PLoS ONE: Mesenchymale til Epithelial Transition induceret af omprogrammering Faktorer Dæmper malignitet af kræftceller

Abstrakte

Epithelial til mesenkymale overgang (EMT) er en biologisk proces af metastatisk cancer. Imidlertid er en effektiv anticancerterapi, som direkte er rettet mod EMT program endnu ikke er opdaget. Nylige undersøgelser har indikeret, at mesenkymale til epitelial overgang (MET), den omvendte fænomen EMT, er observeret i fibroblaster under genereringen af ​​inducerede pluripotente stamceller. I den foreliggende undersøgelse undersøgte vi virkningerne af omprogrammering faktorer (RFS) på pladecellecarcinom (SCC) celler. RFS-introduceret kræftceller (RICS) demonstrerede de forbedrede epitel egenskaber i morfologi med ændret udtryk af mRNA og microRNA. De motilitet og invasive aktiviteter RIC

in vitro

blev væsentligt reduceret. Desuden xenografter af RIC udviste ingen lymfeknude metastaser, mens metastaser blev påvist i forældrenes SCC-podede mus. Vi konkluderede derfor, at RIC genvandt epitel egenskaber gennem MET og viste nedsat kræft malignitet

in vitro

in vivo

. Derfor kan forståelsen af ​​MET-processen i cancerceller ved indføring af RFS føre til udformningen af ​​en ny anticancer strategi

Henvisning:. Takaishi M, Tarutani M, Takeda J, Sano S (2016) Mesenchymale til epiteliale Transition induceret af omprogrammering Faktorer dæmper malignitet af kræftceller. PLoS ONE 11 (6): e0156904. doi: 10,1371 /journal.pone.0156904

Redaktør: William B. Coleman, University of North Carolina School of Medicine, UNITED STATES

Modtaget: December 23, 2015; Accepteret: 20 maj 2016; Udgivet: 3 juni 2016

Copyright: © 2016 Takaishi et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. M. Takaishi blev støttet af den japanske undervisningsministerium, videnskab, sport og kultur (https://www.jsps.go.jp/english /e-grants/index.html). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kræft er en livstruende tilstand med stigende dødelighed, når det metastaserer. Selv om mekanismer i kræft metastaser er endnu ikke fuldt forstået, er det kendt, at erhvervelsen af ​​invasive egenskaber er drevet af epitelial til mesenkymale overgang (EMT) [1, 2]. Cancer under EMT er karakteriseret ved et tab af intercellulære adhæsioner, en gevinst på cellemotilitet og forøget invasiv aktivitet. En vigtig egenskab ved EMT er funktionelt tab af vedhæftningen junction protein, E-cadherin (CDH1), via flere mekanismer, herunder genmutation, hypermethylering, og undertrykkelse af dets promotor [1, 3, 4].

Undertrykkende transkriptionsfaktorer til CDH1 omfatter (a) Snail familie (SNAI1 og SNAI2) [5, 6], (b) Twist familie (TWIST1 og TWIST2) [7, 8] og (c) ZEB familie (ZEB1 /dEF1 og ZEB2 /SIP1) [9-11]. Disse transskriptionsfaktorer kan interagere med E-box element i

CDH1

promotor, der fører til nedregulering af sit udtryk. Den overekspression af disse EMT-inducerende gener er ofte observeret i de metastatiske cancerceller [1, 3, 4]. Tværtimod nedreguleringen af ​​EMT-inducerende genekspression genskaber

CDH1

ekspression og fører til dæmpningen af ​​kræft malignitet gennem en mekanisme kaldet mesenchymal at epitel overgang (MET), den omvendte program af EMT [1, 12-14].

MikroRNA’er (miRNA) er små ikke-kodende RNA, der regulerer deres målgener udtryk ved post-transkriptionelle niveau og er kendt for at spille vigtige roller i forskellige typer af kræft. Det er blevet rapporteret, at EMT-inducerende transkriptionsfaktorer, som undertrykker

CDH1

ekspression, er negativt reguleret i miRNA (MIR-200 familie, mir-203, og MIR-205, etc.) [15 -17].

