PLoS ONE: revers transkription Inhibitor Abacavir Shows Anticancer aktivitet i prostatakræft Cell Lines

Abstrakt

Baggrund

overføres elementer (TES) omfatter næsten 45% af hele genomet og er en del af sofistikerede regulatoriske netværk systemer, der styrer udviklingsprocesser i normale og patologiske tilstande. Den retroviral /retrotransposon gen maskiner består hovedsageligt af Long spækket Nuclear Elements (holdopstillinger 1) og human Endogen Retrovira (HERVs), som koder for deres egen endogene revers transkriptase (RT). Interessant er RT typisk udtrykkes i høje niveauer i cancerceller. Nylige undersøgelser rapporterer, at RT hæmning af ikke-nukleosid revers transkriptasehæmmere (NNRTI) inducerer vækst anholdelse og celledifferentiering

in vitro

antagoniserer væksten af ​​humane tumorer i dyremodel. I den foreliggende undersøgelse analyserer vi anticanceraktiviteten af ​​abacavir (ABC), et nukleosid revers transkription (NRTI), på PC3 og LNCaP prostata cancercellelinjer.

vigtigste resultater Salg

ABC reducerer cellevækst, migrering og invasion processer, betydeligt forsinker S-fase progression, inducerer ældning og celledød i prostatacancerceller. I overensstemmelse med disse observationer, microarray analyse på PC3 celler viser, at ABC inducerer specifikke og dosisafhængige ændringer i genekspression, der involverer flere cellulære veje. Især ved kvantitativ realtids-PCR fandt vi denne linje-1 ORF1 og ORF2 mRNA niveauer var signifikant opreguleret af ABC behandling.

Konklusioner

Vores resultater viser potentialet i ABC som anticancer middel i stand til at inducere antiproliferativ aktivitet og udløse senescens i prostatacancerceller. Bemærkelsesværdige, viser vi, at ABC fremkalder opregulering af LINE-1-ekspression, hvilket tyder på at inddrage disse elementer i de observerede cellulære ændringer

Henvisning:. Carlini F, Ridolfi B, Molinari A, Parisi C, Bozzuto G , Toccacieli L, et al. (2010) revers transkription Inhibitor Abacavir Shows Anticancer aktivitet i prostata kræftceller. PLoS ONE 5 (12): e14221. doi: 10,1371 /journal.pone.0014221

Redaktør: Chad Creighton, Baylor College of Medicine, USA

Modtaget: Februar 19, 2010; Accepteret: November 15, 2010; Udgivet: December 3, 2010

Copyright: © 2010 Carlini et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Funding var fra fra National Institute of Health i Rom (ISS), Ricerca Finalizzata 2004 Samarbejde program ISS /NIH-USA og Ricerca Corrente 2007-2008, ISS. Andre ydede finansiering er fra Ministeriet for universiteter og forskning, Regione Campania, Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC) og ph.d.-programmer: “Patologi af cellesignaltransduktion” (OMVG) i Napolis andet universitet og “Toksikologi, onkologi og Molekylær Patologi “af universitetet i Cagliari (MR). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kræft er en kompleks sygdom og sin ekstreme fænotype variabilitet kan ikke udtømmende beskrevet og alene forklares ved gen-miljø interaktioner. Uventet gennemførelse af det menneskelige genom afslører, at den sande kompleksitet af genomet har meget lidt at gøre med antallet og heterogenitet af sine gener.

Kun 2% af de humane genom koder for proteiner, mens 45% består af transposoner (TES) [1]. TES, oprindeligt troede at være blotte intracellulære parasitter, blev kaldt egoistisk eller “junk” DNA, indtil yderligere forskning afslørede, hvordan denne enorme mængde af ikke-protein-kodende sekvenser skalaer op med organismer kompleksitet, spiller en afgørende rolle som en del af regulerende toolkit af genomet, ved at ændre genekspression og kørsel genom evolution samt udviklingen af ​​en organisme [2] – [10]. TES kan adskilles i to hovedklasser: DNA-transposoner (2,8%) og retrotransposoner (42,2%). DNA-transposoner forstærke uden et RNA mellemprodukt, mens retrotransposoner stole på et RNA transkript, selv-replikerer ved hjælp af en revers transkriptase (RT). Salg

RT’er kodes af Long indflettet Nuclear Element-1 (LINE-1 ) og Human Endogene Retroviruses (HERVs) blev fundet at være associeret med patologiske og fysiologiske processer. Især blev høje ekspressionsniveauer af RT findes i kimceller, embryoner, udifferentierede og transformerede celler, mens i differentierede ikke-patologiske væv, de var knap udtrykt, hvilket antyder en direkte sammenhæng med det proliferative potentiale af cellen [11] – [17 ].

