PLoS ONE: VEGFA opregulerer FLJ10540 og modulerer Migration og Invasion af lungekræft via PI3K /AKT Pathway

Abstrakt

Baggrund

Lunge adenocarcinom er den hyppigste årsag til kræft-dødsfald blandt både mænd og kvinder i verden. Trods de seneste fremskridt inden for diagnosticering og behandling, dødeligheden med en samlet 5-års overlevelse på kun 15%. Denne høje dødelighed skyldes formentlig tidlig metastaser. Selvom flere kendte markører korrelerede med dårlig /metastase prognose i lungeadenocarcinom patienter ved immunhistokemi blev rapporteret, de molekylære mekanismer i lungeadenocarcinom udvikling er stadig ikke klarlagt. At udforske nye molekylære markører og deres signalveje vil være afgørende for at hjælpe i behandlingen af ​​lunge adenocarcinom patienter.

Metodologi /vigtigste resultater

For at identificere nye lungeadenokarcinom-associerede /metastase gener og præcisere de underliggende molekylære mekanismer i disse mål i lungekræft progression, vi skabt en bioinformatik ordning bestående af at integrere tre genekspressionsprofil datasæt, herunder parvise lunge adenocarcinom, sekundære metastatiske tumorer vs. godartede tumorer, og en række invasive cellelinier. Blandt de hidtil ukendte targets identificeret, blev FLJ10540 overudtrykt i lungekræft væv og er forbundet med cellemigrering og invasion. Desuden vi ansat to co-ekspression strategier til identifikation, hvor bane FLJ10540 var involveret. Lung adenocarcinom array-profiler og væv microarray ICH farvede data viste, at FLJ10540 og VEGF-A, samt FLJ10540 og phospho-AKT udviser positive korrelationer hhv. Stimulering af lungekræft celler med VEGF-A resulterer i en stigning i FLJ10540 proteinekspression og forbedrer kompleksdannelse med PI3K. Behandling med VEGFR2 og PI3K-inhibitorer påvirker celle migration og invasion ved at aktivere PI3K /AKT pathway. Desuden knockdown af FLJ10540 destabiliserer dannelse af P110-α /P85-α- (PI3K) kompleks, yderligere støtte deltagelse af FLJ10540 i VEGF-A /PI3K /AKT-vejen.

Konklusioner /Betydning

Dette fund satte scenen for yderligere afprøvning af FLJ10540 som en ny terapeutisk mål for behandling af lungekræft og kan bidrage til udviklingen af ​​nye terapeutiske strategier, der er i stand til at blokere PI3K /AKT-vejen i lunge kræftceller.

Henvisning: Chen CH, Lai JM, Chou TY, Chen CY, Su LJ, Lee YC, et al. (2009) VEGFA opregulerer FLJ10540 og modulerer Migration og Invasion af lungekræft via PI3K /AKT Pathway. PLoS ONE 4 (4): e5052. doi: 10,1371 /journal.pone.0005052

Redaktør: Mikhail V. Blagosklonny, Ordway Research Institute, USA

Modtaget: December 22, 2008; Accepteret: 12. februar 2009; Udgivet: April 1, 2009

Copyright: © 2009 Chen et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev delvist understøttet af tilskud fra Chang Gung Hospital (CMRPD140211) og NSC (94-2752-B-010-002-PAE) til Chen-Kung Chou, NSC (Program for Interdisciplinary Research Project: NSC97-2627-B-010 -011 til Chi-Ying Huang, NSC97-2627-B-030-001 til J.-M. Lai), og NSC97-3112-B-010-025-CC1, Taichung Veteran General Hospital (TCVGH-957326D), og programmet til fremme af akademisk ekspertise af universiteter (National Yang Ming University) til Chi-Ying Huang, og NSC (95-3112-B-075-002 og 96-3112-B-075-001) til Yu-Chung Wu. Den Gene Expression Analysis Core Facility er støttet af National Research Program for Genomisk Medicin (NRPGM), National Science Rådet, Taiwan. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Lungekræft er den hyppigste årsag til kræft-relaterede dødsfald blandt både mænd og kvinder i verden [1] – [2]. Trods de seneste fremskridt inden for diagnosticering og behandling, dødeligheden fortsat høje, med en samlet 5-års overlevelse på kun 15%. Kirurgi er fortsat det første valg af behandling for lokaliseret ikke-småcellet lungekræft og giver den bedste mulighed for helbredelse. Men når først diagnosticeret, de fleste patienter, der allerede har fremskreden sygdom, og kun 35% af patienter med ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) er berettiget til resektion [3]. Hidtil ukendte molekylære markører eller mål medvirken i diagnose og behandling vil være afgørende for at forbedre dødeligheden.