Under genereringen af ​​inducerede pluripotente stamceller (iPSCs) fra murine fibroblaster ved indføring af fire omprogrammering faktorgener, Oct3 /4, Sox2, Klf4, og Myc, cellerne gik gennem MET [ ,,,0],18, 19]. Mens iPSCs er blevet genereret fra de primære celler, de seneste undersøgelser har undersøgt mulighederne for at omprogrammere de maligne celler, herunder leukæmi, sarkom, melanom og andre typer af kræftceller til at udvise en iPSC-lignende tilstand

in vitro

[ ,,,0],20-25]. De omprogrammerede maligne celler viste en pluripotent-lignende tilstand med en ændret differentiering program, der førte til tab af tumorigenicitet. Men det var usikkert, om kræft malignitet blev svækket gennem MET-medieret mekanisme med omprogrammering faktorer.

Således er formålet med nærværende undersøgelse er at vise, at SCC cellerne mindske maligne potentiale

in vitro

og

in vivo

gennem MET ved indførelsen af ​​omprogrammering faktorer uden pluripotente-lignende tilstand. Disse resultater er yderst relevante for at udvikle nye og effektive terapeutiske strategier for kræftbehandling.

Materialer og metoder

Generering af iPS-celler ved hjælp piggyBac transposon systemet

Normale menneskelige epidermiskeratinocytter ( NHEKs) isoleret fra Forhud blev opnået fra Kurabo (Osaka, Japan) og blev dyrket i Epilife II (Invitrogen) suppleret med Humedia-KG (Kurabo). pCMVmPBase og plasmider indeholdende piggyBac transposon, der bærer omprogrammering faktorer (POU5F1 (OCT3 /4), SOX2, KLF4, cMYC, og LIN28) [26, 27] blev transficeret ind i NHEKs med neon transfektionssystem (Invitrogen). De transficerede NHEKs blev straks podet på fødeceller i Primate ES Cell Medium (ReproCell, Yokohama, Japan) suppleret med bFGF (4 ng /ml), Y-27632 (10 uM), CHIR99021 (3 uM), PD0325901 (0,5 uM) og SB431542 (5 uM), alle disse reagenser var fra Wako ren kemiske Industries (Osaka, Japan). Mediet blev skiftet til frisk hver anden dag. ES-celle lignende kolonier fremkom på dag 10-14, og blev plukket og udvides yderligere på ca. dag 21. For at undersøge om IPS celler afledt fra NHEKs har ES-lignende fænotype, blev cellerne farvet med alkalisk phosphatase-substrat-kit (Vector Laboratories, Burlingame, CA), og med anti-Nanog antistof (Abcam, Cambridge, UK). IPS-celler blev indpodet i testiklerne af SCID-mus (CLEA Japan, Tokyo, Japan) under anæstesi og musene blev aflivet for at udskære testiklerne på dag 60 efter celle transplantation. Testiklerne blev fikseret med formalin og bearbejdet til paraffin sektion til histopatologisk undersøgelse.

Cellelinjer

Menneskelig SCC cellelinjer, HOC313 og TSU [28, 29], blev begavet af Dr. Kamata, Institut for Biomedical Sundhedsvidenskabelige Fakultet, Hiroshima University, Japan. De OSC-19 celler og NCCIT celler blev købt fra den japanske Indsamling af forskning Bioressourcer Cell Bank (Ibaraki, Japan). Alle cellelinier blev opretholdt i Dulbeccos modificerede Eagle-medium (DMEM; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Suppleret med 10% kalvefosterserum (FBS) og antibiotika

Indførelse af omprogrammering faktorer

PiggyBac transposon vektor og transposasen-ekspressionsvektoren blev cotransficeret til subkonfluent SCC-celler ved anvendelse af Fugene 6 (Roche, Basel, Schweiz) reagens. To dage efter transfektion blev puromycin ved endelige koncentrationer på 1 ~ 5 ug /ml tilsat til cellekulturmediet til udvælgelse. Cellerne blev holdt i DMEM suppleret med 10% FBS og antibiotika.

Cell morfologisk vurdering

Ændringerne i cellemorfologi blev evalueret ved at beregne længden til breddeforhold på hver celle under et mikroskop under anvendelse af 20 celler pr gruppe.

