PLoS ONE: Den MicroRNA Expression underskrift blærekræft ved Deep sekventering: Den funktionelle betydning af miR-195/497 Cluster

Abstrakt

Aktuel genom-dækkende microRNA (miRNA) udtryk signatur analyse ved hjælp dybe sekventering teknologi kan køre opdagelsen af ​​nye kræft veje reguleret af onkogene og /eller tumor undertrykkende miRNA. Vi bestemt genomet hele miRNA udtryk signatur i blærekræft (BC) ved dyb sekventering teknologi. I alt ti små RNA biblioteker blev sekventeret (fem BCs og fem prøver af histologisk normal blære epitel (NBE)), og 13.190.619 til 18.559.060 ren lille RNA opnåedes læser. I alt 933 kendte miRNA og 17 nye miRNA kandidater blev påvist i denne analyse. Blandt de kendte miRNA, blev i alt 60 miRNA betydeligt nedreguleret i BC sammenlignet med NBE. Vi fandt også, at flere miRNA, såsom

MIR-1 /133a

,

miR-206 /133b

,

Lad-7c /miR-99a

,

miR-143/145

og

miR-195/497

, var placeret tæt på hinanden på fem særskilte loci og udgjorde klynger miRNA. Blandt disse klynger miRNA, vi fokuseret på

miR-195/497

klynge, fordi dette grupperet miRNA ikke var blevet analyseret i BC. Transfektion af moden

miR-195

eller

miR-497

i to f.Kr. cellelinier (dreng og T24) signifikant hæmmede kræft celledeling, migration og invasion, hvilket tyder på, at

miR- 195/497

klynge fungeret som tumorsuppressorer i BC. Med hensyn til de gener, er omfattet af den

miR-195/497

klynge, viste Targetscan algoritme, 6.730 gener var formodede

MIR-195/497

mål, og 113 betydeligt beriget signalveje blev identificeret i denne analyse. Kategorien “Pathways i kræft” blev den mest beriget, der involverer 104 kandidat målgener. Genekspression data viste, at 27 af 104 kandidat målgener faktisk opreguleret i BC kliniske prøver. Luciferasereporteren assays og Western blotting viste, at

BIRC5

WNT7A

var direkte rettet af

miR-195/497

. Afslutningsvis blev afvigende ekspression af klynger miRNA identificeret af dyb sekventering, og nedregulering af

miR-195/497

bidrog til BC progression og metastase. Tumor undertrykkende miRNA-medierede cancer veje giver ny indsigt i de potentielle mekanismer BC onkogenese

Henvisning:. Itesako T, Seki N, Yoshino H, Chiyomaru T, Yamasaki T, Hidaka H, ​​et al. (2014) Den MicroRNA Expression underskrift blærekræft ved Deep sekventering: Den funktionelle betydning af

miR-195/497

Cluster. PLoS ONE 9 (2): e84311. doi: 10,1371 /journal.pone.0084311

Redaktør: Bernard W. Futscher, The University of Arizona, USA

Modtaget: April 2, 2013; Accepteret: November 13, 2013; Publiceret: 10. februar, 2014

Copyright: © 2014 Itesako et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne forskning blev delvist støttet af Ministeriet for Undervisning, Videnskab, sport og kultur Tilskud-i-Aid for Videnskabelig Forskning (C), 23.501.298 og 23.592.340, 2011. Ingen yderligere eksterne midler modtaget for denne undersøgelse. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

i de udviklede lande, blærekræft (BC) er den femte mest almindeligt diagnosticeret tumor og den næsthyppigste dødsårsag hos patienter med urogenitale kanal maligniteter. I USA er der mere end 73.000 nye tilfælde og 14.000 dødsfald årligt [1]. I Japan blev antallet af nye BC patienter anslået til 17.461 i 2007, og antallet af dødsfald blev anslået til 7008 i 2011 [2].

BCs kan inddeles i to kategorier, ikke-muskel-invasiv tumorer og muskel-invasiv tumorer. Selvom 70% -80% af patienterne er diagnosticeret med non-muskel-invasive tumorer, er høj tilbagefald satser (50% -70%) hos disse patienter. Desuden blandt tilbagevendende tilfælde, 15% af BCs videre til muskel-invasiv sygdom [3]. De fem-årige overlevelsesrate for patienter med ikke-muskel-invasiv BC er tæt på 90%, mens den for patienter med muskel-invasiv BC er ca. 60% [4]. Endvidere næsten 80% af patienter med lymfeknudemetastaser dør inden for de første fem år [5]. Da de fleste kliniske studier af kemoterapeutika til avanceret BC har vist begrænsede fordele, nye prognostiske markører og effektive behandlingsstrategier baseret på de nuværende kræft-genom analyser er nødvendige.