Tumor invasion og metastase er vigtige områder for undersøgelse for at bestemme den aggressive fænotype af humane cancere og er de vigtigste årsager til kræftdødsfald [4]. Processen med metastaser er meget kompleks og betragtes som en sen begivenhed i tumorigenese, dvs. celler formere sig, mister kontakten med naboceller, vandrer gennem den interstitielle matrix, invadere blod og lymfekar, og indbetaler til lymfeknuderne. Migration og invasion af celler synes at være et resultat af et komplekst samspil mellem de talrige protein-familier, der deltager i denne proces. Mekanismer for cellebevægelse er vigtig, ikke kun som en del af basale cellulære og udviklingsmæssige processer, men også i patogenesen af ​​forskellige sygdomme [5]. For at blive metastatisk skal tumorceller forøge ekspressionen af ​​forskellige metastase-fremmende gener. Men i lungekræft, molekylerne og mekanismer, der er involveret i celle migration eller invasion stort set ukendt.

Produktion og sekretion af VEGF-A er almindeligt observeret i de fleste aggressive tumorer, og ekspressionen af ​​VEGF-A dybt påvirker prognose af kræftpatienter, herunder dem med lungekræft [6] – [8]. VEGF-A er en af ​​de mest potente stimulatorer af angiogenese identificeres hidtil, påvirker endotelcelle vaskulær permeabilitet, proliferation og motilitet [7]. Selv om forskellige intracellulære signalveje er blevet foreslået at mediere de biologiske aktiviteter af VEGF-A i endotelceller, er signaleringshændelser involveret i cellemigrering og invasion som svar på VEGF-A stimulering i lungekræft ikke fuldt klarlagt.

FLJ10540 har flere navne, herunder CEP55 [9], C10orf3 [10], og URCC6. CEP55 opmærket med GFP-C lokaliseres til centrosom i interfase-celler, til spindelen Mellemzone under anafase og til midterskrog under cytokinese [9], [11] – [12]. Endvidere Cdk1, ERK2, og PLK1 samarbejder i phosphorylering af CEP55 under mitose, som er nødvendige til korrekt mitotiske lokalisering af CEP55 og dens funktion under cytokinese [9]. FLJ10540 overudtrykkes under human colon [10] og hepatocellulært carcinom [13] tumorigenese, hvilket antyder, at det kan fungere som et onkogen i tumorudvikling. Derudover tidligere viste vi, at overekspressionen af ​​FLJ10540 bidrager til cellulær transformation gennem aktivering af PI3K /AKT [13]. Imidlertid har der ikke udført omfattende analyse af FLJ10540 Udtrykket og clinicopathologic og funktionelle betydning i human lungekræft.

Den aggressive opførsel af maligne cancerceller bestemmes af en kompleks række af signalveje, der regulerer nøglefunktioner , såsom vækst, overlevelse, migration og invasion. Den PI3K /AKT signalvej er kausalt forbundet med alle fire af disse reaktioner. [14] – [17]. Yderligere bevis på betydningen af ​​PI3K /AKT signalering i kræft kommer fra undersøgelser, der har påvist overekspression og hyperaktivering af PI3K /AKT i en bred vifte af humane tumorer, herunder lungekræft, og dette er ofte forbundet med dårlig prognose [18]. Akkumulerende beviser fra tidligere rapporter tyder på en potentiel rolle PI3K /AKT i migration og invasion af forskellige celletyper, herunder lungekræft [19], levercancer [20], brystkræft [21], og bugspytkirtelkræft [22].

i denne undersøgelse viser vi, at FLJ10540 overudtrykkes i lunge adenocarcinom og at ektopisk ekspression af FLJ10540 fremmer cellemigration og invasion. I humane lungeadenocarcinom prøver, FLJ10540 positivt korreleret med VEGF-A-ekspression, bestemt ved genekspression profilering og IHC-farvning af væv microarrays. Desuden stimulering med VEGF-A resulterede i en stigning i FLJ10540 proteinekspression i en dosis-afhængig måde i CL