Kvantitativ real-time RT-PCR

de samlede RNA’er blev udvundet ved hjælp af et RNAeasy (Qiagen, Venlo, Holland) og blev omvendt transskriberet hjælp tilfældige hexamerer og hævet III (Thermo Fisher Scientific). Hver cDNA blev udsat for kvantitativ PCR, ved hjælp af Power SYBR Green PCR Master Mix på Sequence Detection Systems 7300 (Thermo Fisher Scientific). Relativ mRNA-ekspression blev normaliseret til ekspressionen af ​​hypoxanthin guanin phosphoribosyltransferase (HPRT). Primerne anvendt i denne undersøgelse, er opført i S1 tabel.

Påvisning af microRNA

De samlede RNA’er blev fremstillet fra de dyrkede celler under anvendelse af en miRNeasy mini kit (Qiagen). I overensstemmelse med producentens instruktioner, blev hver skabelon cDNA fremstillet under anvendelse af en miScript II RT kit (Qiagen), og ekspressionen af ​​microRNA blev analyseret under anvendelse af en miScript SYBR Green PCR-kittet sammen med miScript Primer Assay (Qiagen). Dette blev efterfulgt af en normalisering af miRNA med SNORD61.

MTS assay

I alt 96 brønde blev anset for undersøgelsen, der indeholdt 1000 celler hver, som blev podet. En og to dage senere, MTS-reagens (Promega, Madison, WI, USA) blev tilsat til hver brønd og inkuberet ved 37 ° C i to timer. Efterfølgende blev absorbansværdierne også bestemt ved 490 nm med et spektrofotometer.

immunfluorescensfarvning Salg

celler dyrket på kammerobjektglas (Thermo Fisher Scientific) blev fikseret enten med 4% paraformaldehyd i PBS-opløsning ved 4 ° C eller 100% methanol ved -20 ° C, og blokeret med serumfrit blokerende opløsning (Dako, Glostrup, Danmark). Primære antistoffer blev inkuberet ved 4 ° C natten over, efterfulgt af vask i PBS og inkubation med sekundære antistoffer konjugeret med Alexa Fluor 488 (Thermo Fisher Scientific). Kernerne blev farvet med 4 ‘, 6-diamidino-2-phenylindol, dihydrochlorid (DAPI). De primære anvendte antistoffer er blevet opført i S2 tabel. Fluorescens billeder blev taget med et mikroskop med en charge-coupled device kamerasystem. (DP-71; Olympus, Tokyo, Japan)

Immunhistokemi

De paraffinindstøbte snit opnået fra xenotransplantater var afparaffineres og inkuberet i 10 mM citratpuffer (pH 6,0) i 10 minutter ved 105 ° C. Snittene blev inkuberet med primære antistoffer natten over ved 4 ° C efterfulgt af vask i PBS og inkubation med de respektive sekundære antistoffer (Dako). Signalerne blev visualiseret under anvendelse af 3,3′-diaminobenzidintetrahydrochlorid (DAB). Kerner blev modfarvet med hematoxylin. De primære antistoffer anvendt i denne undersøgelse, er anført i S2 tabel.

flowcytometri

cellesuspension blev inkuberet med anti-TRA-1-60 (Millipore), TRA-1-81 (Millipore ) eller muse-IgM (Bioledend) som isotypekontrol i 30 min på is og efterfulgt af inkubation med Alexa fluor 488-konjugeret anti-muse-IgM-antistof. Cellerne blev analyseret på en LSRFortessa flowcytometer (BD Biosciences) ved hjælp FlowJo software (FlowJO, Ashland, OR).

Elektronmikroskopi

Fuldt sammenflydende celler i 35 mm skåle blev fikseret med 2% glutaraldehyd i 0,1 M phosphatpuffer (pH 7,3) og post-fikseret med 1% osmiumtetroxid, efterfulgt af 5% sucrose i 0,1 M phosphatpuffer. Propylenoxid anvendtes til opløsning dyrkningsskålene at opnå de cellelag. De ultratynde snit blev iagttaget under anvendelse af et Hitachi H-7100-elektronmikroskop (Hitachi High-Technologies, Tokyo, Japan).