Opdagelsen af ​​ikke-kodende RNA i det humane genom var en vigtigt konceptuelle gennembrud i den post-genome sekventering æra [6]. Forbedret forståelse af ikke-kodende RNA er nødvendig for fortsat fremgang i kræftforskning. miRNA udgør en klasse af små, ikke-kodende RNA-molekyler, 19-22 nukleotider i længden, der modulerer genekspression. Regulering opnås gennem ufuldkommen parring med mål-messenger-RNA’er (mRNA’er) protein-kodende gener og transkriptionel eller post-transkriptionel regulering af deres ekspression [7]. I øjeblikket er 2.042 humane modne miRNA er registreret på miRBase frigive 20,0 [https://microrna.sanger.ac.uk/]. En voksende mængde beviser tyder på, at miRNA også bidrage til initiering, udvikling og metastase af forskellige typer af kræft. Mange humane cancere viser afvigende ekspression af miRNA, der kan fungere enten som tumorsuppressorer eller onkogener [8]. Derfor identifikation af afvigende udtrykte miRNA er det første skridt mod at belyse miRNA-medierede onkogene veje i humane kræftformer.

Udviklingen af ​​high-throughput, dyb sekventering teknologi har hurtigt udækket roman information om miRNA. Deep sekventering analyse synes at være bedre end microarray- eller PCR-baserede metoder, der er begrænset til kendte miRNA og normalt ikke indeholder den fulde liste over kendte miRNA sekvenser. Deep sekventering analyse bliver den gyldne standard metode til omfattende miRNA analyse i kræft genomforskning. miRNA udtryk underskrifter fra BC opnået ved dyb sekventering teknologi har ført til fire seneste publikationer [9] – [12], og denne undersøgelse udgør den femte rapport. I alt ti små RNA biblioteker blev sekventeret (fem blærecarcinomer og fem matchede, histologisk normale prøver af urothelia), hvilket fører til 13.190.619 til 18.559.060 ren lille RNA læser i denne analyse. Vi har registreret 933 kendte miRNA og 17 nye miRNA kandidater i vores serie af prøver.

Nogle miRNA er placeret i umiddelbar nærhed af hinanden på det humane genom, og derfor kaldes klynge miRNA. I det humane genom, er der fundet 247 menneskelige miRNA skal grupperet på 64 steder på inter-miRNA afstande mindre end 5000 bp [13].

miR-15a /16

klynge, for eksempel, er kendt for at virke som en tumor suppressor ved at målrette flere onkogener, herunder

BCL2

,

MCL1

,

CCND1

Wnt3a

[14] – [16], mens

miR-17/92

klynge er anerkendt som et onkogen [17]. Vi har tidligere rapporteret, at

miR-1-1 /133a-2

og

miR-1-2 /133a-1

dannet klynger i forskellige kromosomale loci i det humane genom, 20q13.33 og 18q11.2 henholdsvis og disse klynger fungerer som tumorsuppressorer, rettet mod flere onkogener i humane kræftformer, herunder BC [18] – [24].

miR-143/145

klynge er placeret på 5q32 locus og blev også rapporteret som en tumor undertrykkende miRNA klynge i BC [25] – [28]. Vi valgte 60 nedreguleret miRNA i BC underskrift og undersøgte deres kromosomale loci. Interessant, blandt de 60 miRNA, fandt vi, at flere dannet klynger, såsom

MIR-1 /133a

,

miR-206 /133b

,

Lad-7c /miR-99a

,

miR-143/145

og

miR-195/497

.

i denne undersøgelse har vi en hypotese, at den

miR-195/497

klynge fungerede som en tumor suppressor gennem målretning af flere onkogene gener involveret i specifikke kræftrelaterede veje i BC. Baseret på denne hypotese, vi udførte gain-of-funktion studier i microRNA transfektanter og også forsøgt at identificere roman

miR-195/497

klynge-medieret molekylære mål og veje ved

i silico

analyse . Forståelse rolle miRNA vil give en effektiv og lovende strategi for miRNA-associerede evidensbaserede lægemidler til behandling af BC.

