PLoS ONE: overekspression af ATP5J Gene korrelerer med Cell Migration og 5-fluoruracil Følsomhed i kolorektal Cancer

Abstrakt

For nylig fandt vi, at

ATP5J

blev overudtrykt i vævsprøver fra patienter med colorectal cancer. Den kliniske betydning og funktion af overekspression af

ATP5J

hos disse patienter er fortsat uklart. Vi undersøgte disse spørgsmål i den aktuelle undersøgelse. Vores resultater viste, at ekspressionen af ​​

ATP5J

var signifikant højere i kolorektal cancer væv end i tilstødende væv, og det var også signifikant højere i metastatiske lymfeknuder end i den primære kræftvæv (

P

0,05). En korrelation mellem

blev opdaget ATP5J

udtryk og tumor differentiering, men ingen sammenhæng med køn, alder, T scenen, lymfeknude metastaser, eller overlevelse status blev observeret. Nedregulering af

ATP5J

ekspression svækkede evne cellemigrering og øget følsomhed over for 5-fluoruracil (5-FU) i celler af DLD1 cellelinje. Omvendt opregulering af

ATP5J

udtryk forbedret celle migration og faldt 5-Fu følsomhed, hvilket tyder på, at funktionen af ​​ATP5J i kolorektal cancer kan indebære celle migration og 5-Fu følsomhed.

Henvisning : Zhu H, Chen L, Zhou W, Huang Z, Hu J, Dai S, et al. (2013) Over-Angivelse af

ATP5J

Gene korrelerer med Cell Migration og 5-fluoruracil Følsomhed i kolorektal cancer. PLoS ONE 8 (10): e76846. doi: 10,1371 /journal.pone.0076846

Redaktør: Jun Li, Sun Yat-sen University Medical School, Kina

Modtaget: Februar 18, 2013; Accepteret: August 31, 2013; Udgivet: 4 okt 2013

Copyright: © 2013 Zhu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Natural Science Foundation of China (30700970 og 81272681), de grundlæggende forskningsmidler for de centralasiatiske universiteter og Program for Innovativ Research Team i Zhejiang-provinsen (2010R50046). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Tyktarmskræft er den anden mest almindelige kræftform i USA og andre udviklede lande [1,2], og forekomsten er stigende år for år i udviklingslandene [3,4]. Som vi ved, carcinogenese og udvikling af kolorektal cancer omfatter en række komplicerede processer dem involverer flere gener og trin. Selv om en voksende mængde af gener er blevet rapporteret i litteraturen [5-7], søgen efter nye gener, der kunne være knyttet til carcinogenese, udvikling, diagnose eller behandling af kolorektal cancer fortsætter. Derfor søgte vi Sage databasen og bekræftede gen kandidater af interesse ved revers transkription polymerasekædereaktion (RT-PCR). I sidste ende, vi identificeret et gen,

ATP5J

, der var over-udtrykt i kolorektal cancer.

En del af F

0, ATP5J er et protein placeret i mitokondrierne, der er et lipid-opløselige del af ATP-synthetase [8]. Forstadiet af ATP5J består af 108 aminosyrer og det vil blive klippet af 32 aminosyrer [9]. Produktet indeholder de resterende 76 aminosyrer tilbageholdes i mitokondrierne for energioverførsel [9]. Traditionelt ATP5J har været tænkt til at inddrive udvekslingen mellem uorganisk phosphor og ATP samt aktiviteten af ​​ATPase, der inhiberes af oligomycin [10]. Nyere forskning har imidlertid vist, at ATP5J udførligt fordeles på overfladen af ​​vaskulære endotelceller [11,12]. Derfor kan det også udskilles i blodet og rundsendes at kombinere med β-underenheden af ​​ATP synthetase placeret på overfladen af ​​vaskulære endotelceller. Efterfølgende kan aktiviteten af ​​phospholipase A2 inhiberes ved aktivering af den tilknyttede signalvej, som vil blive fulgt ved inhibering af syntesen af ​​prostaglandin, der fremmer vasokonstriktion [12]. Recenetly har nogle litteratur viser, at

ATP5J

gen overudtrykkes i en række cancere, herunder renalcellecarcinom og hepatocellulært carcinom [13,14]. Men funktionen af ​​overudtrykt

ATP5J

i kræft endnu ikke blevet dokumenteret.

