PLoS ONE: Dynamics of DNA beskadiget Veje til Cancer

Abstrakt

Kemoterapi er almindeligt anvendt i kræftbehandling, dog kun 25% af alle kræfttilfælde kan lydhør og en betydelig del udvikler resistens. P53 tumor suppressor er afgørende for udviklingen af ​​kræft og terapi, men har været mindre modtagelige for terapeutiske anvendelser på grund af kompleksiteten af ​​sin indsats, hvilket afspejles i 66.000 papirer, der beskriver sin funktion. Her giver vi en systematisk tilgang til at integrere denne information ved at konstruere en storstilet logisk model af p53 interactome hjælp omfattende database og integration litteratur. Modellen indeholder 206 knuder repræsenterer gener eller proteiner, DNA skader input, apoptose og cellulære degeneration udgange, forbundet af 738 logiske interaktioner. Forudsigelser fra

i silico

knock-outs og steady state modelanalyse valideret ved anvendelse litteratursøgning og

in vitro

baserede eksperimenter. Vi identificerer en opregulering af Chk1, ATM og ATR veje i p53 negative celler og 61 andre forudsigelser opnået ved knockout test efterligner mutationer. Sammenligningen af ​​modelsimuleringer med microarray data viste en betydelig forøgelse af succesfulde forudsigelser på mellem 52% og 71% afhængig af kræftform. Vækstfaktorer og receptorer FGF2 blev IGF1R, PDGFRB og TGFa identificeret som faktorer, der bidrager selektivt til kontrol af U2OS osteosarkom og HCT116 tyktarmskræft cellevækst. Sammenfattende giver vi bevis for princippet om, at denne alsidige og prædiktiv model har stort potentiale til brug i kræftbehandlingen ved at identificere veje i de enkelte patienter, der bidrager til tumorvækst, der definerer en sub befolkning på “høj” responders og identifikation af forskydninger i veje fører til kemoterapi modstand

Henvisning:. Tian K, Rajendran R, Doddananjaiah M, Krstic-Demonacos M, Schwartz JM (2013) Dynamics af DNA er beskadiget Veje til kræft. PLoS ONE 8 (9): e72303. doi: 10,1371 /journal.pone.0072303

Redaktør: Peter Csermely, Semmelweis University, Ungarn

Modtaget: Maj 20, 2013; Accepteret: 9 juli 2013; Udgivet: 4. september, 2013 |

Copyright: © 2013 Tian et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forfatterne tak University of Manchester Intellectual Property til finansiering. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

p53 protein har været en af ​​de mest undersøgte proteiner siden sin opdagelse i 1979. det spiller en central rolle i reguleringen af ​​celle overlevelse og udviklingen af ​​kræft; p53-mutationer er fundet i mere end 50% af humane tumorer og ændringer eller mangel på p53-funktion er blevet forbundet med de fleste typer af cancerceller. P53-proteinet virker som en transskriptionsfaktor, som regulerer ekspressionen af ​​et stort antal nedstrøms gener ved komplekse mekanismer [1]. Det har anti-proliferative virkninger såsom cellecyklusstop, apoptose, og celleældning som respons på forskellige stress-signaler. Endvidere p53 er et kritisk knudepunkt af den cellulære kredsløb involveret i den fysiologiske reaktion til vækstfaktorer eller unormale oncogene stimuli. Post-translationelle modifikationer, protein-protein interaktioner og proteinstabilisering findes at være afgørende kontrolniveauer af p53-aktivitet.

Trods sin grundlæggende rolle p53 har været mindre modtagelige for terapeutiske anvendelser end andre målgener eller proteiner som på vellykket anvendt i kræftbehandling [2]. Forståelsen af ​​p53 pathway mekanismer har både akademisk og kommerciel interesse for design af nye kræftbehandlinger og udvælgelsen af ​​sikrere kræft lægemiddelkandidater [3]. En væsentlig grund til, at det har været så svært at udnytte vores viden om p53 til terapeutiske applikationer er faktisk kompleksiteten af ​​sin indsats. Der er mere end 66.000 artikler om p53 i den videnskabelige litteratur, og alligevel er vi stadig langt fra at forstå detaljerne i sin funktion. Denne observation kræver en mere systematisk tilgang til at integrere dette enorme mængde information til konsekvente repræsentationer, der vil muliggøre en bedre forståelse af de systemer-dækkende mekanismer, der regulerer p53 funktion.