Western blot-analyse

Cellelysaterne blev fremstillet ved anvendelse radioimmunudfældning assaybuffer (RIPA buffer; Sigma-Aldrich, St-Louis, MO, USA) eller urinstof-opløsning (9 M urea, 2% Triton-100, 5% 2-mercaptoethanol), separeret på 4-15% gradient-geler (Bio-Rad, Richmond, CA, USA) og blottet på polyvinyldifluorid (PVDF) membraner (Bio-Rad). Et ECL Prime kit (GE Healthcare, Little Chalfont, UK) blev anvendt til signaldetektering. De anvendte antistoffer er anført i S2 tabel. ImageJ (NIH) blev anvendt til kvantificering af signalerne.

In vitro

sårheling assay

Fuldt sammenflydende celler i seks vel-plader blev behandlet med mitomycin C (10 ug /ml) i tre timer, efterfulgt af bunden sårdannelse bruger gul mikropipettespids og vask med en forvarmet medium. Sårheling ved migrerende celler blev observeret ved hjælp af et fasekontrast mikroskopi og blev fotograferet på de angivne tidspunkter. Afstanden af ​​cellemigration hen over såret blev målt over tid.

Cell invasion assay

In vitro

celleinvasion blev vurderet ved anvendelse Boyden-kamre i nærvær af matrigel belægning ( Corning, Corning, NY, USA). I alt 25 × 10

3-celler blev inokuleret i de øvre kamre i plader med 24 brønde og inkuberet i 24 timer. Cellerne fastgjort til membranen mellem den øvre og nedre kamre blev farvet med toluidinblåt og talt under et mikroskop.

Xenotransplantation af humane SCC celler i nu /nu mus Salg

I ortotopisk model, de dyrkede parentale eller omprogrammering faktorer indført OSC-19 celler, som blev suspenderet i PBS med en tæthed på 1,0 x 10

7 celler /ml. Under isofluran anæstesi, 2,0 × 10

5 levedygtige celler blev inokuleret i den linguale margen af ​​kvindelige syv uger gamle BALB /c-nu /nu-mus (Japan SLC, Hamamatsu, Japan). Legemsvægt af musene blev målt tre gange om ugen for at overvåge deres tilstand indtil eksperimentelt slutpunkt. Tungerne og drænende lymfeknuder blev dissekeret fra de aflivede mus på dag 21. Tungerne blev fikseret med formalin og bearbejdet til histologisk analyse. Tumoren områder i tungen væv blev beregnet under et mikroskop ved hjælp af software (DP2-BSW, Olympus). Totalt RNA blev ekstraheret fra cervikale lymfeknuder, og genekspressionen af ​​human cytokeratin 18 blev vurderet via kvantitativ real-time RT-PCR. For fjernt organ metastase-model, de parentale OSC-19 celler og RICS var suspendere ved en tæthed på 1,0 x 10

6 celler /ml og 2,0 × 10

5-celler blev transplanteret via halevenen på kvindelige nu /nu mus. Dag 47 efter celletransplantationen blev musene aflivet og efterfulgt af obduktion. Kraniale lap af højre lunge blev anvendt til mRNA-ekstraktion og fulgte kvantitativ real-time RT-PCR til påvisning af genekspression af human cytokeratin 18. Venstre lunge, lever, nyre og milt blev fikseret med formalin og bearbejdet til histologisk analyse. Det blev sikret, at alle forsøg med mus strengt til de institutionelle retningslinjer for minimering nød til dyr. Undersøgelsen blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg for Kochi Medical School.

Statistisk analyse

Statistisk analyse blev udført med Prism-software (GraphPad, CA, USA) ved hjælp af en uparret Student

t

test og Fishers eksakte test.

Resultater

Indførelse af omprogrammering Faktorer (RFS) i SCC Celler Gendanner epithelmorfologi men giver ikke den pluripotens

at introducere RFS, brugte vi piggyBac transposon vektor, hvor

POU5F1

(

OCT3 /4

),

SOX2

,

KLF4

,

cMYC

, og

LIN28

indgik [26, 27]. Ved anvendelse af denne kunne vi med succes generere iPS-celler (Fig 1B) fra normale humane epidermale keratinocytter (fig 1A). IPS celler udtrykte alkalisk fosfatase (Fig 1C) og NANOG (Fig 1D), der angiver stemness. De udviklede teratomer

in vivo

og viste tre kim elementer, nemlig epitel (Fig 1F), neural epitel (Fig 1G) og brusk (figur 1 H). For at undersøge effekten af ​​RFS på kræftceller