Ifølge indførelsen af ​​det humane protein ATLAS (https://www.proteinatlas.org/ENSG00000154723 /normal), kan ATP5J protein udtrykkes i mange normale væv eller organer, herunder colon og rectum. Vores foreløbige data bekræftede også dette fænomen. Endnu vigtigere, viste vores data, at

ATP5J

blev overudtrykt i kolorektal cancer sammenlignet med normalt væv. Formålet med den aktuelle undersøgelse var at undersøge den kliniske betydning og funktion af overekspression af

ATP5J

i kolorektale cancerceller. Vores resultater viste, at

ATP5J

blev overudtrykt i vævsprøver fra patienter med kolorektal cancer, og at der var en sammenhæng mellem

ATP5J

udtryk og tumor differentiering. Desuden overekspression af

ATP5J

forbedret celle migration og induceret resistens mod 5-fluorouracil (5-FU) i de kolorektale cancerceller.

Materiale og metoder

Samling af friske vævsprøver

Denne undersøgelse blev godkendt af Sir køre køre Shaw hospital og Zhejiang University etiske komité (NO.20100823). Friske kræft vævsprøver blev opnået direkte fra driften eksemplarer af 72 på hinanden følgende patienter, der havde gennemgået kirurgiske resektioner for primære sporadiske kolorektale adenokarcinomer ved Institut for kolorektal kirurgi, Sir køre køre Shaw Hospital, Hangzhou, Zhejiang, Kina, fra september 2010 og marts 2011 . skriftligt informeret samtykke til væv samling opnåedes fra alle patienter før deres kirurgiske procedurer. Ingen af ​​disse patienter havde haft nogen præoperative kemoterapi eller strålebehandling. De tilstødende væv blev indsamlet fra mere end 5 cm fra kræft væv.

Patienter og klinisk dataindsamling

Paraffinsnit af prøver fra i alt 79 patienter med intakte kliniske data, der blev diagnosticeret med colorectal cancer mellem juli 2006 og juni 2007 vores hospital blev indsamlet til immunhistokemisk farvning. Den gennemsnitlige opfølgning af disse patienter var 52,6 måneder, og den samlede overlevelse var 73,4% ved sidste opfølgning. Blandt disse 79 tilfælde blev cancervævet og relative normalt tilstødende væv par undersøgt i 51 tilfælde, og vævsprøver fra metastatiske lymfeknuder blev undersøgt i 26 tilfælde. Alle sektioner blev forberedt til immunhistokemi på slides, der blev brugt til at sammenligne

ATP5J

udtryk mellem forskellige væv.

Celler og cellekultur

menneskelige kolon kræft cellelinjer DLD1, RKO, SW620, SW480, og Colo320 blev købt fra Institut for Cell Research i Shanghai, Kina. Den normale human fibroblast cellelinje (NHFB) blev opnået fra Global Bioresource center-American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Cellerne blev holdt i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) suppleret med 10% (vol /vol) varmeinaktiveret kalvefosterserum (FBS), 1% glutamin og en 1 × antibiotisk-antimycotisk blanding (Invitrogen, Beijing Office, Beijing , Kina). Alle celler blev dyrket ved 37 ° C i en fugtig inkubator indeholdende 5% CO

2 og vil blive anvendt til RT-PCR-analyse. Desuden ville DLD1 samt SW620 celler efterfølgende anvendes til en række andre eksperimenter.

Reverse transcription PCR

De friske vævsprøver på 100 ug blev homogeniseret under anvendelse af en mølle med flydende nitrogen efterfulgt af lyse med TRIZOL reagens (Invitrogen Beijing Office, Beijing, Kina). Dyrkede celler, der er nævnt som ovenfor, blev direkte lyseret under anvendelse TRIZOL-reagens efter behandlingen. RNA blev ekstraheret i overensstemmelse med producentens anvisninger. Et mikrogram RNA fra hver prøve blev revers-transkriberet til cDNA under anvendelse af vilkårlige hexamerer som revers transkription-primere (Applied Biosystems Shanghai Office, Shanghai, Kina). Så den typiske polymerasekædereaktion (PCR) for