Resultater

sekventering og annotation af små RNA

Ti små RNA-biblioteker (blandt fem BCs og fem NBEs) blev sekventeret ved anvendelse af dybe sekventering teknologi. Patienternes egenskaber er vist i tabel 1. I første omgang læser 13.905.124 til 18.938.856 rå sekvens blev produceret for bibliotekerne. Efter filtrering og trimning af den læser for lav kvalitet og adaptere, fra 13.190.619 til 18.559.060 ren lille RNA læsninger blev opnået (tabel 2). Fordelingen af ​​nukleotid længder af ren lille RNA læser varierede fra 16 til 38 nukleotider i hvert bibliotek. Den mest rigelige længde var 22 nukleotider (Figur S1). Alle af den høje kvalitet ren læser større end 18 nucleotider blev kortlagt til det humane genom og disse genom-matchede læser blev inddelt i forskellige kategorier af små RNA’er efter deres biogenese og annotation (tabel 3). Både BCs og NBEs indeholdt flere og heterogene små RNA’er arter, der omfattede miRNA, nedbrydningsprodukter fragmenter af ikke-kodende RNA (tRNA, rRNA, snRNA, snoRNA, etc.), genomiske gentagelser, mRNA eller uklassificerede RNA’er. Den hyppigste RNA kategori fra hvert bibliotek var miRNA. De sekvens data fra dette studie blev deponeret i DDBJ Sequence Læs Arkiv (tiltrædelse nummer, DRA001043) Vejviser

Identifikation af nedreguleret miRNA baseret på miRNA udtryk underskrifter fra BC

Vi adskilte de høj kvalitet rene Læs sekvenser i hvert bibliotek i to kategorier, miRNA eller ikke-kodende RNA’er ved hjælp NCBI GenBank data, Rfam data og miRBase. I denne undersøgelse blev påvist i alt 933 kendte miRNA og 17 kandidat nye miRNA fra høj kvalitet rent Læs sekvenser (tabel S1 og S2). Ekspressionsniveauerne for de nye miRNA kandidater var lave og de funktionelle roller blev ikke vurderet nok (tabel S2). Af disse grunde har vi udelukket dem fra analysen. Men den funktionelle betydning af disse nye miRNA kandidater er vigtig, og de vil blive undersøgt i fremtiden. Her har vi fokuseret på de 933 kendte miRNA og etablerede miRNA udtryk underskrift f.Kr. af dyb sekventering. Differentielt udtrykte miRNA blev identificeret ved hjælp af Edger program med en generel lineær model. I alt 60 nedreguleret miRNA blev udvalgt til denne analyse (tabel 4).

Næste, vi kortlagt de nedreguleret miRNA i det humane genom og fundet flere miRNA, der var tæt på hinanden og blev betegnet grupperet miRNA, såsom

mIR-1 /133a, miR-206 /133b, lad-7c /miR-99a, miR-143/145

og

miR-195/497 Hotel (tabel 5). Fordi rolle

miR-195/497

klynge var ikke blevet rapporteret i BC, vi fokuseret på det til yderligere undersøgelser. Som vist i figur 1,

MIR-195

og

MIR-497

ligger inden for den samme kromosomale region (17p13.1), 209 bp fra hinanden.

miR-195

og

miR-497

er i en intron af

MIR497HG

gen på human kromosom 17q13.1, hvor de er adskilt af 209 bp.

Expression niveauer af

mIR-195

og

miR-497

i klinisk prøver

for at validere ekspressionsniveauerne af

miR- 195

og

miR-497

i kliniske prøver, vi udsat 29 BCs og 20 NBEs at dæmme-loop RT-PCR. Vi fandt, at ekspressionsniveauerne af

miR-195

og

miR-497

i BCs var betydeligt lavere end i NBEs (

miR-195

: 0,083 ± 0,078 og 1,367 ± 1,178, P 0,0001;

miR-497

: 0,056 ± 0,058 og 1,928 ± 2,425, P 0,0001) (Figur 2A, B). Interessant Spearman korrelationskoefficient opnået med rank test afslørede en signifikant positiv sammenhæng mellem ekspressionsniveauerne af

MIR-195

og

MIR-497

i de kliniske prøver (r = 0,984, P 0,0001) (Figur 2C).

A, B) udtrykket af

miR-195

og

miR-497

var signifikant lavere i 20 kliniske BC prøver end i 29 tilstødende noncancerous prøver.