in vitro

, brugte vi tre humane SCC linjer: HOC313, TSU, og OSC-19 celler. Blandt dem, de to cellelinier, HOC313 og TSU, havde en fibroblastlignende spindel form med øget Snail1 og faldt E-cadherin ekspression, hvilket indikerede, at SCC-celler undergik EMT [30]. Brug af denne transposon vektorsystem, blev SCC linier indført RFS, som bedømtes ved Western blotting (Fig 2C). Påfaldende, RF-introduceret cancerceller (RICS) fra alle de SCC linier viste en drastisk morfologisk ændring fra spindel til polygonal form (Fig 2A). Evaluering af celle længde /bredde-forhold mellem parental SCC’er og RIC afslørede specifik reduktion i sidstnævnte (fig 2B), hvilket antyder, at MET også blev induceret i SCC’er som vist i fibroblast under induktion af IPC’er af RF [18, 19]. Det skal bemærkes, at RIC fra begge kræft linjer ikke udtrykte TRA-1-60 og TRA-1-81, overfladen markører for pluripotente celler, mens en teratom linje NCCIT udtrykte dem med Western blotting (Fig 2D) og flowcytometri (fig 2E og 2F). Dette resultat antydede, at RIC ikke erhverve pluripotens selv efter introduktionen med RFS. For at undersøge virkningen af ​​behandling fremkaldt af RFS vi brugt HOC313 celler og OSC-19 celler til yderligere undersøgelse.

(A, B) Fase kontrast billede af normale humane epidermale keratinocytter (NHEK) (A) og iPS celler genereret fra NHEK ved indføring af piggyBac transposon vektorer (B). Barer, 200 um i A B. (C, D) IPS celler har alkalisk fosfatase aktivitet (C) og udtrykker NANOG (D), hvilket tyder på stemnss af de menneskelige keratinocyt afledte iPS celler. Barer, 100 um i C D. (E) teratomer blev udviklet, da IPS cellerne blev podet i testiklerne af SCID-mus. Bar, 400 um. (F-H). De teratomer havnen tre kim lag elementer, epitel (F), neurale epitel (G) og brusk (H), hvilket indikerer pluripotens af IPS celler. Barer, 100 um i F, G og H.

(A) Forældrekontrol humane SCC-celler (til venstre) i HOC313 og TSU show fibroblast-lignende morfologi; imidlertid omprogrammering faktorer indført celler (RIC, højre paneler) udviser polygonal, epitel-lignende morfologi. RICS fra OSC-19 celler viser flere huler celle koloni end stamcellerne. (Scale bar, 100 um) (B) Cellulær morfologi kvantificeres ved længde til breddeforhold på hver celle fra mindst 20 celler hver fra parentale SCC-celler (åbne cirkler) og RIC (lukkede cirkler). Forholdet mellem RIC nærmer sig én, der angiver dem som epitel, Mangekantet celler. **

P

0,01 af Student

t

-test. (C) De indførte omprogrammering faktorer blev evalueret ved Western blot analyse. P, parentale celler. R, RIC. β-Actin (ACTB) blev anvendt som indlæsning kontrol. (D-F) Ekspression af TRA-1-60 og TRA-81 blev undersøgt ved Western blotting (D) og flowcytometri (E, F). De repræsentative data og middelværdi ± SD af tre uafhængige forsøg af flowcytometri blev vist i E og F, henholdsvis. Hypoxanthin-guanin-phosphoribosyltransferase (HPRT) blev anvendt som ladningskontrol i (D). Blå linier; de specifikke antistoffer, røde linjer; isotypekontrol muse-IgM i (E). NCCIT, et menneske teratom cellelinje, blev anvendt som kontrol i (DF).

Mesenchymale-Epitelial Transition Forekommer i RIC

Vi næste undersøgt ændringer i ekspressionen af ​​epitelial og mesenchymale signatur gener i RIC fra HOC313 og OSC-19 celler under anvendelse af QRT-PCR. Epiteliale signatur gener, herunder

CDH1

,

DSC 2

,

DSP

,

TGM1

, og

JUP

var signifikant opreguleret i begge RIC sammenlignet med de respektive parentale celler (fig 3A og 4A). Opregulering af

ITGA6

og

ITGB4

i RIC fra

HOC313

celler og

KRT14

i RIC fra OSC-19 celler blev også observeret. Imidlertid ekspression af en af ​​epitelet-specifikke transkriptionsfaktor, grainyhead-lignende protein 2 homolog (GRHL2) blev ikke ændret mellem parentale celler og RIC begge SCC linjer.