1-0 lungecancerceller. Endvidere FLJ10540 delvist translokerer fra cytoplasmaet til plasmamembranen og forbedrer kompleksdannelse med PI3K under VEGF-A stimulation. Endelig VEGF-A påvirker celle migration og invasion ved at aktivere FLJ10540 /PI3K /AKT pathway. Disse resultater tyder på, at FLJ10540 overekspression er associeret med en forbedret metastatisk potentiale og kan tjene som et potentielt nyt terapeutisk mål for lunge adenocarcinom.

Resultater

Forhøjet FLJ10540 udtryk i lunge adenokarcinomer og invasiv lungekræft celle linjer

En væsentlig udfordring i den post-genome æra er, hvordan de vil prioritere differentielt udtrykte og dårligt karakteriserede mål i cancer-relaterede microarray profilering undersøgelser. Her har vi oprettet en bioinformatik platform ved at integrere tre forskellige microarray datasæt til at afsløre vigtige regulatorer involveret i metastase af lungekræft. Figur 1 viser de skematiske dataintegration tilgange og FLJ10540 udtryk data i forskellige kategorier. Først blev prøver fra 26 patienter med lunge-adenocarcinom, bekræftet ved histopatologi, underkastes Affymetrix microarray profilering. Baseret på de 26 primære lungeadenocarcinom prøver blev 826 ud af 22.283 differentielt udtrykte transkripter mellem tilstødende ikke-tumor og tumorområder grupperet af Wilcoxon-test (

s Restaurant 0,01), på grundlag af dobbelt forskelle og testet ved hjælp af Benjamini og Hochberg falsk opdagelse sats korrelation (

s

0,01). Disse molekylære portrætter, indeholdende 192 opreguleres og 634 nedreguleres transkripter, held kunne skelne patienternes hosliggende ikke-tumor og tumor områder ved hierarkisk klyngedannelse (Figur S1A). For det andet, var offentlige tilgængelige microarray data (downloadet fra GEO), der anvendes til at erhverve forskellige microarray datasæt, som blev normaliseret ved fraktilestime Normalisering hjælp R til at oprette potentiale en metastatisk biomarkør identifikation platform. Vi sammenlignede 225 sekundære metastatiske tumorer (herunder 20 tumormetastaser til lymfeknuderne og 200 metastatiske tumorer) og 30 benigne tumorer til opnåelse sæt af potentielle metastatiske onkogener (871) og metastatiske suppressor gener (1042). Endelig, for at prioritere de mål og til at validere vores metastase-relaterede gener i cellelinier, en serie af lunge adenocarcinom cellelinjer, herunder CL

1-0, CL

1-1, CL

1-5 og CL

1-5-F4, med stigende grader af invasionsevne [23], blev også udsat for microarray profilering. I alt 6.238 transkripter havde højere ekspressionsniveauer i den høje invasion evne cellelinie CL

1-5-F4 end den parentale CL

1-0 celler. Skæringspunktet mellem disse tre datasæt afslører mange nye targets. Vi kendetegnet de gener, der er konserverede kun hos hvirveldyr, men ikke i invertebrater, at afsløre nogle nye humane cancer-specifikke abnormiteter. Som et resultat, vi fokuseret på dårligt karakteriserede gen

FLJ10540

.

(A, venstre panel) De microarray ekspressionsmønstre af

FLJ10540

i lungeadenokarcinom patienter blev normaliseret mod udtrykket mønstre på HG_U133A chips. N: hosliggende ikke-tumorvæv; T: tumorvæv. Den boxplot viser data fordelingen som en gruppering klassifikation og angiver, at der er en statistisk signifikant forskel (

s

0,0001) mellem tumorvæv og de tilstødende nont-umor væv fra den samme lungekræft patient. (A, højre panel) mRNA niveauer af

FLJ10540

i prøver fra 16 lungekræft patienter blev bestemt ved Q-RT-PCR. Resultaterne blev normaliseret mod ekspressionsniveauerne af

GAPDH

mRNA i hver sammenkoblet prøve og plottet med boxplot. (B) De microarray ekspressionsmønstre for