ATP5J

gen blev udført. Den menneskelige

GAPDH

genet blev anvendt som en intern kontrol for normalisering af mRNA beløb. Sekvenserne for primerne var som følger: 5′-TCAGCCGTCTCAGTCCATTT-3 ‘og 5′-CCAAACATTTGCTTGAGCTT-3’ for

ATP5J

; 5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3 ‘og 5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’ for

GAPDH

.

immunhistokemisk farvning

Immunfarvning blev udført ved hjælp af en MaxVision kit (Maixin Biol, Fuzhou , Kina). Kort fortalt blev 4-um-tykke snit skåret fra formalinfikserede, paraffinindlejrede vævsblokke, monteret på polylysin belagt objektglas, afvokset i xylen og rehydreret gennem en gradueret række af ethanol løsninger. Efter afparaffinering blev objektglassene behandlet med 3% hydrogenperoxid i methanol-opløsning i 10 minutter for at standse endogen peroxidaseaktivitet blev derpå antigen-hentning behandling udført ved 121 ° C (autoklav) i 5 minutter i 10 mM natriumcitratbuffer (pH 7,4) . Uspecifikke bindinger blev blokeret ved behandling objektglas med 10% normalt gedeserum i 10 minutter. Derefter blev objektglassene inkuberet med ATP5J antistof (Cell Applications, San Diego, CA, 1: 8000 fortynding) natten over ved 4 ° C. Derefter blev objektglassene inkuberet med en dråbe MaxVision reagens i 30 minutter ved stuetemperatur. Farveudvikling blev udført under anvendelse 0,05% diaminobenzidin og 0,03% hydrogenperoxid i 50 mM Tris-HCI, pH 7,6, i 5 minutter. Endelig blev objektglassene kontrastfarvet med 1% Meyers hematoxylin. Som en negativ kontrol blev vævssnit behandlet med normalt serum i stedet for ATP5J antistof.

Evaluering af farvning

Alle snit blev scoret blindt under et lysmikroskop. Celler med tydelig struktur og brun-gule granulat, der var højere end baggrunden blev betragtet som positive; ellers blev celler betragtes som negative. For hvert dias blev 5-10 stor forstørrelse felter (× 400) undersøgt. Derefter blev objektglassene scoret efter procentdelen af ​​positive celler: 0 ( 5%), 1 (5-25%), 2 (26-50%), 3 (51-75%) eller 4 (76- 100%). Samtidig blev objektglassene scoret efter farvningsintensitet: 1 (yellowy), 2 (brun-gul), eller 3 (brun) [15]. Det endelige resultat blev beregnet som summen af ​​disse to scoringer.

Western blot-analyse

Cellerne blev vasket med koldt PBS og underkastet lysis i Laemmlis lysisbuffer. Lige mængder af lysat blev separeret ved anvendelse af 10% natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) og derefter overført til Hybond forøget kemiluminescens (ECL) membraner (Amersham Bioscience, England). Membraner blev derefter blokeret med PBS-puffer indeholdende 5% fedtfattig mælk og 0,05% Tween-20 i 1 time eller natten over ved 4 ° C, vasket tre gange med PBS indeholdende 0,05% Tween-20 (PBST) og inkuberet med ATP5J antistof i mindst 1 time ved stuetemperatur. Efter at være blevet vasket med PBST igen blev membranerne inkuberet med peroxidase-konjugeret sekundære antistoffer og udviklet med en kemiluminescensdetektion kit (ECL kit, Amersham Bioscience, England). Kanin-anti-humant ATP5J antistof blev købt hos Cell Applications. β-actin blev anvendt som en belastning kontrol.

Konstruktion af plasmidet udtrykke

ATP5J

En pOTB7 plasmid indeholdende

ATP5J

sekvens blev købt fra Invitrogen (Clone ID 3.357.779).

ATP5J

sekvens blev klonet ind i en p △ E1sp1A plasmid hjælp EcoRI /XhoI enzymer. Derefter blev yderligere fordøjet og klonet ind i en pcDNA3.1 (+) plasmid hjælp BamHI /HindⅢ enzymer til at få en ny plasmid navngivet pcDNA3.1 (+) /ATP5J. Efter ekspressionen af ​​

ATP5J

blev bekræftet, var dette nye plasmid anvendt til den næste del af undersøgelsen.