Tidligere undersøgelser har vist, at en klasse af ikke-nukleosid RT-inhibitorer (NNRTI’er), er meget udbredt i aIDS-terapi, inhiberer den endogene RT-aktivitet i en række murine og humane cancercellelinier, reducere cellen vækstrate og inducere differentiering [18] – [20]. Desuden blev de samme biologiske virkninger gengivet i RNA interfererende eksperimenter med specifik

si

RNA rettet mod LINE-1 og HERV-K. Disse resultater viser klart, at begge klasser af retroelements er forbundet i et funktionelt netværk, der er involveret i cellevækst og tumorigenese, men med forskellige hierarkiske roller, bliver LINE-1 kunne styre HERV-K-ekspression [21]. Disse undersøgelser antyder, at endogen ikke-telomere RT kan repræsentere en hidtil ukendt mål i udviklingen af ​​terapeutiske midler mod cancer.

NNRTI’er binder til en hydrofob lomme, nær til RT aktive sted. Bindingen inducerer en konformationel ændring i proteinet, der påvirker dets affinitet for substratet og følgelig inhibere RT enzymatisk aktivitet. NNRTI er klassificeret som allosteriske ikke-konkurrencedygtige RT-hæmmere.

En anden klasse af antiretrovirale inhibitorer, der er målrettet RT er repræsenteret ved de nukleosid revers transskription (NRTI). Sammenlignet med NNRTI’er, de har en anden virkningsmekanisme. Den NRTI’er er nukleotidanaloger der hæmmer revers transkription ved at blive indarbejdet i det nyligt syntetiserede viralt DNA (cDNA) og forhindre den videre forlængelse. De klassificeres som ikke-allosteriske konkurrencedygtige substrat hæmmere. Blandt disse Abacavir (ABC) med held anvendes i kombination med andre antivirale lægemidler til behandling af HIV-infektion. Det omdannes af cellulære enzymer til den aktive carbovir triphosphorilated form en analog af dGTP. Med hensyn til andre NRTI’er ABC viser en meget lav affinitet for cellulære DNA-polymeraser [22]. Derudover Jones et al. [23] viste, med en

in vitro

LINE-1 retrotransposition assay som NRTI’er har evnen til at undertrykke LINE-1 retrotransposition, indikerer modtagelighed LINE-1 RT til denne klasse af lægemidler.

Baseret på disse beviser har vi undersøgt antitumoraktiviteten af ​​ABC om hormon-afhængige LNCaP og hormon-refraktær PC3 prostata cancercellelinjer. Disse metastatiske celler er generelt antages at repræsentere tidlige og sene stadier af prostatakræft hhv. Indtil nu, prostatacancer repræsenterer den mest almindelige noncutaneous cancer hos mennesker i USA [24]. Grundpillen behandling er den androgen ablation, men efter en indledende god respons sygdommen skrider frem til hormon-refraktær prostatacancer [25]. Ny terapi modaliteter er nødvendige for at forebygge eller behandle dette mere dødbringende form for prostatakræft.

Her viser vi, at ABC inducerer et signifikant fald i cellevæksthastigheden og en forsinkelse af cellecyklussen i S-fasen. En stor procentdel af senescentceller blev observeret og mange af dem blev begået ihjel. Par timer af ABC eksponering betydeligt reduceret potentiale for migration og invasion i prostata kræftceller. Desuden et genom-dækkende ekspressionsanalyse på PC3-celler afslørede en dosisafhængig genregulering. Især ABC var i stand til at modulere LINE-1-ekspression i begge cellelinier.