FLJ10540

blev sammenlignet blandt 30 benigne tumorer, 20 tumormetastaser til lymfeknuderne og 200 metastatiske tumorer, og blev viste med boxplot. (C, venstre panel) mRNA niveauerne af

FLJ10540

blev bestemt ved Q-RT-PCR i lungekræft-cellelinjer. Resultaterne blev normaliseret mod niveauet for

GAPDH

mRNA i hver cellelinie. Forsøgene blev udført in triplo. (C, højre panel) Totalt protein blev ekstraheret fra CL

1-0 og CL

1-5-F4-celler og underkastet immunoblotanalyse med anti-FLJ10540. β-actin blev anvendt en intern belastning kontrol.

FLJ10540

udstiller opreguleret udtryk mønstre i lunge adenokarcinomer (figur 1A, venstre panel) og metastatiske signaturer (Figur 1B). For at validere genekspression profilering data for

FLJ10540

, Q-RT-PCR blev udført på 16-parvis lungeadenokarcinom tumor og tilstødende ikke-tumorprøver. Figur S1B viser, at overekspression af

FLJ10540

kunne observeres i vores lunge patientprøver, med 15 ud af 16 lunge patient tumorer (94%), der viser en højere signal efter normalisering til

GAPDH

for lige skabelon lastning. Det gennemsnitlige ekspressionsniveau

FLJ10540

i lunge adenocarcinomer var 8 gange højere end den tilstødende ikke-tumor lunge vævsprøver, som analyseret ved boxplot (figur 1A, højre panel). Vi dernæst undersøgte ekspressionen af ​​FLJ10540 i det repræsentative og frisk frosset lungeadenocarcinom og tilstødende ikke-tumorprøver ved immunhistokemi farvning under anvendelse af anti-humane FLJ10540 antistoffer. Vores data viser, at omfanget af FLJ10540 blev forøget i tumorprøverne, sammenlignet med den i de tilstødende ikke-tumorvæv (data ikke vist).

Ekspression af FLJ10540 i en serie af invasiv human lunge adenocarcinom kræft cellelinjer

Under lunge tumor udvikling, en af ​​de mest kritiske overgange er progression fra

in situ

til invasiv karcinom. At udforske mulige rolle FLJ10540 i invasiv lunge adenocarcinom celler, vi først undersøgte udtryk for

FLJ10540

i et panel af cellelinier, CL

1-0, CL

1-1 CL

1-5, og CL

1-5-F4, med enten lave eller høje invasive evner, som tidligere beskrevet [23] af Q-RT-PCR. Dataene viste, at niveauet af

FLJ10540

mRNA var høje i CL

1-5 og CL

1-5-F4 celler, der har høje invasive og metastatiske evner, men var lavere i den lave invasive CL

1-0 celler (figur 1C, venstre panel). FLJ10540 proteinniveauer var også markant højere i den stærkt invasive CL

1-5 celler end i den lave invasive CL

1-0 celler, som vist ved Western blot-analyse (figur 1C, højre panel). Resultaterne indikerede, at opregulering af FLJ10540 mRNA og proteinekspression var positivt korreleret med invasiv evne af de lungecancerceller, øge muligheden at opregulering af

FLJ10540

kan føre til nogle af de abnormiteter fundet i human lunge adenocarcinom .

Overekspression af FLJ10540 fremmer celle migration og invasion

Da FLJ10540 er overudtrykt i lunge adenocarcinom og en meget invasiv lungekræft cellelinje, virkede det muligt, at dets udtryk kan påvirke celle motilitet. At afklare rolle FLJ10540 i motilitet i pattedyrceller, vi undersøgte, om overekspression af FLJ10540 kunne påvirke cellemigration og invasion. To forskellige celletyper blev anvendt til at evaluere denne mulighed. Først CL

1-0 celler stabilt udtrykker hæmagglutinin (HA) -mærket FLJ10540 blev etableret. Adskillige stabile transfektanter med stigende niveauer af FLJ10540-protein blev selekteret (figur 2A, venstre panel) til yderligere undersøgelser. Interessant FLJ10540 overekspression i CL

