HEC-1A og EF14-Ep (figur S1). Disse data antyder, at aktivering status PI3K /Akt og /eller MAPK /ERK pathways kan være det centrale punkt, hvorved fibroblaster fra både normale og cancer betingelser regulerer endometriecancer celleproliferation.

Vi yderligere vurderes, om rapamycin, en kendt PI3K nedstrøms inhibitor, kan være klinisk anvendelige til reversering CAF-medieret EF-celleproliferation. I nærvær af EC11-Fib konditionerede medier, behandling af rapamycin i 72 timer effektivt inhiberede ECC-1 og EC6-Ep-celleproliferation (

P

0,0001) (. Fig 7A, B). Ved den højeste testede dosis (2 uM), rapamycin reduceret ECC-1-celler fra 180% (konditionerede medier behandling alene) til 40% (konditionerede medier og rapamycin behandling) (

P

0,0001), mens minimal inhibering blev observeret, når celler blev dyrket i kontrolmedium (Fig.7A, B). Lignende resultat blev observeret med virkningerne af rapamycin på andre EC-celler, HEC-1A og EF14-Ep (figur S2). Brug annexin V mærkning, vi yderligere fastslået, at rapamycin hæmmede CAF-medieret EF celledeling

via

induktion af apoptose (Figur 7C-E). Behandling af ECC-1 med 1 pg /pl EF11-Fib konditionerede medier i 72 timer påvirkede ikke signifikant procentdelen af ​​apoptotiske celler;