RNU48

blev anvendt som den interne kontrol. *, P 0,0001. C) Signifikant positiv korrelation mellem miRNA ekspressionsmønstre af

miR-195

og

miR-497 Hotel (rank test Spearmans korrelationskoefficient r = 0,984, P. 0,0001)

Effekt af

mIR-195

miR-497

transfektioner på celleproliferation, invasion, og migration aktiviteter BC cellelinjer

for at undersøge de funktionelle roller disse miRNA, udførte vi gain-of-function undersøgelser under anvendelse miRNA transfektanter. Den XTT-analysen viste signifikant hæmning af celleproliferation i

miR-195

og

MIR-497

transfektanter (BOY og T24) i sammenligning med miR-kontroltransfektanter (procentdel af cellelevedygtighed for BOY : 61,7 ± 1,4, 59,1 ± 0,9, og 100,0 ± 2,2 henholdsvis P 0,0001, og, for T24: 66,0 ± 0,9, 67,7 ± 1,2, og 100,0 ± 2,8 henholdsvis P 0,0001) (figur 3A). Den Matrigel invasion analysen viste, at invaderende celle numre blev signifikant reduceret i begge

miR-195-

MIR-497

transficerede BOY og T24 cellelinjer i sammenligning med kontrollerne (procentdel af celle invasion for BOY: 8,7 ± 3,1, 13,4 ± 1,7, og 100 ± 12,3 henholdsvis hver P 0,0001, og for T24: 64,7 ± 16,2, 36,5 ± 7,5, og 100 ± 18,7 henholdsvis P = 0,009 for

miR-195

transfektanten vs. kontrol, P 0,0001 for

miR-497

transfektanten vs. kontrol) (figur 3B). Såret healing assay viste signifikant hæmning af celle migration i både

miR-195-

miR-497

transficerede dreng og T24 celler i sammenligning med kontrollerne (procentdel af sårlukning for BOY : 51,2 ± 15,5, 43,9 ± 8,3, og 100 ± 28,7 henholdsvis hver P 0,0001 og for T24: 70,1 ± 11,4, 72,3 ± 18,8 og 100 ± 12,6 henholdsvis hver P 0,0001) (figur 3C).

Gain-of-funktion blev udført ved hjælp af

miR-195

og

miR-497

transficerede BOY og T24 i sammenligning med de miR-kontroltransfektanter. A) Celleproliferation bestemt ved XTT-assay. B) celleinvasion aktivitet demonstreret ved Matrigel invasion assay. C) Cellemigration aktivitet bestemt ved sårheling assay. *, P 0,0001; **, P = 0,009.

Forventede target gener og kræft veje i

miR-195/497

klynge

For at udforske de biologiske funktioner

miR-195/497

klynge, vi udførte

i silico

analyser ved hjælp af to uafhængige algoritmer, Targetscan, og GeneCodis3 og offentlige microarray udtryk data er godkendt af GEO. Arbejdsgangen for

i silico

analyse er vist i figur 4. I første omgang Targetscan databasen viste, at 6.730 gener blev forudsagt mål i

miR-195/497

klynge, der delte den samme frø sekvens ‘GCUGCU «i deres 3’-utranslaterede regioner (3’UTR).

i alt 6730 gener blev identificeret ved den Targetscan algoritmen. Derefter blev 113 betydeligt beriget signalveje identificeret ved hjælp af Kegg og GeneCodis3 programmer. Blandt dem er de top 21 berigede veje vist i tabel S3. Ekspressionsniveauerne af 104 gener i toppen beriget pathway (veje i kræft) sluttelig evalueret. Blandt dem blev 27 formodede målgener opreguleret i BC kliniske prøver baseret på udtryk data fra GEO databasen (tal tiltrædelsesforhandlingerne; GSE11783 og GSE31684). (Tabel S4)

Baseret på vej klassificering Kegg, disse gener var impliceret i 113 veje, og “veje i kræft” var den mest markant beriget (tabel S3). I alt 104 gener var involveret i denne vej. Vi søgte de onkogener er omfattet af de

miR-195/497

klynge baseret på den hypotese, at formodede onkogener ville blive opreguleret i kliniske prøver på grund af nedregulering af tumor undertrykkende

miR-195/497

miRNA . Ved at bruge GEO database analyse blev 27 gener udvalgt som

miR-195/497

-regulated onkogene gener i BC (figur 5 og tabel S4). For at bekræfte denne analyse, valgte vi de to bedste opreguleret gener (

BIRC5

WNT7A

), og valideret, om disse miRNA blev reguleret af

miR-195/497

( nedenfor).