Cell transfektion og stabil koloniselektion

Til transfektion blev celler udpladet i 24-brønds plader ved en densitet på 1×10

5 celler per brønd og lodes vokse natten over til 90-95% konfluens. Den næste dag blev cellerne transficeret med blandingen af ​​0,8 ug ATP5J shRNA plasmid (Origene, USA), pcDNA3.1 (+) /ATP5J plasmidet eller negativ kontrol-plasmid (Origene, USA) plus 2 pi Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) i 100 pi serumfrit medium ifølge producentens anvisninger. At producere stabilt transficerede celler efter transfektion med den tilsvarende plasmid, blev 10 pg /ml puromycin (Roche, Mannheim, Tyskland) ved 48 timer tilsat til mediet (DMEM + 15% FBS). Cellerne blev efterladt i selektivt medium i 2 uger; efter dette tidspunkt blev de trypsiniseret og gendyrket i selektivt medium til formering.

Cell levedygtighed assay

Cell levedygtighed blev bestemt ved anvendelse af en MTT assay (3- (4,5 dimethylthiazol-2-yl) -2 , 5 diphenyltetrazoliumbromid, Sangon, Shanghai, Kina). Kort beskrevet blev celler (5×10

3 per brønd) udsået i 96-brønds plader til observation på en række tidspunkter. Derefter 100 pi MTT-opløsning (10 mg /ml) blev tilsat til hver brønd, og inkubation blev fortsat i 4 timer før mediet blev fjernet. Dernæst blev 100 pi dimethylsulfoxid (DMSO) anvendes til hver brønd i yderligere 10 minutter. Endelig er værdien af ​​OD

570 nm blev bestemt; Denne værdi repræsenterer cellernes levedygtighed. Hvert forsøg blev udført i fire eksemplarer og blev gentaget mindst to gange.

Cell klongenicitetsassayet

1000 celler blev dyrket i 10 cm skåle med normal dyrkningsmedium i en inkubator indeholdende 5% CO

2 ved 37 ° C i 14 dage. Individuelle kolonier ( 50 celler pr koloni) blev fikseret og farvet med en opløsning indeholdende 0,25% krystalviolet farvning og 20% ​​ethanol i 20 minutter. Kolonierne blev talt under anvendelse af Optimas software (Media Cybernetics LP, Silver Spring, MD, USA). Hvert eksperiment blev udført tre gange og blev gentaget to gange.

flowcytometriassayet

Celler blev trypsinbehandlet og vasket en gang med kold PBS. Derefter blev cellerne fikseret med kold 70% ethanol natten over ved 4 ° C. Tredive minutter før de blev analyseret, blev propidiumiodid (PI) farvning udført som tidligere [16-18] beskrevet. Flowcytometri analyser blev udført i Core Lab på Sir køre køre Shaw Hospital.

sårheling assay

Cell migration blev undersøgt ved hjælp af en ridse sår-helende assay. Celler (5×10

5 per brønd) blev podet i seks-brønds plader og fik lov til at klæbe i 24 timer. Cellerne blev behandlet med 10 ug /ml mitomycin C (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) i 3 timer, vasket med PBS, derefter blot såret med en pipettespids. Frisk fuld medium blev tilsat, og cellerne fik lov til at lukke såret i 48 timer eller mindre. Fotografier af samme sår position blev udtaget på tilsvarende tidspunkter. Eksperimentet blev udført tre gange.

cellemigrationsassay

Celler blev trypsinbehandlet og resuspenderet i DMEM indeholdende 1% FBS ved en densitet på 1×10

6 celler /ml. I alt blev 100 pi af cellesuspensionen udplades på en 24-brønds Transwell (Costar, Corning, NY). DMEM (600 pi) indeholdende 10% FBS blev anbragt i det nedre kammer. Efter inkubation i 24 timer blev cellerne tilbage i det øvre kammer fjernes forsigtigt med en vatpind, og membranen blev skåret under anvendelse af et operativsystem kniv. Den side der vender det nedre kammer blev farvet med 0,05% krystalviolet farvning, og de vedhæftede celler blev talt under et lysmikroskop. Forsøget blev gentaget tre gange.

Statistisk analyse

Sammenhæng mellem

ATP5J

udtryk og kliniske funktioner blev vurderet ved hjælp af korrelationsanalyse, og forskelle mellem grupperne blev vurderet ved hjælp af Wilcoxon matchet-pair test eller ved ANOVA under anvendelse SPSS15.0 software (SPSS, Inc., Chicago, USA).