Materialer og metoder

Cell Cultures og behandlinger

Den menneskelige prostatakræft-cellelinier PC3 (ATCC CRL-1435) og LNCaP (ATCC CRL-1740) og den ikke-transformerede humane fibroblast-cellelinie WI-38 (ATCC CCL-75) blev dyrket i overensstemmelse med ATCC anbefalinger. Abacavir blev oprenset fra kommercielt tilgængelige Ziagen tabletter (GlaxoSmithKline, Research Triangle Park, NC 27709) med methanol ekstraktion og oprensning kvalitet vurderes ved HPLC. For drug forsøg blev ABC opløst i FBS-frit medium og anvendes i en koncentration på 15 eller 150 uM. Lægemiddelholdige frisk medium blev ændret hver 48 h. For synkronisering eksperimenter celler blev behandlet med 2 ug /ml aphidicolin i 18 timer, derefter vasket to gange med PBS og frigøres i frisk medium, der indeholder eller ikke ABC. Salg

RT aktivitetsassay Salg

RT-aktivitetsassays blev udført ved en mindre modifikation af fremgangsmåden beskrevet af Mangiacasale fremgangsmåde et.al [18]. Celler (5 x 10

5-10

6) blev lyseret i 40 pi iskold lysepuffer (10 mM Tris-HCI pH 7,5, 1 mM MgCl

2, 1 mM EGTA, 0,1 mM PMSF , 5 mM β-mercaptoethanol, 0,5% CHAPS, 10% glycerol). Efter tre fryse-og-tø-cykler blev celler inkuberet i 30 minutter på is og centrifugeret i 30 min ved 14 000 rpm ved 4 ° C. RT-aktivitet blev testet under anvendelse af en Thermoscript RT-PCR-system (Invitrogen) i 20 pi reaktioner indeholdende 10 ng MS2-fag-RNA (Roche Diagnostics) og 30 pmol af MS2 reverse primer (se nedenfor) og substituerer kommercielt RT med cellefri ekstrakt ( 24 pg totalt protein). Reaktionsblandinger blev inkuberet ved 55 ° C i 1 time efterfulgt af 5 minutter ved 85 ° C. A 1 pi volumen af ​​

Escherichia coli

RNaseH (2 U /pl) blev tilsat til hver prøve, og yderligere inkuberet ved 37 ° C i 20 min. Kontrol reaktioner blev oprettet ved at udelade celle ekstrakt (negativ kontrol), eller tilføje 1 pi Thermoscript RT (Invitrogen) (15 U /ul, positiv kontrol). En 2 pi volumen fra hver reaktion blev blandet med 30 pmol af hver af forward (5′-TCCTGCTCAACTTCCTGTCGAG-3 ‘) og revers (5′-CACAGGTCAAACCTCCTAGGAATG-3’) MS2-primere og PCR-amplificeret under anvendelse af Platinum PCR SuperMix (Invitrogen). PCR-betingelser var som følger: 94 ° C i 2 min, efterfulgt af 30 cykler af 94 ° C i 30 s, 58 ° C i 30 s og 72 ° C i 30 s. Amplifikationsproduktet er et 112-bp DNA-fragment spænder positionerer 21-132 ved 5 ‘enden af ​​MS2 RNA (GenBank V00642). PCR-produkter blev fraktioneret gennem 1,5% agarose gelelektroforese.

celleproliferationsassay

PC3, blev LNCaP og WI-38 celler podet med en tæthed på 20.000 pr brønd i 12-brønds plader, dyrket i 24 timer og derefter behandlet med ABC i en koncentration på 15 eller 150 uM. Ved 0, 24, 48, 72 og 96 h antallet af trypanblåt-eksklusive celler blev talt i et Burker kammer. Eksperimenterne blev udført tre gange in triplo.

Cell Cycle Analysis

Behandlede og ubehandlede celler blev høstet ved trypsinisering og vasket med iskoldt PBS. DNA farvning blev udført ved hjælp af Cycle TEST ™ PLUS DNA Reagent Kit (Becton Dickinson). Celler blev derefter analyseret på en FACScan flowcytometer (Becton Dickinson).

Ældning Bestemmelse

Procentdel af senescentceller blev målt ved detektion β-galactosidase aktivitet ved pH 6 med Calbiochem Ældning Detection kit. Data blev kvantificeret fra mere end 500 celletal i tre uafhængige forsøg.