Heat map diagram viser ekspressionen af ​​27 kandidatgener involveret i “Pathways i kræft” i 90 f.Kr. prøver og seks tilstødende noncancerous blære prøver.

BIRC5

WNT7A

var direkte reguleret af

miR-195/497

klynge i BC celler

mRNA og protein ekspressionsniveauer af

BIRC5

og

WNT7A

blev nedreguleret i

miR-195-

miR-497-

transficeret BOY og T24 celler i sammenligning med kontroltransfektanter (figur 6A, B).

A)

BIRC5

WNT7A

mRNA-ekspression 72 timer efter transfektion med

miR-195

,

miR-497

, og miR-kontrol.

GUSB

udtryk blev brugt til normalisering. B)

BIRC5

WNT7A

protein udtryk 72 timer efter transfektion med

miR-195

,

miR-497

, og miR-kontrol.

GAPDH

blev anvendt som en loading kontrol. Forholdet mellem

BIRC5

eller

WNT7A

til

GAPDH

udtryk blev evalueret ved hjælp ImageJ software (ver 1,43;. https://rsbweb.nih.gov/ij/index .html). * P. 0,01

Vi næste udført luciferase reporter analyser for at fastslå, om

BIRC5

WNT7A

mRNA havde funktionelle målområder for

miR-195

miR-497

i BC. Vi brugte en vektor, der koder for de 3-‘UTRs af

BIRC5

WNT7A

mRNA, herunder formodede målområder for

miR-195

og

miR-497

(positionerne 198-204 og 197-203, henholdsvis; tabel S5). Vi fandt, at luminescens intensitet blev signifikant reduceret i overværelse af målområdet af

BRIC5

af

miR-195-

miR-497-

transfektanter (figur 7A ). Vi opnåede det samme resultat med en luciferase reporter analyse til

WNT7A

genet (Figur 7B). Disse data antydede, at

miR-195

og

miR-497

bundet direkte til specifikke steder i 3′-UTR af både

BRIC5

WNT7A

mRNA.

Luminescens intensitet blev målt i

miR-195-

miR-497-

transfektanter i sammenligning med miR-kontrol transfektant. A)

miR-195/497

klynge bindende steder i 3′-UTR af

BIRC5

mRNA. Luciferase reporter assay vektor, der anvendes kodningen 3′-UTR-regionen i

BIRC5

herunder formodede

miR-195/497

målområder.

Renilla

luciferase værdier blev normaliseret til ildflueluciferase værdier. * P 0,01. B)

miR-195/497

klynge bindende steder i 3′-UTR af

WNT7A

mRNA. Luciferase reporter assay vektor er kodningen 3′-UTR-regionen i

WNT7A

herunder formodede

miR-195/497

målområdet. * P. 0,01

Discussion

Det menes, at miRNA regulerer ekspressionen af ​​ca. 30% af alle gener i det humane genom [29]. I normale celler, er samspillet mellem miRNA og target messenger RNA (mRNA’er) stramt reguleret, hvorimod denne forordning ofte mangler i kræftceller. En voksende mængde beviser tyder på, at miRNA afvigende udtrykkes i mange humane kræftformer, og at de spiller en væsentlig rolle i indledningen, udvikling, og metastase af disse kræftformer [30]. Derfor identifikation af afvigende udtrykte miRNA er et vigtigt skridt i analysen af ​​menneskelige onkogenese. Den seneste analysemetode i genomik, dyb sekventering teknologi, har potentiale til at identificere hidtil ukendte vævsspecifikke miRNA herunder dem i human cancer væv [31]. Deep sekventering teknologi er i øjeblikket den gyldne standard for omfattende analyse af humane miRNA. I denne undersøgelse, dyb sekventering identificeret et stort sæt af miRNA, der er differentielt udtrykte mellem BC og normal epitel.

Bestemmelse udtrykket underskrifter miRNA kan hurtigt og pålideligt afsløre miRNA, der er afvigende udtrykt i kræft. Derfor vi tidligere analyseret miRNA udtryk signaturer gennem brug af PCR-baserede arrays og søgt efter tumor undertrykkende miRNA i BC. På den måde, vi identificeret succes tumor undertrykkende miRNA som

MIR-1

,

miR-133a

,

miR-145

og

miR-218

[18] – [20], [25], [32] – [36]. Vi sammenlignede vores tidligere resultater med de dybe sekventering signaturer er beskrevet heri, tillader os at inkludere de oprindelige datasæt med den nye signatur. Til dato har der været fire undersøgelser af BC miRNA ekspressions- signaturer af dybe sekventering analyser [9] – [12]. I publicerede data,