P

0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

ATP5J

var overudtrykt i kliniske kolorektal cancer væv

I Sage-databasen (http:. //cgap.nci.nih.gov/SAGE/AnatomicViewer), søgte vi efter en række kandidatgener disse blev udtrykkes forskelligt i kolorektal cancer. Flere interessante gener blev identificeret, herunder tetraspanin TM4-C, oligophrenin en, ATP5J, transmembrane glycoprotein A33 forløber, DHRS9, cytidindeaminase, uroguanylin, og dual-specificitet fosfatase 1. Men vores primære resultater fra RT-PCR viste, at kun uroguanylin var reduceres, og at

ATP5J

var overudtrykt i kolorektal cancer (figur 1A). De andre gener var uændrede eller uopdaget i vores eksperiment (data ikke vist). Fordi udtryk for uroguanylin og dets funktion i tyktarmskræft er afklaret i en tidligere rapport [19], men ikke for det

ATP5J

gen, sidstnævnte blev valgt som den unikke mål i vores undersøgelse.

(A) RT-PCR resultater for

ATP5J

og

uroguanylin

gener. (B) immunhistokemisk farvning resultater for tilstødende væv og kræftvæv. (C) immunhistokemisk farvning resultater for tilstødende væv, kræftvæv, og metastatisk lymfeknude væv.

For at bekræfte ekspressionen af ​​

ATP5J

i kolorektal cancer, vi analyseret yderligere udtryk for

ATP5J

mRNA ved RT-PCR i friske tumorvæv og tilstødende normale væv fra de 72 konsekutive patienter (tabel 1). Resultaterne indikerede, at positive procenter af RT-PCR for

ATP5J

i væv fra patienter med tyktarmskræft nåede ca. 54,17%, hvilket var ens mellem tyktarmskræft og endetarmskræft. , Udtryk for

ATP5J

var imidlertid betydeligt højere i kolorektal cancer væv end i normalt væv blandt PCR-positive patienter (tabel 1,

P

0,01). Vores immunohistokemisk farvning resultater fra paraffinsnit af yderligere 51 patienter nævnt i

Patienter og kliniske data indsamling

sektion angivet et lignende resultat, men med en højere positivt forhold (figur 1B og tabel 1,

P

0,05). Yderligere immunfarvning resultater viste også, at

ATP5J

udtryk var signifikant højere i metastatiske lymfeknuder end i den primære cancer væv (Figur 1C og tabel 2,

P

0,05).

ATP5J tilstand

Case NO.

Positive tilfælde

Positive tilfælde «fordeling af ATP5J udtryk i tumor vs. tilstødende væv

P Drømmeholdet værdi Vejviser T

* A

*

T = A

T En

mRNA ved PCR7239 (54,2%) 32 (82,1%) 6 (15,4%) 1 (2,6%) 0.01Protein ved IM

* 5149 (96,1%) 32 (65,3%) 15 (30,6%) 2 (4,1%) 0.05Table 1. betingelse af ATP5J udtryk i kolorektal tumor og tilstødende væv

* T:. tumor; A: tilstødende; . IM: immunhistokemisk farvning CSV Hent CSV ATP5J i MLN

*

Case NO

MLN T

MLN = T

MLN T

P Drømmeholdet værdi

Positive25 (96,2%) 12 (46,2%) 8 (30,8%) 5 (19,2%) 0.05Negative1 (3,8%) – 1 (3,8%) tabel 2. betingelse af ATP5J udtryk i kolorektal tumor og metastatisk lymfeknuder noder

* MLN:. metastatisk lymfeknuder CSV Hent CSV

sammenhæng mellem overekspression af

ATP5J

og kliniske træk ved patienter med colorectal cancer

for at analysere forholdet mellem mere end -expression af ATP5J og kliniske patologiske karakteristika kolorektal kræftpatienter, paraffinsnit fra 79 patienter, som nævnt i afsnit af

patienter og klinisk dataindsamling

, blev indsamlet. Immunhistokemisk farvning blev udført på disse objektglas og scorerne blev beregnet som nævnt ovenfor. Ifølge disse scoringer,