1-0 celler var forbundet med påfaldende ændret cellemorfologi. FLJ10540 overudtrykte kloner blev reduceret i cellestørrelse og syntes at være mere spindel-formet og havde øget intercellulær adskillelse sammenlignet med bærer kontrol kloner, som blev rund form (figur 2A, midterste panel). Imidlertid proliferationshastighed, som bestemt ved MTT-assayet, var ikke signifikant forskellig fra den for vehikelkontrollen eller celler, der udtrykker FLJ10540 løbet af 24 timer (figur 2A, højre panel). For at undersøge virkningen af ​​FLJ10540 på human celle migration lungecancer, blev stabile cellelinjer, der udtrykker HA-FLJ10540 eller vehikelkontrol podet på Transwell kamre. Resultaterne viste, at FLJ10540 CL

1-0-stabile transfektanter kunne øge deres migration, som målt ved Transwell migration assay; dette blev sammenlignet med kontrollen køretøj, hvor meget få celler migrerede (figur 2B, venstre øvre panel). Kvantitativt set migration evne FLJ10540 CL

1-0-stabile transfektanter var ca. 6-7 gange højere end for køretøjets kontrol (figur 2B, højre øverste panel). Vi næste gennemført en

in vitro

invasion under anvendelse en Matrigel belagt barriere filter. Efter en 24 timers inkubation i en Matrigel-coated Transwell kammer, FLJ10540 CL

1-0-stabile transfektanter havde invaderet basalmembranen materiale og passeres gennem porerne for at nå undersiden af ​​filteret (figur 2B, nederste venstre panel) . Tilsvarende FLJ10540 CL

1-0 udtrykkende celler viste en 10-12 gange højere invasion evne end køretøj kontrol celler (figur 2B, højre bund panel).

(A, venstre panel) HA-mærket -FLJ10540 stabile kloner af CL

1-0 celler blev etableret. Cellelysaterne blev underkastet immunoblotanalyse med anti-HA-antistof. (A, midterste panel) Fase kontrast billeder af monolagkulturer af CL

1-0 celler, der udtrykker FLJ10540 og kontrol køretøj blev vist. (A, højre panel) For at måle celle vækstrater, 5 × 10

3 celler af køretøjer-CL

1-0 og CL

1-0-FLJ10540 stabile kloner blev udpladet på dag 0 i 96- brønds plader med 10% FBS. Cellerne blev talt på angivne tidspunkter ved MTT-assayet (OD

570) for at kvantificere cellevækst. Data blev normaliseret mod OD

570 værdi på dag 0. Væksten i CL

1-0-celler er vist som gennemsnit ± standardafvigelse. af tre uafhængige forsøg. (B, øvre panel) Med henblik på overgangen assay 5 × 10

3 celler af køretøj-CL

1-0 og CL

1-0-FLJ10540 stabile kloner blev podet ind i toppen af ​​en Transwell insert . Efter 24 timer blev cellerne på oversiden skrabet, og de celler, der migrerede til bunden blev fikseret og farvet med Giemsa. Migrationen relative gange køretøj-CL

1-0 og CL

1-0-FLJ10540 stabile kloner blev normaliseret med kontrol køretøj og præsenteret skematisk. (B, bundpanel) for invasionen assay 1 × 10

4-celler blev podet efter Matrigel blev tilsat. Invasionen relative fold af stabile klon blev normaliseret mod vehikel celler og vist skematisk. Alle data repræsenterer middelværdien ± standardafvigelse. af tre uafhængige forsøg.

andet at undgå klonale virkninger blev en retroviral-baserede Flag-tagget FLJ10540 inficeres i en RK3E cellelinje (figur S2A), der tidligere var blevet anvendt med succes til at evaluere migration eller invasion induceret af forskellige gener og signalveje, såsom fibroblastvækstfaktor 9 (FGF9) [24], K-ras [25], og snail [26]. RK3E celler udviser flere funktioner i epitel, såsom en næsten normal karyotype og en lav baggrund af cellemigrering og invasion. Blandede puljer af inficerede RK3E celler blev anvendt til migrationen og invasion assays. Igen, FLJ10540 udtrykkende celler viste en 4-5 gange højere evne migration end køretøjer kontrol celler (Figur S2B) og en 7 gange højere invasion evne end køretøjer kontrol celler (Figur S2C). Tilsammen disse resultater understøtter den hypotese, at FLJ10540 kan fremme celle migration og invasion i pattedyrsceller.