Fluorescens mikroskopi

For morfometrisk analyse af kerner, behandlede og ubehandlede celler blev fikseret med 3% paraformaldehyd og inkuberet med Hoechst 33258 opløsning (1 pg /ml) i 30 min ved 37 ° C. For farvningen af ​​nucleoli, celler dyrket på 12 mm dækglas blev fikseret og permeabiliseret med methanol ved -20 ° C i 10 minutter, inkuberet med antinukleare serum fra en autoimmun patient (venligst tilvejebragt af Dr. Maria Antonietta Amendolea) og derefter inkuberet med en fluorescein-koblet gede-anti-humant IgG (Bio-Rad). Prøverne blev analyseret ved et CCD-kamera Nikon udstyret Optiphot mikroskop (Tokyo, Japan). Den morfometriske analyse blev udført med Image J 1,37 software (Wayne Rasband, NIH, USA). Til statistisk analyse Students t-test blev anvendt.

Scanning Electron Microscopy (SEM)

Behandlede og ubehandlede PC3 celler blev fikseret med 2% glutaraldehyd i 0,1 M cacodylatpuffer pH 7,4 ved stuetemperatur i 30 minutter, post-fikseret med 1% OSO

4 i den samme buffer, dehydreret gennem en gradueret ethanolserie, kritisk punkt tørret med CO

2 og guld belagt ved sputtering. Prøverne blev undersøgt med en Cambridge Stereoscan 360 scanning elektron mikroskop (Cambridge Instruments Ltd, Cambridge, UK).

Cell migration og invasion analyser

Analyser blev udført ved en modifikation af metoden beskrevet af Albini og kolleger [26]. For migration og invasion assays, filtre 8,0 um pore (Falcon) blev anvendt. Celler, der er høstet og suspenderet i RPMI i en koncentration på 1 x 10

6 celler /ml, blev tilsat til hvert filter og 3 ml RPMI indeholdende 10% FBS blev tilsat til brønden under indsatsen. For invasion assay filtre blev coatet med Matrigel ™ (Sigma) fortyndet til 1 mg /ml i serumfrit RPMI-medium. Cellerne blev inkuberet ved 37 ° C i 18 timer. Derefter blev den indvendige side af filteret tørres af med en våd vatpind at fjerne cellerne, mens den udvendige side af insertet blev skyllet med PBS og farvet med 0,25% krystalviolet (Sigma) i 10 minutter. Filtrene blev derefter ses under et CCD-kamera Nikon udstyret Optiphot mikroskop (Tokyo, Japan) og procent af arealet migrerede eller invaderende celler blev analyseret ved Optilab software (Graftek Mirmande, Frankrig).

microarray analyse

Samlet RNA blev isoleret under anvendelse RNase Kit (Qiagen). For hver prøve blev 500 ng RNA syntetiseret til biotinyleret cRNA ved anvendelse Illumina RNA Amplification Kit (Ambion, Inc., Austin, TX). RNA og cDNA koncentration blev bestemt med en NanoDrop spektrofotometer (NanoDrop, Wilmington, Delaware, USA) og dets kvalitet blev vurderet med en Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Milano, Italien). Fra hver prøve blev der udtaget tekniske replikater fremstillet og 750 ng cRNA blev hybridiseret i 18 timer til HumanRef-8 v2 Expression BeadChips (Illumina Inc., San Diego, CA, USA) ifølge fabrikantens protokol. Intensitet filer blev indlæst i Illumina BeadStudio 3.0.19.0 software og normaliseret med den gennemsnitlige algoritme. Tekniske replikater af hver prøve blev grupperet sammen og gener med en påvisning p-værdi 0,05 blev betragtet som detekteret. Gener med Diff Score på ± 40 (p-værdi på 0,0001) blev betragtet som differentielt udtrykte gener. Microarray data er MIAME kompatibel og de rå data er blevet deponeret i ArrayExpress databasen (https://www.ebi.ac.uk/microarray-as/ae), med tiltrædelse nummer:. E-TABM-532

Ingenuity Pathway Analyse 7 (Ingenuity Systems®, www.ingenuity.com) blev anvendt til at analysere biologiske forhold af differentielt udtrykte gener. De biologiske funktioner blev evalueret i henhold til anvisningerne i softwaren. Fishers eksakte test blev anvendt til at beregne en p-værdi på fastsættelse af sandsynligheden for, at hver biologisk funktion, som dette datasæt skyldes tilfældighed. En GO (Gene ontologi) berigelse analyse blev også udført ved hjælp af DAVID software [27], [28].