ATP5J

udtryk kan yderligere opdeles i to rækker: svag (≤4) og stærk ( 4). Derefter korrelationsanalyse blev udført under anvendelse af SPSS software; resultaterne blev vist i tabel 3. Blandt de anførte kliniske funktioner, kun graden af ​​differentiering havde en sammenhæng med

ATP5J

udtryk. Køn, alder, T scenen, lymfeknude metastaser, samt overlevelse status viste ikke en sammenhæng med

ATP5J

udtryk. Disse resultater viste, at

ATP5J

udtryk i godt differentierede tumorer var svagere end i dårligt eller moderat differentierede tumorer (

P

0,05).

Variabel

Case NO

Svag

Stærk

P Vaule

GenderFemale358270.281Male441529Age 65 yr286220.271≤65511734T stageT1,2196130.789T3,4601743DifferentiationWell4116250.045Poor /moderate38731Histologic LNM

* Absent3612240.408Present431132Survival statusSurvival5818400.538Died21516Table 3. Sammenhæng mellem ATP5J udtryk og patients’clinical funktioner

* LNM:. lymfeknudemetastaser CSV Hent CSV

Påvisning af

ATP5J

udtryk i colon cancer cellelinjer

det var vanskeligt at klarlægge underliggende funktion af ATP5J i kolorektal cancer afhænger kun på de kliniske analyser. Flere molekylærbiologiske undersøgelser var nødvendige til dette formål. Derfor blev vores opmærksomhed flyttet fra kolorektal kræftpatienter til celle linjer. For at forstå ekspressionen af ​​

ATP5J

i kolorektale cancercellelinjer blev fem kolorektale cancercellelinjer opsamlet (DLD1, RKO, SW620, SW480, og Colo320), og den normale human fibroblast (NHFB) blev anvendt som normale cellekontrol. Først, vi samlet mRNA produkt fra disse cellelinier og udført RT-PCR som tidligere beskrevet. Disse resultater viste, at ATP5J mRNA blev overudtrykt i alle coloncancer cellelinier, men ikke i NHFB (figur 2A). Vi udførte derefter Western blotting på proteinet prøver af disse cellelinier. Resultaterne viste et lignende fænomen. ATP5J protein blev overudtrykt i fire tyktarmskræft cellelinjer (undtagen RKO) sammenlignet med NHFB (figur 2B). Baseret på disse resultater, vi valgte hovedsagelig DLD1 celler til den næste del af vores undersøgelse; DLD1 viste en moderat grad af

ATP5J

udtryk, som var belejligt for at observere nedregulering samt opregulering af genekspression i den samme celle linje ved hjælp af molekylære teknikker.

(A) RT-PCR-resultater for ATP5J mRNA. (B) Western blotting resultater for ATP5J protein.

Nedregulering af

ATP5J

udtryk svækket celle migration og øget 5-Fu følsomhed i DLD1 celler

Første vi nedreguleret

ATP5J

udtryk i DLD1 celler gennem stabil transfektion med et plasmid, der udtrykker shRNA målrettet ATP5J. Efter koloni selektion blev Western blotting udført (figur 3A). Udtrykket af ATP5J blev nedreguleret dramatisk i klon 4 og marginalt i klon 9. Vi valgte klon 4 for yderligere undersøgelse og defineret det som ATP5J shRNA /4. I mellemtiden blev klon 2 fra kontrol shRNA anvendt som vektor kontrol (Vector), og vildtype DLD1 (WT) blev anvendt som en mock kontrol.

(A) Western blot-resultat for ATP5J protein i forskellige kloner af DLD1 cellen efter stabil transfektion med samme ATP5J shRNA plasmid. (B) sårheling assay for WT, Vector, og ATP5J shRNA /4 DLD1 celler. Data repræsenterer en af ​​tre lignende eksperimenter (oprindelig forstørrelse: x100). (C) Migration af WT, Vector, og ATP5J shRNA /4 DLD1 celler blev analyseret under anvendelse af en 24-Transwell system. Billederne af migrerede celler blev taget 24 timer efter podning (oprindelig forstørrelse: x100). Data repræsenterer en af ​​tre lignende eksperimenter. (D) Kvantitative analyser af tre cellemigration assays. Værdier repræsenterer middel ± SD. *