Netværk og systemer biologi tilgange tilbyder lovende nye værktøjer til studere komplekse mekanismer, der er involveret i udviklingen af ​​sygdomme [4].

I silico

modeller kan integrere store sæt af molekylære interaktioner i konsistente repræsentationer, som kan underkastes systematisk test og prædiktive simuleringer. Modeller af forskellige skalaer og beregningsmæssige kompleksitet er under udvikling, fra kvalitative netværk repræsentationer kvantitative kinetiske og stokastiske modeller [5] – [7]. I tilfælde af p53, den enorme mængde og kompleksitet af molekylære interaktioner involveret løber et storstilet kinetiske model uden for rækkevidde. Ikke desto mindre er en stor mængde biologisk viden er tilgængelig på p53, som ikke er i form af kvantitative kinetiske data, men i form af kvalitative oplysninger. For eksempel adskillige rapporter indikeret, at ATM (ataxia telangiectasia muteret) påvirker p53 som respons på DNA-skade [8]. Selvom 1350 publikationer beskriver sammenhængen mellem ATM og p53 i PubMed, 57 papirer viser, at ATM phosphorylerer p53 og kun 11 papirer indeholde de oplysninger, som ATM phosphorylerer og aktiverer p53. Tilsvarende er eksempler på nedstrøms p53-målgener, såsom Bax (BCL2-associeret X protein), som styrer apoptose proces eller CDKN1A (cyclinafhængige kinaseinhibitor 1A (p21, Cip1)), der kontrollerer cellecyklusstandsning godt undersøgt [9], [10]. Imidlertid er de detaljerede kinetik for kun en delmængde af disse interaktioner er kendt [11].

Derfor har vi en hypotese, at vores forståelse af p53 funktion kan forbedres ved systematisk integrering af sådanne kvalitative viden i en stor -skala, konsistent logisk model. I modsætning til kinetiske modeller, behøver logiske modeller ikke bruge kinetiske ligninger repræsenterer den detaljerede dynamiske mekanisme af hver enkelt interaktion, men i modsætning til kvalitative netværk, de indeholde oplysninger om virkningerne af interaktioner. Denne information er generelt repræsenteret i form af booleske logik: hvert knudepunkt (gen /protein) i den logiske model kan have to bestemte tilstande, 0 eller 1, altså en inaktiv eller aktiv form henholdsvis; hver interaktion kan have to bestemte virkninger, aktivering eller inhibering af mål-node. Fordelene ved logiske modeller er, at simuleringer er hurtigt selv for store modeller, de tillader en omfattende udforskning af rummet af node stater med identifikationen af ​​stabile tilstande eller cykling attraktorer, og de giver en tilnærmelse af den faktiske ikke-lineær dynamik hele systemet . F.eks Schlatter gruppe konstrueret en boolesk netværk baseret på litteratursøgning og beskrevet adfærd både interne og eksterne apoptoseveje som respons på forskellige stimuli. Deres model afslørede betydningen af ​​krydstale og feedback loops kontrollere apoptotiske veje [12]. Rodriguez et al. bygget en stor boolsk netværk til FA /BRCA (Fanconi anæmi /Breast Cancer) vej og simuleret reparation af DNA ICLs (interstreng-links). Denne model afslørede forholdet mellem den aktiverede DNA reparation vej og defekter i FA /BRCA vej [13].

I denne artikel præsenterer vi en logisk model af p53-system, der integrerer 203 gener /proteiner, DNA skader input, apoptose og cellulære degeneration udgange, forbundet af 738 logiske interaktioner indsamlet fra eksisterende databaser og den videnskabelige litteratur. Modellen, herefter benævnt PKT206 (PKT henstand i p53 model konstrueret ved Kun Tian og antallet indikerer populationen af ​​protein- eller gen-knudepunkter medtaget i modellen) kan anvendes til at forudsige virkningerne af DNA damage pathways onto cellulær skæbne. Vi præsenterer en funktionel analyse af denne model og undersøge virkningerne af knockouts vha CellNetAnalyzer software [14]. Adskillige forudsigelser produceret af modellen blev valideret af ekstern litteratur og nye eksperimentelle data, tilføje nye bidrag til vores viden om p53-systemet. Modellens resultater blev testet ved hjælp af microarray analyse og vi viser, at forholdet mellem gode forudsigelser væsentligt overstiger værdien af ​​tilfældige forudsigelser, der spænder mellem 52% og 71%. Det er fundet, at PKT206 modellen er et lovende prædiktiv værktøj, der kan øge vores forståelse af de komplekse mekanismer i p53 veje og giver en ny tilgang til personlig kræftbehandling.