Knock-down af endogen FLJ10540 af siRNA undertrykker lungekræft celle migration og invasion

For at bekræfte, at FLJ10540 påvirker celle migration og invasion i humane lunge kræftceller, brugte vi en siRNA tilgang til at hæmme endogen udtryk for FLJ10540 og derefter analyseret migrationen og invasion evner CL

1-5 og H1299 celler. For det første at undersøge specificiteten af ​​siRNAs, en HA-mærket FLJ10540 ekspressionskonstruktet var cotransficeret med tre forskellige siRNAs; disse bestod af to kemisk syntetiserede siRNA’er specifikke for FLJ10540 (siFLJ10540-1 og siFLJ10540-2) og en negativ kontrol siRNA, der blev hver transficeret ind HEK293T celler. Begge FLJ10540 siRNA’er viste næsten fuldstændig inhibering af HA-mærket FLJ10540 ekspression som vist ved Western blot-analyse under anvendelse af et anti-HA-antistof, mens niveauet af HA-mærket FLJ10540 forblev høj med den negative kontrol siRNA (data ikke vist). For det andet at undersøge, om de specifikke FLJ10540 siRNA’er kunne inhibere endogen FLJ10540 ekspression i CL

1-5 og H1299-celler, transficerede vi siRNAs i CL

1-5 og H1299-celler i 24 timer, efterfulgt af western blot analyse ved anvendelse af et antistof mod FLJ10540. Dataene viste en dramatisk reduktion i FLJ10540 proteinniveauer med både FLJ10540 siRNAs, og der var ingen signifikant reduktion af FLJ10540 når den negative siRNA blev anvendt (figur 3A og B, venstre panel). Imidlertid proliferationshastighed, som bestemt ved MTT-assayet, var ikke signifikant forskellig mellem de negative kontrolceller og celler, der udtrykker FLJ10540 siRNA’er i løbet af 24 timer (figur 3A og B, midterste panel). For det tredje, for at studere virkningen af ​​siRNA FLJ10540 transfektion om migration, negativ kontrol og siRNA FLJ10540-transficerede CL

1-5 eller H1299 celler blev separat podet på Transwell kamre med uovertrukne filtre. Efter 24 timers inkubation blev fundet motilitet potentiale siRNA FLJ10540 celler at være stærkt inhiberet af siRNA’er (figur 3A og B, højre panel). Endelig blev de samme paneler af negative eller FLJ10540 siRNA transficerede celler podet i en Matrigel-coated Transwell kammer. Efter 24 timers inkubation, den invasive potentiale af siRNA FLJ10540 celler syntes at være betydeligt reduceret (figur 3A og B, højre panel). Disse resultater støtter stærkt tanken om, at FLJ10540 spiller en rolle i celle migration og invasion i humane lunge kræftceller.

(A og B, venstre panel) En negativ kontrol siRNA med to forskellige FLJ10540 siRNA’er (siFLJ10540-1 og siFLJ10540-2) blev transficeret ind i CL

1-5 og H1299-celler i 24 timer. Efter transfektion blev western blotting udført under anvendelse af anti-FLJ10540 og anti-p-actin-antistoffer. (A og B, midterste panel) For at måle celle vækstrater, 5 × 10

3 celler af negativ kontrol-CL

1-5, CL

1-5-FLJ10540 siRNAs, negativ kontrol-H1299, og H1299-FLJ10540 siRNA’er blev udpladet på dag 0 i 96 brønds plader med 10% FBS. Cellerne blev talt på angivne tidspunkter ved MTT-assayet (OD

570) for at kvantificere cellevækst. Data blev normaliseret mod OD

570 værdi på dag 0 af hver behandling. Vækstraten for CL

1-5 og H1299 celler er vist som middelværdi ± standardafvigelse. af tre uafhængige forsøg. (A og B, højre panel) Migrationen relative gange og invasionen relative fold af CL

1-5 og H1299 blev normaliseret mod negative kontrolceller og vist skematisk. Resultaterne repræsenterer middelværdien ± standardafvigelse. af tre uafhængige forsøg.