(A, B) Ændring af genekspression profil i RIC fra HOC313 celler, epitel- markørgener (A) og mesenchymale markørgener (B). Ekspressionen af ​​mRNA blev normaliseret med HPRT, og den relative mængde af hvert gen blev vist. Blå barer, forældrenes celler. Røde barer, RICS. Søjler repræsenterer middelværdi ± SD fra mindst tre uafhængige forsøg. **

P

0,01. Student

t

-test. (C) Western blot analyse. P, parentale celler. R, RIC. (D) Signalerne i den vestlige analyse blev kvantificeret ved hjælp ImageJ. Signaler blev normaliseret med HPRT. Fold ændring i RIC fra parentale celler var repræsenteret, middelværdi ± standardafvigelse og middelværdi-forhold på tre uafhængige eksperimenter. (E) immunfluorescensfarvning af forældrenes HOC313 celler og RICS med anti-pankeratin (KRTs), og β-catenin (CTNNB1) antistoffer. (F) Elektronmikrografier. Pile angiver desmosom-lignende strukturer. Scale bar, 0,2 um. (G) Ekspression af miRNA i RIC (røde søjler) i forhold til forældrenes HOC313 celler (blå søjler). miRNA blev normaliseret med SNORD61. Søjler repræsenterer middelværdi ± SD fra mindst tre uafhængige forsøg. **

P

0,01 af Student

t

-test.

(A, B) Ændring af genekspression profil i RIC fra OSC-19 celler, epitel markørgener (A) og mesenkymale markørgener (B). Ekspressionen af ​​mRNA blev normaliseret med HPRT, og den relative mængde af hvert gen blev vist. Blå barer, forældrenes celler. Røde barer, RICS. Søjler repræsenterer middelværdi ± SD fra mindst tre uafhængige forsøg. *

P

0,05, **

P

0,01. Student

t

-test. (C) Western blot analyse. P, parentale celler. R, RIC. (D) Signalerne i den vestlige analyse blev kvantificeret ved hjælp ImageJ. Signaler normaliseret med HPRT. Fold ændring i RIC fra parentale celler var repræsenteret, middelværdi ± standardafvigelse og middelværdi-forhold på tre uafhængige eksperimenter. (E) immunfluorescensfarvning af parentale OSC-19 celler og RICS med anti-pankeratin (KRTs), anti-E-cadherin (CDH1), og anti-desmocollin2 (DSC2) antistoffer. (F) Elektronmikrografier. Pile viser desmosom eller desmosom-lignende strukturer. Scale bar, 0,2 um. (G) Længde af desmosomer eller desmosom-lignende strukturer på elektronmikrofotografier. Middelværdi ± standardafvigelse af de 30 objekter. **

P

0,01 af Student

t

-test. (H) De desmosomer eller desmosom-lignende struktur med tonofilaments blev talt blandt de 30 objekter. (I) Ekspression af miRNA i RIC (røde søjler) i forhold til forældrenes OSC-19 celler (blå søjler). miRNA blev normaliseret med SNORD61. Søjler repræsenterer middelværdi ± SD fra mindst tre uafhængige forsøg. **

P

0,01 af Student

t

-test.

Omvendt RIC fra HOC313 celler viste en signifikant reduceret ekspression af mesenkymale signatur gener (Fig 3B), herunder