P

0,05; (E) Apoptotiske forhold af WT, Vector, og ATP5J shRNA /4 DLD1 celler efter behandling med 50 pmol /L 5-Fu i 3 dage. Data repræsenterer en af ​​to lignende forsøg. Værdier repræsenterer middel ± SD. *

P

. 0,05

Resultatet af MTT-analysen, cellecyklus ved flowcytometri, eller klon dannelse ved klonogene assay viste ingen forskelle i celle overlevelse blandt WT, Vector og ATP5J shRNA /4 grupper (data ikke vist). Men data fra sårhelende assay viste, at celler i ATP5J shRNA /4-gruppen tog 48 timer til at lukke en ridse sår, mens celler i WT og Vector-grupper tog 48 timer til at helbrede et sår af tilsvarende størrelse (figur 3B). Dette resultat antydede, at nedregulering af

ATP5J

svækket evne celle migration i DLD1 celler. For at kvantificere effekten af ​​

ATP5J

nedregulering på celle migration, en yderligere vandring blev udført. Resultaterne af denne yderligere analyse viste, at antallet af migrerede celler i ATP5J shRNA /4 gruppe blev signifikant reduceret sammenlignet med både WT og Vector grupper (figur 3C og 3D,

P

0,05).

Desuden ønskede vi at vurdere respons af kræftceller til anti-cancer terapi efter ATP5J udtryk blev ændret. Til dette formål valgte vi 5-fluorouracil (5-FU) for næste undersøgelse, fordi det er en hyppigt anvendt anti-metabolit kemoterapeutisk lægemiddel i colorektal cancer. Vores resultater viste, at den apoptotiske forholdet ATP5J shRNA /4 gruppe var højere end for både WT og Vector grupper efter behandling med 50 pmol /L 5-Fu i 3 dage (figur 3E, P 0,05). Dette resultat antydede, at nedregulering af

ATP5J

øget følsomhed over DLD1 celler til 5-Fu.

For yderligere at bekræfte funktionen af ​​ATP5J i anden cellelinje, vi bankede ned

ATP5J

ekspression i SW620-celler under anvendelse af samme plasmid som nævnt ovenfor. Efter koloni udvælgelse, vi identificeret en klon, hvor

ATP5J

udtryk blev dramatisk nedreguleret; vi kaldte den ATP5J shRNA /3 (figur 4A). Resultaterne fra både apoptose påvisning og cellelevedygtighedsassays foreslog, at ATP5J shRNA /3 gruppe afledt af SW620-celler var mere følsomme over for 5-FU sammenlignet med WT og Vector grupper efter behandling med 50 pmol /L 5-Fu i 3 dage (figur 4B og 4C,

P

0,05). Dette resultat er i overensstemmelse med vore tidligere data fra DLD1 celler og længere validerer funktionen af ​​ATP5J i colon cancerceller.

(A) Western blot-resultat for ATP5J protein i forskellige kloner af SW620 cellen efter stabil transfektion med det samme ATP5J shRNA plasmid. (B) Apoptotisk forhold på WT, Vector, og ATP5J shRNA /3 SW620-celler efter behandling med 50 pmol /L 5-Fu i 3 dage. (C) Cell levedygtighed assays af WT, Vector, og ATP5J shRNA /3 SW620-celler efter behandling med 50 pmol /L 5-Fu i 3 dage. Data repræsenterer en af ​​to lignende forsøg. Værdier repræsenterer middel ± SD. *

P

. 0,05

opregulering af

ATP5J

udtryk forbedret celle migration og faldt 5-Fu følsomhed i DLD1 celler

Næste, ønskede vi at bekræfte vores resultat med en modsat tilstand, hvor

ATP5J

udtryk blev yderligere opreguleret. For at nå dette mål, pcDNA3.1 (+) /ATP5J plasmid blev stabilt transficeret i DLD1 celler. Efter koloni selektion blev Western blotting udført (figur 5A). Den ATP5J udtryk var opreguleret dramatisk i kloner 2, 3, og 4. Vi valgte tilfældigt kloner 2 og 4 for yderligere undersøgelse og defineret dem som ATP5J /A2 og ATP5J /A4, hhv. I mellemtiden blev klon 7 fra kontrolgruppen plasmid, der anvendes som vektor kontrol (Vector) og vildtype DLD1 celler (WT) blev anvendt som en mock kontrol.