Resultater

Model konstruktion

for at organisere viden om p53 interactome i en sammenhængende ramme, blev en logisk model af p53-systemet konstrueret (figur 1, tabel S1 i File S1). I denne model knudepunkter repræsenterer gener eller associerede proteiner, der interagerer med p53, og kanterne repræsenterer samspillet mellem dem. To typer af interagerende processer anses: aktivering eller inhibering. I et aktiverende interaktion, er resultatet en induktion af aktiviteten af ​​target node (r), og i en inhiberende vekselvirkning, er resultatet en undertrykkelse af aktivitet af target node (s) [14]. For eksempel induktion af p53 stimulerer ekspressionen af ​​MDM2 (Mdm2, p53 E3 ubiquitin protein ligase homolog (mus)) [15], som er repræsenteret ved en aktiverende interaktion fra p53 til MDM2. Samtidig, MDM2 aktivering fører til nedregulering af p53, som er repræsenteret ved en hæmmende interaktion fra MDM2 til p53 [16].

Java grænseflade programmer blev skabt for at udtrække p53 interaktioner fra strengen databasen . Vi derefter kurateret manuelt data og bruges Gene ontologi anmærkninger for at tilslutte netværket til DNA-skader input og apoptose output. CellNetAnalyzer blev anvendt til analyse og simuleringer, og resultaterne valideret ved anvendelse litteratur undersøgelser og eksperimentelle metoder, herunder western blotting og microarray analyse.

Selv om der er mange databaser og registrerer genetiske og protein-protein interaktioner, få rekord virkningen interaktionen har på slutknudepunktet. En bemærkelsesværdig undtagelse er STRING (Søg værktøj til søgning af Interacting Gener /Proteiner) database [17], som skelner mellem forskellige virkningsmekanismer, herunder aktivering, hæmning og bindende. Interaktion registreringer af den menneskelige p53 interactome blev først hentet automatisk fra STRING databasen (se Materialer og metoder). De interaktioner filtreret ved at fastholde kun høje tillid scores som defineret af STRING (mere end 0,7). Men på grund af de begrænsninger, den nuværende tekst mining metoder i at identificere virkemåder, blev selv den gruppe af høj tillid interaktioner fundet, at indeholde nogle fejl. For at undgå ukorrekte data, der indgår i modellen, blev alle interaktion poster således manuelt kurateret af landmåling den tilhørende litteratur og søge efter yderligere beviser. Eksempler på de typer af fejl fundet og oplysninger om interaktioner, der blev korrigeret efter den manuelle curation proces er angivet i tabel 2 og figur S1-S4 i File S1.

Et tilbagevendende spørgsmål i opbygningen af ​​

i silico

modeller er at definere grænserne for systemet. For at opnå en fuldstændig dækning af p53 interactome, men holde størrelsen af ​​systemet inden for acceptable grænser for simulation, vi medtaget alle yderst overbevisende interaktioner med gener /proteiner interagerer direkte med p53, og tilføjet alle interaktioner mellem disse gener /proteiner der ikke involverer p53 direkte. Dette sikrede, at regulatoriske feedback-loops blev inkluderet i modellen. I nogle få tilfælde blev forskellige proteiner kombineres i en enkelt node afspejler, at tidligere litteratur ikke skelne mellem dem: dette var tilfældet for HRAS (v-Ha-ras, Harvey rotte sarkom viral onkogen homolog), KRAS (v- Ki-ras2, Kirsten rotte sarkom viral onkogen homolog), de nationale tilsynsmyndigheder (neuroblastomceller RAS viral (v-ras) onkogen homolog) og RASD1 (RAS, dexamethason-induceret 1), repræsenteret som en enkelt node RAS; CCNA1 (cyklin A1) og CCNA2 (cyklin A2) repræsenteret CCNA; CSNK2A1 (kasein kinase 2, alfa 1 polypeptid) og CSNK2A2 (kasein kinase 2, alpha prime polypeptid) repræsenteret CSNK2.