TGFB1

,

TGFBR2

,

SNAI1

,

SNAI2

og

ZEB2

. OSC-19 RIC viste reduceret genekspression af C

DH2

,

TGFB2

,

TGFBR2

,

VIM

COL1A2

( fig 4B). Blandt de mesenkymale markørgener,

TGFBR2

var almindeligt nedreguleret i RICS fra to linjer. Western blot-analyse påvises et forhøjet indhold af CDH1, JUP (γ-Catenin), DSC2, og KRTs i RIC, der var forbundet med epitel fænotype (Fig 3C og 3D og 4C og 4D). Som overensstemmelse med q-RT-PCR, tab af SNAI2 og gevinst på KRT14 også blev observeret af Western blot i HOC313 RIC og OSC-19 RIC hhv. Tilsvarende processen med immunfarvning afslørede, at OSC-19 RIC havde en markant stigning af keratiner, CDH1 og DSC2 (Fig 4E). Forøget ekspression af keratiner blev også observeret i HOC313 RIC (Fig 3e). Ændret lokalisering af CTNNB1 foreslog forbedret celle til celle adhæsion i HOC313 RIC (fig 3E). Desuden viste elektronmikroskopi modnet desmosom med tonofilaments i HOC313 RIC mens forældrenes celler udviste ufuldstændige desomosome-lignende strukturer, hvor høj elektron tæthed området blev set på, vender to cellemembraner (Fig 3F). I OSC-19 RIC, de desmosomes var større end i de parentale celler, og de fleste af dem udstillede modne tonofilaments, mens de parentale celler viste umodne desmosom uden tonofilaments (Fig 4F og 4H). Kollektivt viste RICS genkomst af desmosom knudepunkter, som er den største karakteristisk for velorganiserede epitelceller, hvilket tyder på markedsøkonomisk behandling.

Vi næste undersøgte mikroRNA (miRNA), der efter sigende målrettet de EMT-fremkaldende molekyler. De HOC313 RIC viste øget niveauer af MIR-200 familiemedlemmer (MIR-200a, -200b, -200c, -141, og -429), MIR-203, og MIR-205 (Fig 3G), som kunne nedregulere Snai og ZEB familier [15-17]. De OSC-19 RIC viste øget niveauer af miR-203 og miR-205, selv om miR-200 familiemedlemmer ikke blev ændret (fig 4I). Dette antydede, at indførelsen af ​​RFS førte til ekspression af EMT-undertrykkende miRNA med nogle forskellige profiler mellem SCC-celler. Sammenfattende RFS inducerede MET i de humane SCC cellelinier ved de transkriptionelle og post-transkriptionelle niveauer.

omprogrammering faktorer påvirker Cell motilitet af SCC

in vitro

Meget udtrykt RFS i RICS (fig 2C) kunne have påvirket celledeling [31], derfor

in vitro

celledeling af RIC blev åbnet. MTS-assayet viste ingen signifikant forskel i celleproliferation mellem RICS og parentale celler (Fig 5A og 5E). Kræftceller under EMT erhvervet øget cellulær motilitet, der førte til invasion og metastase. For at vurdere, om RFS vende celle motilitet af SCC, brugte vi en

in vitro

sårheling assay. Cellen migration af RIC fra HOC313 og OSC-19 var markant svækket sammenlignet med de parentale celler (Fig 5B, 5C, 5F og 5G). I forhold til de parentale celler blev migration evne RIC reduceret til 25% og 40% i HOC313 RIC og OSC-19 RIC hhv. Celle invasionsevne

in vitro

blev evalueret under anvendelse Boyden-kamre i nærvær af matrigel belægning. Antallet af RIC, der migrerede gennem membranen, var betydeligt mindre end de parentale celler (Fig 5D og 5h). Disse resultater indikerer, at både celle motilitet og invasionsevne

in vitro

blev markant forringet i RICS.

HOC313 forældrenes celler og RICS (AD), OSC-19 forældre celler og RICS (EH ). (A, E) blev Celleproliferation undersøgt af MTS-assay. Relativ prolifererede celleantal i 24 timer blev vist. Middelværdi ± standardafvigelse fra tre uafhængige forsøg. NS, Ingen væsentlig forskel. (B, F)

In vitro

sårheling assay viste, at cellemigration blev markant svækket i RIC sammenlignet med de parentale celler. (Scale bar, 500 pm). Repræsentative data er vist fra tre uafhængige forsøg. Tiderne til evaluering er vist. (C, G) Overflytning afstand på RIC (rød bjælke) er væsentligt reduceret i forhold til forældrenes celler (blå bar). Værdierne viser middel ± SD.

n

= 3. **

P

0,01 af Student

t

-test. (D, H) Cell invasiv aktivitet blev reduceret i RIC (røde søjler) sammenlignet med de parentale celler (blå søjler) under anvendelse af Boyden kamre overtrukket med Matrigel. Værdierne viser middel ± SD.

n

= 3. **

P

0,01 af Student

t

-test.