RT Assay og Kvantificering af LINE-1 mRNA ekspression

Total RNA blev isoleret fra celler ubehandlet og behandlet med 15 og 150 pM ABC fra 24 til 120 timer. RNA blev behandlet med DNase TURBO (Ambion) for at fjerne kontaminerende genomisk DNA. cDNA’er blev syntetiseret ved TaqMan højkapacitets cDNA Reverse Transcription Kit (PE Applied Biosystems). Relativ kvantificering PCR reaktioner blev udført med TaqMan kemi. LINE-1 udskrifter blev påvist under anvendelse brugerdefinerede primere og FAM-MGB-sonder til LINE-1 ORF1 og ORF2 (PE Applied Biosystems), der er designet ved hjælp af Primere Express-softwaren (tabel S1). LINE-1 sekvens database, der bruges i dette arbejde er L1base (https://l1base.molgen.mpg.de) [29]. Antallet af LINE-1-sekvenser målrettet efter sonder er rapporteret i tabel S1. Hver reaktion blev udført i et slutvolumen på 25 pi indeholdende 1 pi cDNA og 12,5 pi af TaqMan® Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems). Amplifikationer blev udført begyndende med en 2 min aktiveringstrin for AmpErase UNG ved 50 ° C, 10 min skabelon denatureringstrin ved 95 ° C efterfulgt af 40 cyklusser ved 95 ° C i 15s og 60 ° C i 1 min. Pre-udviklede TaqMan assay reagens til GAPDH (4310884E) blev anvendt som endogen kontrol. Fravær af amplifikation fra ikke-revers-transkriberet RNA blev bekræftet at udelukke genomisk DNA-amplifikation. Forskelle i genekspression blev beregnet ved standard 2

-ΔΔCt metode. For den statistiske analyse Students t-test blev anvendt.

Resultater

Abacavir hæmmer cellevækst, påvirker cellecyklusprogression og inducerer ældning i prostata cancer cellelinjer

Først, vi evalueret endogen RT-aktivitet i humane prostata kræftceller og i ikke-transformerede WI-38 kontrol celler. Celleekstrakter blev anvendt som RT kilde til at vende transkribere et syntetisk RNA. Som vist i figur 1A, blev RT-aktivitet fundet i PC3 og LNCaP-celler, hvorimod RT-aktivitet i WI-38 celler var på en umålelig niveau.

(A) Endogen RT-aktivitet blev påvist i PC3, LNCaP og WI -38 celler som beskrevet i materialer og metoder; (+) Positiv kontrol reaktion med kommerciel RT. (B) Prostatakræft og normale menneskelige fibroblast WI-38 celler blev behandlet med ABC på koncentrationen af ​​15 og 150 uM og dyrket ved de angivne tidspunkter. De viste data er repræsentative for mindst tre uafhængige forsøg; barer, ± SD.

For at analysere effekten af ​​ABC på celleproliferation sats, celler blev dyrket i nærvær af lægemidlet i koncentrationer på 15 og 150 uM. En dosisafhængig vækstinhibering blev observeret i begge cellelinier (figur 1B). Ved 15 uM ABC en betydelig reduktion i cellevækst blev afsløret efter 72 og 96 timer af behandlingen i PC3 og LNCaP hhv. Koncentrationen 150 uM hæmmede kraftigt vækst i begge cellelinier (figur 1B). Cytotoksiciteten af ​​ABC blev også undersøgt i ikke-transformerede WI-38 celler. Interessant, fandt vi ikke en signifikant reduktion af cellevækst med 15 pM ABC mens 150 uM ABC koncentration inducerede kun 20% af cellevækst hæmning efter 120 h (Figur 1B).