Celler opfylde talrige stress stimuli, herunder ioniserende og UV (ultraviolet) stråling, onkogen aktivering, varme shock, hypoxi, etc [18]. DNA skade responset medieret af p53 er godt undersøgt og mest klinisk relevant, da de fleste af kræft behandlingsstrategier involverer DNA skader veje. Derfor DNA-skader blev tilsat som et indgangssignal ved at forbinde netværket til en enkelt input node repræsenterer DNA-skade. Ligeledes apoptose og cellulære ældning blev udvalgt som de bedst undersøgte og mest klinisk relevante udgange blandt mange andre muligheder, herunder cellecyklus arrest, DNA-reparation og angiogenese. Således netværket blev forbundet til to output knudepunkter repræsenterer apoptose og senescens. Links fra DNA-skader og mod apoptose og ældning blev kurateret hjælp Gene ontologi vilkår (tabel S3-S5 i File S1) samt supplerende manuel datasikring. Den resulterende model, opkaldt PKT206, omfattede 203 gen /protein knudepunkter, en input node (DNA damage), to output knudepunkter (apoptose og senescens) og 738 interaktioner. Komplette lister over gener /proteiner og interaktioner med henvisninger til litteratur baseret beviser findes i tabel S1 og S3-S5 i File S1.

Struktur af p53 logiske model

p53 node er tilsluttet til 202 gener eller proteiner i netværket og deltager i 225 interaktioner (figur 2). Fem lag kan skelnes i netværket efter forholdet af knudepunkter til p53: indgangssignalet, DNA-skader; opstrøms knudepunkter af p53; p53 selv og MDM2; downstream knudepunkter af p53; og udgange, apoptose og ældning. Det blev konstateret, at 67 knudepunkter fungerede som opstrøms knudepunkter af p53. For eksempel ATM fungerer som en DNA-skader inducerbar node opstrøms for p53 [19]; det aktiverer p53 direkte såvel som gennem CHEK2 (checkpoint kinase 2) opregulering [20] – [22]. 146 knuder fungerede som p53 målgener, herunder velundersøgte pro apoptotiske gener, såsom BAX [9] og CDKN1A der kontrollerer cellecyklusstandsning [23]. 11 gener fungerede både som opstrøms og nedstrøms knudepunkter i p53 og var involveret i to trin feedback.

PKT206 model repræsenteret ved Cytoscape omfatter 203 gen /protein noder, en input node (DNA skade), to output knudepunkter (apoptose og cellulære aldring) og 738 kanter. Aktivering og hæmning forbindelser er repræsenteret ved blå og røde pile hhv. Input node var præget af grøn; knudepunkterne opstrøms for p53 var præget af gule; p53 og MDM2 var præget af rød, blev knudepunkter nedstrøms for p53 præget af lyseblå og output knudepunkter var præget af orange.

Vi beregnede konnektivitet graden af ​​de 206 noder i netværket (figur 3). Konnektivitet grad af et gen angiver antallet af interaktioner for dette gen. Den mest forbundet gen var p53, som deltog i 225 interaktioner i PKT206 model. Der var 30 gener med tilslutningsmuligheder grad mellem 10 og 100, og de resterende gener var involveret i mindre end 10 interaktioner

Graden fordeling af 206 knuder i modellen blev opnået ved NetworkAnalyzer plugin til Cytoscape.; begge akser i figuren er i logaritmisk skala.

Netværket indeholder 30 to-trins feedback-sløjfer i alt, med 14 involverer p53. Nogle af dem spiller en væsentlig rolle i p53 regulering; for eksempel løkker feedback involverer p53, MDM2 og MDM4 (Mdm4 p53 protein homolog (mus)), som omfatter fem interaktioner: p53 aktiverer MDM2; MDM2 hæmmer p53; MDM2 hæmmer MDM4; MDM4 aktiverer MDM2 og MDM4 hæmmer MDM2 [24]. Tilbagekoblingssløjfer spiller en afgørende rolle i p53 regulering og menes at forøge robustheden af ​​systemet som reaktion på perturbationer [25].