Reduceret

in vivo

Malignitet i RIC

For at undersøge virkningen af ​​behandling induceret af RFS på dæmpningen af ​​SCC malignitet, vi brugt OSC-19 celler, da de var kendt til at metastasere til de cervikale lymfeknuder, når implanteret i linguale margin på nøgne mus [32]. Som påvist i undersøgelsen foretaget af Maekawa

et al

. [32], 2,0 × 10

5 af forældre eller RIC celler blev transplanteret ind i tunger af nøgne mus til at kontrollere, om RIC viste ændret

in vivo

ondartet adfærd. Efterfølgende blev den tumordannelse i tungerne og metastase til de drænende lymfeknuder evalueret på dag 21. Tumorer afledt af RICS udtrykt LIN28, en af ​​RFS (Fig 6A). De viste også højere udtryk for DSC2 end de parentale celler (Fig 6A), hvilket indikerer, at RIC bevaret de forbedrede epitel funktioner oprindeligt observeret

in vitro

(Fig 4A og 4C). Størrelsen af ​​tumorer dannet af RIC (

n

= 15) var signifikant mindre end dannet af de parentale celler (

n

= 15), der angiver dæmpningen af ​​

in vivo

vækst RICS (fig 6A og 6B). Metastaser af de parentale OSC-19 celler til den cervikale lymfeknuder blev detekteret ved tilstedeværelsen af ​​humant keratin18 ekspression under anvendelse af RT-PCR og fundet i 6 ud af 15 parentale celler inokuleret mus, hvorimod ingen metastaser blev fundet i RIC inokulerede gruppe ( fig 6C,

P

0,01 af Fishers eksakte test). Især i mus, som blev inokuleret med parentale SCC-celler, størrelserne af tumormasser korreleret med sandsynligheden for metastase (lukkede cirkler i figur 6B). Faktisk tumor områder i tunger af mus huser metastatisk cancer og ingen metastaser var 4.83 ± 1,65 mm

2 og 1,90 ± 1,85 mm

2, henholdsvis (

P

0,01 ved Students t -prøve). I modsætning hertil de RIC-afledte tumorer ikke metastaserer, selv når de voksede så stort som tumorer af metastaseret parentale celler (Fig 6B). Endvidere at undersøge metastatisk cellernes evne til fjerne organer, blev de parentale OSC-19 celler og RICS transplanteret i nøgne mus via halevenen (2 × 10

5 celler /mus). Cellen transplanterede nøgne mus levede uden nogen symptomer, indtil den eksperimentelle slutpunkt, dag 47 efter celle transplantation. Ingen tumorvækst blev set i thorax eller abdominale organer makroskopisk. Desuden blev der ikke observeret nogen tegn på tumorvækst i lunge, lever, milt og nyre (data ikke vist). Imidlertid er ekspressionen af ​​cytokeratin 18, selvom det var meget lavt niveau, blev påvist fra lungevæv i 2 ud af 4 prøver af OSC-19 parentale celler inokulerede mus, hvorimod intet signal blev påvist i alle prøver fra RIC-inokuleret mus (fig 6D). Dette tyder på tilstedeværelsen af ​​lunge mikrometastase af OSC-19 parentale celler. Således RICS udviser mindre maligne potentiale end de parentale celler

in vivo

(A) Repræsentative billeder af histologi (H 0,05 af Student

t

-test. (C) Påvisning af menneskelig keratin 18 mRNA fra lymfeknuder fra forældrenes celle-podet mus, men ikke fra RICS-podede mus. Ekspression af humant keratin18 i lymfeknuder blev påvist under anvendelse QRT-PCR og blev normaliseret med muse HPRT bortset fra de positive kontroller, som er normaliseret med human HPRT. Lymfeknudemetastaser forekom hos seks ud af 15 mus inokuleret med parentale SCC-celler i tungerne, i skarp kontrast til ingen metastaser i RIC-inokulerede mus. C; styre lymfeknuder uden xenotransplantation, P; forældrenes OSC-19 celler, R; RIC fra OSC-19. Ekspressionsniveauet af humant keratin 18 var næsten ens for de to cellelinier.