For at undersøge om ABC kunne påvirke cellecyklusprogression blev prostatacancerceller behandlet med 150 pM ABC og analyseret på forskellige tidspunkter op til 120 timer. I PC3-celler en meget høj akkumulering af celler i S-fase blev set efter 18 og 24 timers behandling (56,3 og 78,6% henholdsvis). Denne stigning blev efterfulgt af en augment af G2 /M-celler som blev 23,4-26,9% af den samlede befolkning på 96 og 120 timers behandling (figur 2A, B). LNCaP behandlede celler viste overvejende en S-fase akkumulering nå 40,5-54,3% efter 48 og 72 timers behandling, men ingen G2 /M-fase tilvækst blev observeret. , S fasen ophobning synes snarere at være konstant over tid (figur 2A). Til yderligere karakterisering af S-fasen ændring blev celler synkroniseret i den tidlige S-fase ved at udsætte dem for DNA-syntese inhibitor aphidicolin. Efter frigivelse fra aphidicolin blok blev celler behandlet med 150 pM ABC og analyseret for cellecyklusfordeling på forskellige tidspunkter. Figur 2C viser, at 3 timer efter frigivelse begge synkroniserede kontrolceller havde flyttet mod midten S-fase, repræsenteret ved central top af grafen, hvorimod ABC-behandlede celler viste en tydelig forsinket progression gennem S-fasen. Efter 18 timer, en stor mængde af PC3-behandlede celler var stadig til stede i slutningen S og G2 /M-fasen, mens LNCaP, som forventet, viste en tendens til at akkumulere i S-fase (Figur 2C). Bemærkelsesværdigt, ABC var i stand til at forlænge S-fase progression også hvis tilsat i midten S-fase, 3 timer efter aphidicolin blok frigivelse (data ikke vist). Alle sammen disse data understøtter den hypotese, at ABC specifikt kan påvirke DNA-replikation.

(A) cellecyklusfordeling af PC3 og LNCaP-celler udsat for 150 pM ABC. Celler blev høstet ved de angivne tidspunkter, inkuberet med propidiumiodid og DNA-indhold blev analyseret ved flowcytometri. Procentdelen af ​​celler i hver fase er rapporteret. (ND, ikke gjort). Dataene er repræsentative for fem uafhængige forsøg. (B) Et repræsentativt eksperiment af cellecyklusprogression i PC3-behandlede celler. Pilene angiver celleakkumulering ved G2 /M-fasen. (C) PC3 og LNCaP celler blev synkroniseret i begyndelsen S fase ved aphidicolin og cellecyklusfordeling blev analyseret i behandlede (150 uM ABC) og ubehandlede celler.

Sammen med spredning hæmning, en betydelig forøgelse af celledød over en periode på 6 dage blev observeret med 150 pM ABC (figur 3A, B). At evaluere, om disse fænomener var associeret med apoptose induktion eller fremadskridende alderdom, prostatacancer-celler blev behandlet med 150 pM ABC i 5 dage og vurderet hver 24 timer for annexin eksternalisering, cellekernekondensation /opsplitning og ß-galactosidase-aktivitet ved pH 6. Ingen signifikant stigning af annexin positive celler eller apoptotiske kerner blev observeret i behandlede prøver på noget tidspunkt (data ikke vist), hvorimod senescens forbundet ß-galactosidaseaktivitet blev signifikant induceret af ABC og øget med tiden og nåede ca. 80% og 50% af positive celler efter 5 dages behandling i PC3 og LNCaP (figur 3C, D). Endvidere viste en sammenligning mellem cellulær senescens og celledød kinetik antyder, at de to fænomener er stærkt forbundet. Tværtimod, vi ikke observere celledød eller forskelle i ældning niveau i WI-38 kontrol celler behandlet med 150 pM ABC, sammenlignet med ubehandlede celler (data ikke vist).

(A og B) 5 × 10

4-celler blev podet i 12-brønds plader med 150 pM ABC. Efter 0, 2, 4 og 6 dage blev adhærente og flydende celler høstet og resuspenderet i dyrkningsmedium indeholdende 0,2% trypanblåt til tælling af levedygtige og død celler. (C og D) ß-galactosidase-aktivitet blev evalueret i PC3 og LNCaP-celler behandlet med 150 pM ABC og analyseret på forskellige tidspunkter.

morfologiske ændringer af PC3 behandlede celler

PC3 celler blev yderligere analyseret ved morfologisk niveau. Ifølge cellecyklus ændring og senescens induktion blev observeret flere celle morfologiske ændringer efter eksponering for lægemidlet ved begge doser. Ved scanningelektronmikroskopi PC3 celler behandlet med 15 pM ABC allerede udviste en mere udfladede form (figur 4A a, d) og en hindring i division proces efter 48 timers eksponering (figur 4A b, e). Desuden behandlede PC3 celler viser tabet af overfladen mikrovilli, der tyder på en effekt af lægemidlet på cytoskelettet organisation (figur 4A c, f). På nukleare niveau, morfologisk analyse fremhæver tilstedeværelsen af ​​bilobate og forstørrede kerner, med en stigning på det nukleare område bliver tydelig ved 48 h inkubation med 15 pM ABC og 24 timer efter behandling med 150 pM ABC (figur 4B). Morfometrisk og statistisk analyse viste, at nukleare områder omtrent fordoblet i 48 h med 150 pM ABC (tabel S2). På nucleolar niveau blev fundet signifikant struktur modifikationer i celler udsat i 72 timer for begge ABC doser. Endvidere PC3 behandlede celler nucleoli synes mindre kompakt og i nogle tilfælde spredt relation til kontrol (figur 4C).