P53 er blevet impliceret i talrige cellulære reaktioner på stress, herunder IR (ioniserende stråling), UV, onkogen aktivering, og hypoxi. For denne model til at kunne forudsige cellulær skæbne som reaktion på stress, vi knyttet 20 knudepunkter til indgangssignalet DNA-skade (tabel S3 i File S1). De fleste af de links fra DNA-skader er aktiveringer og kun 3 er hæmninger (DNA skader hæmmer PTTG1 (hypofyse tumor-omdanne en), MYC (v-myc, myelocytomatosis viral onkogen homolog (aviær)) og AURKA (aurora kinase A). Tilsvarende , p53 kontrol talrige cellulære reaktioner på stress, såsom cellecyklusstop, DNA skader reparation, ældning og apoptose. Vi fandt 95 forbindelser mellem downstream gen noder og apoptose og 77 knudepunkter interagere med apoptose node. Blandt dem, 18 knuder både fremmes og forebygges apoptose, 38 knuder kun induceret apoptose og 21 knuder havde kun anti-apoptotiske funktion. Vi fandt 52 ​​gener er forbundet med ældning af 61 links, hvoraf 28 fremmer og 33 forhindrer ældning.

Analyse af afhængigheder i p53 model

Logiske afhængigheder mellem gener /proteiner er repræsenteret ved afhængigheden matrix [14], som repræsenterer effekter mellem alle par af knuder i modellen. Seks typer af effekter defineres af CellNetAnalyzer baseret på eksistensen (eller ikke ) af positive og negative stier mellem to knuder: ingen effekt, ambivalent faktor, svag inhibitor, svag aktivator, stærk inhibitor, og stærk aktivator (se Metoder til detaljer). Der er 42.436 (206 × 206) elementer i afhængighed matrix, hvoraf 23.468 svarer til interaktioner har ingen effekt; 16.540 er ambivalente faktorer; 1100 er svage hæmmere; 1240 er svage aktivatorer; 33 er stærke hæmmere og 55 er stærke aktivatorer (tabel S6 i File S1). De fleste af afhængighed matrix elementer er ingen effekt eller ambivalente faktorer. Det store antal ambivalente forhold skyldes kompleksiteten af ​​regulatoriske effekter mellem knudepunkter, som påvirkes af både positive og negative feedback-loops og veje. For eksempel er der både positive og negative stier fra ATM til CHEK2: den positive vej er en direkte aktivering af CHEK2 via ATM, medens den negative sti er en indirekte hæmning, som ATM aktiverer p53, p53 inhiberer MYC, MYC aktiverer E2F1 (E2F transskriptionsfaktor 1), og E2F1 aktiverer CHEK2. Som et resultat er interaktionen mellem disse to knudepunkter bestemt ved modstående aktivering og inhibering virkninger, hvilket resulterer i det, der betegnes som ambivalent (Figur S5 i File S1).

I silico

simulering af mutation effekter

for at vurdere kapaciteten af ​​PKT206 model til at forudsige forstyrrelse effekter, vi udførte

i silico

knock-out test, hvor en bestemt knude blev fjernet fra nettet og dermed efterligne in vivo mutation virkninger. Som 85% af gener eller proteiner i PKT206 modellen dårligt var tilsluttet, blev p53 og de 30 gener med mere end 10 interaktioner udvalgt til at udføre

i silico

knock-out test. For eksempel har vi simulerede en p53 knock-out ved at fjerne p53 node fra netværket og undersøge virkningerne af denne forstyrrelse. Ved at sammenligne afhængighed matrix efter p53 node blev fjernet med vildtype tilfælde, ændringer i matrix elementer afslørede, hvordan relationer mellem knuder blev ramt af sletningen. 11.785 ud af de 42,025 (205 × 205) elementer i matricen ændret som følge af p53 fjernelse (figur 4A). Større ændringer er anført i tabel S7 i File S1. De væsentligste ændringer var fra ambivalente faktorer til aktivatorer eller inhibitorer, hvilket afspejler, at p53 spiller en stor rolle i modulering ordningens virkninger. 11 ud af 31

i silico

knock-out test havde store ændringer i den nye afhængighed matrix, når en bestemt node blev fjernet (tabel S6 i File S1). 63 potentielle forudsigelser af større ændringer i afhængighed celler blev opnået fra dem 11

i silico

knock-out test (tabel 1). Der var ingen større effekt ændringer findes i de øvrige 20

i silico

knock-out test.