Brug af begrebet syn-udtryk for at afdække VEGF-A, men ikke VEGF-B, som opstrøms regulator af FLJ10540

Gener tilhører samme pathway viser ofte de samme udtryk profiler, der er nævnt som syn-udtryk [27]. Derfor, for at kortlægge den potentielle signalvejen eller opstrøms regulator (er), der deltager i FLJ10540-fremkaldte migration og invasion egenskaber, vi ansat vores lungekræft microarray datasæt, som tidligere beskrevet, at få indsigt i den funktionelle overensstemmelse mellem co-udtrykte gener. For at teste denne hypotese, vi først undersøgt, om mRNA-ekspression profil

FLJ10540

korrelerer med helst ligand eller receptor i vores lungekræft microarray database (figur 1). Af disse co-udtrykte gener, den øverste kandidat er

VEGF-A

, som meget var positivt korreleret med mRNA ekspressionsniveauet af

FLJ10540

i parrede lungekræftpatienter (r = 0,7 p 0,001) (figur 4A). VEGF-A er kendt for at være en kritisk pro-angiogen faktor, med evner til at regulere mange trin i den angiogene proces, herunder proliferation, migration, invasion, og overlevelse [28], [29]. Faktisk er VEGF-A stærkt udtrykt i mange maligne tumorer, herunder lungecancer [30], [31], [32], og ekspressionen af ​​VEGF-A er associeret med dårlig prognose [33], [34] og tilstedeværelse af lymfeknudemetastaser [35], øge muligheden at de biologiske roller FLJ10540 og VEGF-A kan være funktionelt forbundet i lunge adenocarcinom.

(A) de microarray ekspressionsmønstre for

VEGF-A

FLJ10540

i lungeadenokarcinom patienter blev vist. Resultaterne blev normaliseret mod ekspressionsmønstre for 56 chips (HG_U133A). N: hosliggende ikke-tumorvæv; T: tumorvæv. (B, venstre panel) VEGF-A inducerede en stigning i FLJ10540 proteinniveauer på en dosis-afhængig måde. Efter behandling med forskellige koncentrationer af VEGF-A (venstre panel) eller VEGF-B (højre panel) i 10 minutter i CL

1-0 celler, de totale proteiner blev ekstraheret fra CL

1-0 celler og probet med antistof mod FLJ10540. (B, midterste panel) Serum-udsultede CL

1-0-celler blev forbehandlet med eller uden forskellige koncentrationer af SU5416 i 2 timer; Cellerne blev derefter stimuleret med 20 ng /ml VEGF-A i 10 min. β-actin blev anvendt som en intern loading kontrol. (C) Serum-udsultede CL

1-0 celler blev forbehandlet med eller uden SU5416 i 2 timer; Cellerne blev derefter stimuleret med VEGF-A (i en koncentration på 20 ng /ml) i 3 timer. De migration og invasion relative-folder blev normaliseret mod køretøjer celler. (D, venstre, øvre panel) Med henblik på overgangen assay 5 × 10

3 celler af køretøj-CL

1-0 og CL

1-0-FLJ10540 stabile kloner blev podet ind i toppen af ​​en Transwell indsætte og fik lov til at klæbe i 12 timer, og blev derefter inkuberet med eller uden VEGF-A (20 ng /ml) i 3 timer. Ved afslutningen af ​​assayet blev cellerne på oversiden skrabet, og de celler, der migrerede til bunden blev fikseret og farvet med Giemsa. (D, venstre, nedre panel) for invasionen assay 1 × 10

4-celler blev podet efter Matrigel blev tilsat, og blev derefter inkuberet med eller uden VEGF-A (20 ng /ml) i 3 timer. Alle data repræsenterer middelværdien ± standardafvigelse. af tre uafhængige forsøg. (E) Indirekte immunofluorescens analyse af FLJ10540 i VEGF-A-behandlede celler. Den proteinekspression og den subcellulære lokalisering af FLJ10540 blev analyseret i nærvær eller fravær af VEGF-A (20 ng /ml) i CL

1-0 celler under anvendelse immunfluorescens mikroskopi. Efter at være blevet inkuberet med eller uden VEGF-A i 30 min eller 180 min blev cellerne fikseret med 3,7% formaldehyd og behandlet til indirekte immunfluorescens mikroskopi. FLJ10540 translokeres til cellemembranen ved VEGF-A behandling (pilespids). Bar:. 10 um