(A) SEM billede illustrerer modifikation forekommer i PC3-celler behandlet med 15 pM ABC ved 48 timer. (B) Morfologiske ændringer og morfometrisk analyse af kerner farvet med Hoechst. Doser og tidspunkter er angivet. (C) Immunofluorescens af nucleoli farvet med anti-kerne humant serum.

Abacavir Forhindrer Migration og Invasion

Da PC3 og LNCaP celler er af metastatisk oprindelse og besidder en vandrende og invasionsevne potentiale undersøgte vi virkningerne af ABC på motiliteten og invasion processer. Celler blev podet i transwell kamre i nærvær eller fravær af 15 eller 150 uM ABC, og fik lov til at migrere i 18 timer ved 37 ° C. Et dosisafhængigt fald i arealet trækkende og invaderende celler blev observeret efter ABC behandling (figur 5A, B). Cellemigrering signifikant reduceret i prostatacancerceller ved 15 og 150 um ABC doser (p 0,001). Matrigel invasion celle blev inhiberet signifikant kun ved den højere ABC dosis (figur 5B).

PC3 og LNCaP-celler blev podet på membranen i nærvær eller fravær af Matrigel og inkuberet med 15 og 150 uM ABC i 18 timer. (A) repræsentativt billede af trækkende og invaderende PC3 celler farvet med krystalviolet. (B) Procentdel af migration og invasion falde i forhold til ubehandlede celler analyseret af Optilab software. (*) Svarer til p. 0,001, beregnet af Mann-Whitney test

Gene Expression Ændring induceret af Abacavir i PC3 behandlede celler

I forsøg på at finde en genekspression signatur ligger til grund for morfologiske og funktionelle ændringer observeret i ABC behandlede PC3 celler, fire biologiske replikater af både behandlede og kontrol celler blev analyseret på en Illumina microarray platform 48 timer efter behandlingen.

Analyse af microarray data viste, at 192 gener ud af 12.605 detekteret og 3246 ud af 12930, blev differentielt udtrykt (p 0,0001). ved 15 og 150 uM ABC koncentrationer henholdsvis hvoraf de fleste resulterede opreguleret (Figur 6A og tabel S3)

(A) sammenfatter diagram af de udtrykte og differentielt udtrykte gen numre som følge af microarray analyse (fire biologiske gentagelser for hver betingelse). (B) Sammenligning af top-ti biologiske funktioner ved 15 og 150 uM ABC opnået ved IPA-analyse. På y-aksen den statistiske signifikans, udtrykt som -log /p-værdi, der er rapporteret. Threshold p-værdi = 0,05 (gul linje). Antallet af de involverede i hver funktion gener er rapporteret på toppen af ​​hver søjle. (C) Venn diagram, der viser den del af fælles gener udtrykkes forskelligt i PC3-celler ved 15 og 150 uM ABC.

En funktion analyse af de differentielt udtrykte gener blev udført under anvendelse Ingenuity Pathways Analysis (IPA) systemet (figur 6B). Interessant, den sammenlignende analyse af de top-ti biologiske funktioner viser, at de store cellulære funktioner, der berøres af behandlingen var den samme for de to koncentrationer, hvilket indikerer en specifik og dosisafhængig virkning af lægemidlet. De er beskrevet i figur 6B funktioner er konsekvent og repræsentative for både morfologiske og funktionelle ændringer observeret ved fænotypisk niveau: inddrivelse af celledød veje, ændringer i cellecyklus og spredning sats, ændringer i cellulær morfologi. Andre påvirket betydeligt funktioner var “RNA posttransskriptionel Ændringer”, “Gene Expression” og “DNA Replication, rekombination og reparation”. Gener grupperet i de forskellige funktioner er anført i tabel S4.