(A) Fordeling af ændringer i afhængighed matrix af p53

i silico

knock-out sammenlignet med vildtypen. Det grå cyklus repræsenterer ingen effekt elementer, den orange cirkel repræsenterer ambivalente faktorer, den lysegrønne cirkel repræsenterer svage aktivatorer, den lyserøde cirkel repræsenterer svage hæmmere, den mørkerøde cirkel repræsenterer stærke hæmmere, og den mørke grønne cirkel repræsenterer stærke aktivatorer; retningen af ​​pilen repræsenterer retningen af ​​ændringer i knock-out. (B) Chk1 (CHEK1) aktivering øges i p53 negativ baggrund. U2OS celler, der har funktionelt p53 og SaOS2 celler, som mangler funktionel p53 blev behandlet med 10 pM etoposid i 16 timer. Celleekstrakter blev analyseret ved SDS PAGE og western blot-analyse under anvendelse af antistoffer mod total Chk1, ATR og ATM. ATM og ATR phosphoryleret Chk1 ved Ser 345.

Vi bekræftede 4 ud af disse 63 forudsigelser gennem litteratursøgning med fokus på større ændringer forårsaget af p53 sletning, der forventedes at have stærkere eksperimentelle effekter . For eksempel er effekten af ​​DNA-skade på FAS (Fas (TNF-receptor-superfamilien, medlem 6)) ændres fra en ambivalent faktor i p53 vildtype-model til en stærk aktivator når p53 blev fjernet. Virkningen af ​​DNA-skader på FAS blev klassificeret som ambivalent i vildtypeceller, fordi der er potentielle negative stier fra DNA beskadigelse FAS gennem MYC og PTTG1, foruden en direkte positiv sti fra DNA beskadigelse FAS. Når p53 slettes, kun den positive vej kapitalinteresse. Manna et al. har fastslået, at i p53 minus celler, Fas protein niveauer forhøjede under DNA skade i forhold til p53 vild type celler, som er i overensstemmelse med vores forudsigelse [26]. I lighed med FAS, virkningen af ​​LATS2 (LATS, stor tumor suppressor, homolog 2 (Drosophila)) på apoptose blev ændret fra en ambivalent faktor i p53 vildtype-model til en stærk aktivator når p53 blev fjernet. Det blev konstateret, at i både p53 vildtype (A549) og p53 minus celler (H1299), LATS2 kunne inducere apoptose og at apoptose forøges en smule i H1299 målt ved PARP og caspase 9 spaltning [27]. Vi observerede, at virkningen af ​​DNA-skade på CHEK1 (checkpoint kinase 1) ændres fra en ambivalent faktor i p53 vildtype til en stærk aktivator når p53 blev fjernet. CHEK1 proteinniveauer blev fundet at være højere i p53 – /- celler end i p53 + /+ HCT116 kolorektal cancer celler behandlet ved daunorubicin [28], som også matcher vores forudsigelser (tabel 1). Det blev rapporteret, KLF4 (Kruppel-lignende faktor 4 (tarm)) forårsagede mere reduktion af CCNB1 (cyclin B1) ekspression i p53 – /- HCT116 end i p53 + /+ HCT116 celler [29], og det matches vores model forudsigelse. Imidlertid blev en forudsigelse ud af de 63 forudsigelser findes modsat nævnte litteratur beviser. Forudsigelsen påpegede, at IFNA1 (interferon, alfa 1) øget TLR3 (toll-like receptor 3) i p53 mutantceller sammenlignet med p53 vildtypeceller. Men dette var overfor det faktum rapporteret af Taura et al. at IFNA1 udsat for DNA-ødelæggende lægemiddel 5-fluor-uracil (5-FU) reducerede ekspressionen af ​​TLR3 i p53 – /- HCT116 celle sammenlignet med p53 + /+ HCT116-celler [30]