(A) Western blot-resultat for ATP5J protein i DLD1 celler efter stabil transfektion med pcDNA3.1 (+) /ATP5J plasmid. (B) sårheling assay for WT, Vector, ATP5J /A2, og ATP5J /A4-celler. Data repræsenterer en af ​​tre lignende eksperimenter (oprindelig forstørrelse: x100). (C) vandringer WT, Vector, ATP5J /A2, og ATP5J /A4-celler blev analyseret ved anvendelse af en 24-Transwell system. Billederne af migrerede celler blev taget 24 timer efter podning (oprindelig forstørrelse: x100). Data repræsenterer en af ​​tre lignende eksperimenter. (D) Kvantitativ analyse af tre celle-migration assays. Værdier repræsenterer middel ± SD. *

P

0,05. (E) Apoptotiske forhold mellem WT, Vector, ATP5J /A2, og ATP5J /A4 celler efter behandling med 50 pmol /L 5-Fu i 3 dage. Data repræsenterer en af ​​to lignende forsøg. Værdier repræsenterer middel ± SD og *

P

. 0,05

De data vedrørende celle overlevelse, cellecyklus, og klon dannelse givet resultater svarende til dem præsenteret ovenfor. Ingen forskel blev observeret blandt WT, Vector, ATP5J /A2, og ATP5J /A4-grupper (data ikke vist). Den sårhelende assay viste, at celler i ATP5J /A2 og ATP5J /A4 grupper tog 44 timer til at lukke en ridse sår, hvorimod celler i WT-og Vector grupper tog 44 timer til at helbrede et sår af tilsvarende størrelse ( Figur 5B). Dette resultat antydede, at opregulering af

ATP5J

forbedret celle migration i DLD1 celler. En yderligere celle-migration assay viste, at antallet af migrerede celler i ATP5J /A2 og ATP5J /A4-grupper var signifikant forøget sammenlignet med dem i WT og Vector grupper (figur 5C og 5D,

P

0,05). I mellemtiden, efter behandling med 50 pmol /L 5-Fu i 3 dage, de apoptotiske forhold mellem de ATP5J /A2 og ATP5J /A4-grupper var signifikant lavere end for de WT og Vector-grupper (figur 5E, P 0,05), hvilket indikerer at opregulering af

ATP5J

inducerede DLD1 celler til at modstå 5-Fu.

diskussion

Vores undersøgelse undersøgte status

ATP5J

udtryk i kolorektal cancer patienter og vores resultater viste, at

ATP5J

blev overudtrykt i disse patienter. Dette resultat var det modsatte af det i Sage database. Det kunne være på grund af forskellen i stikprøvestørrelsen samt stikprøveudvælgelsen bias. Ifølge vores data, var der flere forskellige betingelser for ATP5J udtryk i kolorektal cancer, en af ​​dem blev reduceret. Desuden prøvestørrelsen anvendes af databasen var meget lille. Så det kunne forstås, at vi havde en anden konklusion om ATP5J udtryk i kolorektal cancer. Desuden blev vores resultater opnået på både mRNA og protein niveauer og bør derfor være overbevisende.

Yderligere resultater viste, at graden af ​​differentiering blev korreleret med

ATP5J

udtryk. Overensstemmelse med de publicerede litteratur, tumor differentiering var en prognose faktor for patienter med kolorektale cancere [20,21]. Baseret på dette,

ATP5J

udtryk kan være korreleret med overlevelse status, men vores data ikke viste denne sammenhæng. Yderligere, vores resultater viste også, at

ATP5J

udtryk var højere i metastatiske lymfeknuder sammenlignet med tilsvarende primære kræftvæv, men det havde ingen sammenhæng med lymfeknude metastaser. Forskellen kan skyldes for mange ukontrollable faktorer klinisk, snarere end ved at betingelserne i de molekylærbiologiske undersøgelser, som blev kontrolleret præcist. Det kan også skyldes lille størrelse af inkluderede patienter og har brug for en undersøgelse med store prøver. Uanset denne uenighed, vores yderligere resultater perspicuously indikerede, at nedregulering af

ATP5J

udtryk svækket celle migration og øget 5-Fu følsomhed i DLD1 celler.