De datasæt opnået ved de to doser blev successivt sammenlignet i et Venn-diagram og 144 gener resulterede deles mellem de to lister (figur 6C, tabel S5 ). Blandt dem var den mest repræsenterede Gene Ontology (GO) vilkår identificeret ved hjælp af DAVID “Functional Annotation Chart” værktøj, herunder de tre kategorier: biologiske processer, Cellular komponenter og Molekylær funktioner. Funktionelle annotation klynger blev identificeret for hver kategori, med berigelse scoringer spænder fra 1,33 til 8,63 (tabel 1). Interessant, GO “Cellular Component” kategori identificeret 20 gener alle tilhører de nukleare rum og specifikt nuklear del, kromatin remodeling komplekse og kromosom vilkår (tabel 2).

Abacavir modulerer LINE -1 mRNA Expression

på grund af dokumentation for en sammenhæng mellem RT-aktiviteten, LINE-1-ekspression og kræft celle omprogrammering [18] – [21], besluttede vi at undersøge ABC effekt på ekspressionen af ​​denne klasse af retrotransposons. Specifikt LINE-1 består af en 5′-UTR (utranslateret region), to åbne læserammer (ORF1 og ORF2) og en 3’UTR ender i en poly (A) hale. ORF1 koder for et protein med RNA bindingskapacitet mens ORF2 koder for et protein med endonuclease og revers transkriptase-funktioner [7]. CDNA’erne opnået fra prostatacancerceller, ubehandlede og behandlet med de to ABC doser og høstet 24, 48, 72, 96 og 120 timer, blev amplificeret ved Real-Time PCR med primere og prober, der genkender konserverede regioner af LINE-1 ORF1 og ORF2-kodende sekvenser. Som vist i figur 7, blev en dosis og tidsafhængig forøgelse af mRNA’er ekspressionsniveau observeres enten i PC3 og LNCaP-celler for både ORF1 og ORF2 transkripter, hvilket indikerer, at LINE-1 kunne spille en rolle i de molekylære og funktionelle ændringer observeret ved ABC behandling.

relative niveauer af LINE-1 mRNA-transkripter (ORF1 og ORF2) i PC3 og LNCaP celler behandlet med 15 og 150 uM ABC på forskellige tidspunkter. Data er udtrykt som middelværdi ± SD. De (*) og (**) symboler betegne en væsentlig forskel i forhold til ubehandlede celler, med ap værdi 0,05 og. 0,01 henholdsvis

Diskussion

Et stort antal af beviser har bekræftet associationen mellem høje endogen RT-ekspression og transformeret /tumoral cellefænotype [11], [17]. Tidligere undersøgelser med allosteriske RT-inhibitorer, NNRTI’er, tyder på, at LINE-1-kodet RT kan betragtes som en ny molekylært mål i cancerterapi.

I dette arbejde vises antitumoraktivitet Abacavir, en nukleosid revers transkription (NRTI) på PC3 og LNCaP human prostata cellelinjer af metastatisk oprindelse. Endvidere rapporterer vi for første gang, at ABC behandling kan modulere LINE-1-mRNA-ekspression.

ABC væsentligt reduceret cellevækst, induktion en forsinkelse i cellecyklus S-fase progression i prostatacancerceller. Denne bremse fører til en deraf følgende anholdelse i G2 /M fase i PC3 celler, mens LNCaP celler ophobes i S-fasen. Effekten på cellecyklus blev klart få timer efter behandlingen og celler gradvist ind i en tilstand af ældning. Udseendet af senescens-associerede morfologiske ændringer og SA-β-gal-ekspression øges gradvist i PC3 og LNCaP-celler nåede 80% og 50% i 5 dage med resulterende celledød.

Kontrasterende tumorcellemigration og invasion er et centralt emne i prostatakræft. Det er velkendt, at tilstedeværelsen af ​​metastaser nedsætter patientens risiko for overlevelse, og at de behandlingsmuligheder aktuelt tilgængelige er sjældent i stand til at helbrede metastatiske former. Her rapporterer vi, sammen med effekt på cellecyklus, ABC svækker invasion og migration potentiale PC3 og LNCaP celler.

Baseret på genekspression profiler af PC3 celler, vi leverer indledende indsigt i forholdet mellem ABC behandling