Ud. til litteratur baseret validering, opnåede vi

in vitro

baseret eksperimentelle beviser til støtte nye forudsigelser af modellen. Modellen forudsagde, at i mangel af funktionel p53, virkningerne af ATM og ATR (ataksi telangiectasia og Rad3 relateret) på CHEK1 ville både ændring fra ambivalente forhold til stærke aktivatorer. En Western blot analyse af U2OS humane osteosarkomceller, der har vildtype p53, og af SaOS2 celler, der har mutant ikke-funktionel p53, påviste, at CHEK1 aktiveres i højere grad i p53 mutanten baggrund end i p53 vildtype-baggrund (figur 4B) validering denne forudsigelse. Endvidere blev højere niveauer og potentiale aktivering af ATM og ATR kinaser observeret i p53 minus celler end i p53 positive celler. Ifølge modellen, der er både positive og negative stier mellem ATM, ATR, CHEK1, og p53 i vildtype celler, og derfor i p53 mutantceller denne balance forstyrres (figur 5). Dette bekræfter den prædiktive evne vores modellering tilgang og har konsekvenser for behandling af p53 negative tumorer

(A) Positive og negative veje fra ATM /ATR til CHEK1 i p53 vild type celler som kendt fra litteraturen undersøgelse.; (B) Positive og negative veje fra ATM /ATR til CHEK1 i p53 minus celler. ARF er cyclin-afhængig kinase inhibitor 2A. PPM1D er proteinphosphatase 1D. pRB er retinoblastoma 1.

Logisk steady state analyse

p53-protein er kendt for at bevare genomisk stabilitet og fraværet af p53 fører til cellulær proliferation som respons på DNA-skade [31] . Fraværet af genetiske stabilitet udløser akkumulering af mutationer i normale celler og forårsager cancer [32]. For at undersøge, hvordan en sådan tab af stabilitet kunne opfanges af vores model, vi foretaget en sammenlignende logisk steady state analyse i p53 vildtype-model og

in silico

p53 knock-out.

i en logisk steady state (LSS), tilstanden af ​​hver node forbliver den samme over tid [33]. Hver node kan have tre forskellige tilstande: inaktiveret ( “0”), aktiveret ( “1”) eller ubestemt ( “NaN”). Vi undersøgte fire scenarier for logisk steady state analyse: (1) DNA-skade aktiveres i p53 vildtype baggrund; (2) DNA-skade er ikke aktiveret i p53 vildtype baggrund; (3) DNA-skader er aktiveret i p53 knock-out baggrund; (4) DNA-skade er ikke aktiveret i p53 knock-out baggrund (figur 6, tabel 2 og tabel S8 i File S1). Sammenligningen af ​​logiske stationære tilstande i forskellige scenarier viste, at et stort antal node stater ikke ændredes med den ændring af indgangssignalet. Dette resultat kan forklares ved det store antal ambivalente virkninger mellem noder og feedback loops i netværket, som gør modellen robust indtaste signal forstyrrelser. Andelen af ​​bestemte tilstande var 181 ud af 206 knudepunkter (87,9%) i scenario (1), 182 ud af 206 knudepunkter (88,3%) i scenariet (2), 94 ud af 205 knudepunkter (45,9%) i scenario (3) og 95 ud af 205 knudepunkter (46,3%) i scenariet (4) (tabel 2). Disse tal viser, at næsten halvdelen af ​​de knuder, hvis tilstand bestemmes i vildtype, bliver ubestemt i

i silico

p53 knock-out.

De noder med staten “1” var repræsenteret i grøn blev noder med staten “NaN” (u fastlagt) repræsenteret i orange, og noder med statens “0” var repræsenteret med rødt. (A) P53 vildtype når DNA-skader var “ON”; (B) P53 vildtype når DNA-skader var “OFF”; (C) P53 mutant, da DNA-skader var “ON”; (D) P53-mutant, når DNA-skader var “OFF”.