I betragtning af den store rolle af VEGF-A i reguleringen migration og invasiv, vi var først interesseret i, om VEGF-A kunne modulere FLJ10540 proteinekspression. Resultaterne viste, at proteinet ekspressionsniveauet af FLJ10540 blev opreguleret i et VEGF-A dosisafhængig måde i CL

1-0 lungecancerceller (figur 4B, venstre panel). Vi næste spurgt, om den antagonistiske effekt af SU5416 kunne en VEGFR-2-tyrosinkinase-inhibitor, på biologiske aktiviteter af VEGF-A tilskrives inhiberingen af ​​FLJ10540-protein-overekspression induceret af VEGF-A i lungecancerceller. Resultaterne viste, at opregulering af FLJ10540 i nærvær af VEGF-A blev inhiberet ved samtidig tilsætning af SU5416 på en dosis-afhængig måde (figur 4B, midterste panel). Tværtimod blev proteinniveauet af FLJ10540 ikke påvirket af behandling med VEGF-B (figur 4B, højre panel). Faktisk

FLJ10540

deler ikke lignende ekspressionsmønstre med

VEGF-B

, i hvert fald ikke i vores lungekræft microarray, støtter tanken om, at synexpression mønstre kan bruges til at udlede funktionen af ukendte gener [27].

VEGF-A-induceret FLJ10540 overekspression og translokation forbedrer lungekræft celle migration og invasion gennem en EMT-uafhængig vej

for at teste den biologiske betydning af VEGF-A induceret opregulering af FLJ10540, undersøgte vi indflydelsen af ​​FLJ10540 om migration og invasion i nærvær eller fravær af VEGF-A. Først undersøgte vi, om forældrenes CL

1-0 celler kunne vise celle motilitet efter stimulation af VEGF-A. I figur 4C, CL

1-0 celler udviste mere migration og invasive evner i nærvær af VEGF-A alene end VEGF-A kombineret med SU5416 eller vehikel alene, hvilket antyder, at tilsætningen af ​​VEGF-A signifikant øget migration og invasion af CL

1-0 celler, som blev modsvaret af en stigning i FLJ10540 niveauer. Lignende resultater blev fundet i FLJ10540 CL

1-0-stabile transfektanter, med eller uden VEGF-A stimulering (figur 4D).

For at teste, om den subcellulære lokalisering af FLJ10540 kunne ændres i lunge kræftceller på VEGF-A stimulering vedtog vi den indirekte immunofluorescens tilgang til at observere FLJ10540 lokalisering i CL

1-0 lungekræft celler enten med eller uden VEGF-A stimulering. Som vist i figur 4E, VEGF-A behandling ikke kun medført en stigning i FLJ10540 proteinekspression, men det fremmede også translokation af en fraktion af FLJ10540 til cellemembranen. Desuden er forskellene i cellemorfologi var tydeligere, fremhæver udvidelse af VEGF-A-behandlede celler (figur 4E, 30 min og 180 min) sammenlignet med den afrundede CL

1-0 celler (figur 4E, 0 min ). Disse morfologiske ændringer fik os til at undersøge fænomenet epitelial-mesenkymale overgang (EMT). Under tumorigenese, kan EMT øge motilitet og invasionsevne af cancerceller, og malign transformation kan være forbundet med signalveje fremme EMT [36]. En tidligere undersøgelse viste også, at ekstracellulære signaler induceret af VEGF-A er stærkt impliceret i EMT i humane pancreas carcinomceller [37]. For at undersøge, om FLJ10540 kunne mægle VEGF-A-induceret EMT og dermed øge celle migration og invasion, vi brugte H1299 og CL

1-0 lungekræft celler, med eller uden VEGF-A stimulering, at behandle dette spørgsmål. Trods stigende celle motilitet ved overekspression FLJ10540 eller faldende celle motilitet af FLJ10540-medierede siRNA’er, forskelle i FLJ10540 niveauer på ingen måde ændre ekspressionsniveauerne af nogen af ​​de markørproteiner forbundet med EMT, såsom E-cadherin og vimentin ( data ikke vist). Derfor FLJ10540 synes at mægle migration og invasion virkninger af VEGF-A uafhængigt af EMT og ikke synes at spille en rolle i reguleringen af ​​EMT, i det mindste i de lungekræft cellelinier vi analyserede.

En positiv af tre uafhængige forsøg.