Sammenligning tilstand 202 gener, som vekselvirker med p53 i p53 vildtypeceller i nærvær af DNA-skader, og dem i p53 mutantceller i tilstedeværelsen af ​​DNA-skader, fandt vi, at kun 29 gener var opreguleret, havde 113 gener ikke ændre og 60 gener blev nedreguleret (tabel 3). Ændringen af ​​FEN1 (flap struktur-specifikke endonuklease 1) stat blev i øvrigt eksperimentelt verificeret af Christmann et al, ved at finde, at FEN1 blev undertrykt i p53 nul celler under DNA-skader [34]. TLR3 viste sig at være nedreguleret i p53 mutant celler under DNA-skader [35].

Sammenligning tilstanden af ​​disse 202 gener i p53 vild type celler i fravær af DNA-skader og dem i p53 mutante celler i fravær af DNA-skade (tabel 3), fandt vi, at 30 gener var opreguleret, 112 gener forblev de samme og 60 gener blev nedreguleret i p53 vildtypeceller i fravær af DNA-skade. Ændringen af ​​6 knuder blev verificeret ved O’Prey et al. [36]. 4 knudepunkter blev påvist som korrekte forudsigelser: ekspressionsniveauerne af FAS (TNF-receptor superfamilien, element 6), TNFRSF10B (tumornekrosefaktor-superfamilien, 10b), PERP (PERP, TP53 apoptose effektor) og p53AIP1 (tumor protein p53 reguleres apoptose inducerende protein 1), blev nedreguleret fra p53 vild type celler uden DNA skader på p53 mutant celler uden DNA-skader, mens andre 2 knuder MDM2 og CDKN1A blev forudsagt som uændret ved model simulering. Imidlertid O’Prey et al. observerede deres nedregulering fra p53 vild type celler uden DNA-skader til p53 mutant celler uden DNA-skader [36]. Ifølge kriterierne i afsnittet metoder, fire forudsigelser var korrekte og de andre to var små fejl forudsigelser.

Sammenligning tilstanden af ​​disse 202 knuder i p53 vild type celler i tilstedeværelsen af ​​DNA-skader og disse knuder i p53 vildtype celler i fravær af DNA-skade (tabel 3), konstaterede vi, at kun 5 gener var opreguleret, 185 gener blev ikke ændret og 12 gener blev nedreguleret i p53 vildtype celle induceret af DNA-skade.

Sammenligning tilstanden af ​​disse 202 knuder i p53 mutant celler i nærvær af DNA-skader og de knuder i p53 mutant celler i fravær af DNA-skader (tabel 3), fandt vi, at 7 gener var opreguleret, 181 gener forblev den samme og 14 gener blev nedreguleret i p53 mutant celler induceret af DNA-skade. Sammen disse ovennævnte resultater afspejler, at p53 bidrager til at stabilisere systemet.

Ændringerne i tilstand af anti-apoptotiske og anti-senescens gener er vist i tabel S9 i File S1 og de af pro-apoptotisk og pro-senescens gener er anført i tabel S10 i File S1. Denne fordeling illustrerer grunden til, at apoptose output blev også aktiveret i p53 mutantceller. Størstedelen af ​​disse 56 pro-apoptotiske gener og 39 anti-apoptotiske gener blev ikke ændret i den samme type celler behandlet med DNA-beskadigelse. Fraværet af p53 forårsaget åbenlyse ændringer af både pro-apoptotiske og anti-apoptotiske gener, når cellerne blev behandlet med DNA-beskadigelse. Antallet af pro-apoptotiske og anti-apoptotiske gener, som var opreguleret eller nedreguleret forøget med udtømning af p53. Blandt disse 56 pro-apoptotiske gener, FAS og p53AIP1 opreguleret i p53 mutantceller, når de behandles ved DNA-beskadigelse. FGF2 (fibroblastvækstfaktor 2 (basic)) havde både pro-apoptotisk og anti-apoptotiske funktion i PKT206 modellen og det blev nedreguleret i p53 vildtypeceller eller p53 mutantceller i nærvær af DNA-skader. Især blev IGF1R (insulin-lignende vækstfaktor 1 receptor) og PDGFRB (blodpladeafledt vækstfaktorreceptor, beta polypeptid) opreguleret i p53 minus scenarier, som sammen med FGF2 ændringer fremhævet vækstfaktormedieret signalveje så vigtig faktor, der bidrager til overlevelse disse tumorer.