MIR-1

,

miR-145

,

miR-143

,

miR-125b

, og

miR- 100

er blevet opført som de hyppigst nedreguleret miRNA [9] – [12], data bekræftet af vor egen signatur. Dette faktum understøtter effektiviteten af ​​den dybe sekventering signatur, og det antyder, at der er nye tumor suppressive miRNA i disse nye data. Fordelen ved denne strategi er at være i stand til at identificere nye miRNA kandidater i BC, der ikke tidligere er blevet rapporteret. Vi fandt 17 sådanne sekvenser, der kan udgøre nye miRNA kandidater. Imidlertid blev de detekteres ved meget lave niveauer af ekspression i sammenligning med kendte miRNA i både kræft og godartede væv. Den funktionelle betydning af disse nye miRNA kandidater er ukendt, og det vil være vigtigt i fremtiden at undersøge forholdet mellem disse kandidat miRNA og BC onkogenese. I den aktuelle undersøgelse, vi ikke bruge væv mikro-dissektion, derfor den præcise andel af epitelceller i normale prøver og den præcise andel af tumorceller i tumor prøver er ukendte. Imidlertid blev den tynde-flap af normal blære slimhinde bestod hovedsagelig af NBE celler, mens tumor prøver blev udgjort primært af kræft epitelceller. Derfor mener vi, at mindre forurening af andre celler ikke var signifikant og påvirkede ikke ekspressionsniveauerne af microRNA.

MikroRNA’er kan kategoriseres i familier baseret på deres sekvenser eller i klynger baseret på deres genomiske loci. Clustered miRNA er transskriberet sideordnet og har lignende funktioner, der regulerer de samme mål [37]. For eksempel udtryk for

MIR-1 /133a

klynge ofte reduceret flere typer af kræft, herunder BC. Denne klynge fungerer som en tumor suppressor målrettet de samme onkogene gener såsom

TAGLN2

og

PNP

[18] – [23]. Lignende eksempler er blevet rapporteret med andre klynger miRNA såsom

miR-15a /16

miR-143/145

[14] – [16], [25] – [28]. Således viste disse undersøgelser, at klynger miRNA kan arbejde i kombination for at opnå deres funktion i hele de samme biologiske processer og de samme målrettede gener. Med hensyn til

MIR-195/497

klynge, er det blevet vist, at

MIR-195

blev nedreguleret i flere kræftformer [38] – [40] og inhiberede glucoseoptagelse, proliferation, og cellecyklus ved at målrette

GLUT3

CDK4

i BC [41], [42]. Det er også blevet påvist, at m

iR-497

blev nedreguleret og fungerede som en tumorsuppressor ved at målrette

BCL2

i flere kræftformer [43], [44].

miR-195/497

klynge også fungerede som en tumor suppressor ved at målrette

RAF1 /CCND1

i brystkræft [45]. For at validere disse tidligere rapporter, vi evaluerede ekspressionsniveauerne af

MIR-195

og

MIR-497

i BC kliniske prøver, og vi bekræftede, at

miR-195

og

miR-497

var signifikant nedreguleret i tumorvæv. Dernæst undersøgte vi den funktionelle betydning af

miR-195

og

miR-497

i BC ved hjælp af to cellelinjer, BOY og T24. Restaurering af moden

miR-195

eller

miR-497

i kræftceller viste betydelig hæmning af kræft celleproliferation, invasion og migration. Vores nuværende data og tidligere undersøgelser tyder på, at

miR-195/497

klynge gør faktisk fungere som en tumor suppressor i BC.

miRNA er unikke i deres evne til at regulere mange protein kodning gener. Bioinformatiske forudsigelser viser, at miRNA regulere mere end 30% af protein-kodende gener [29]. I kræftceller, normale miRNA – er mRNA netværk forstyrret af afvigende udtrykte miRNA. Vi har taget det standpunkt, at identifikationen af ​​nye kræft veje og ansvarlige målgener reguleret af tumor undertrykkende

miR-195/497

klynge er et vigtigt første skridt i forståelsen BC onkogenese. Baseret på dette synspunkt, vi identificeret molekylære veje og målrette onkogener, der blev reguleret af

miR-195/497

klynge hjælp genom-dækkende genekspression data og

i silico

analyse.

miR-195/497

klynge hører til

miR-15/16/195/424/497

familie, der deler den samme 3′-UTR bindende frø sekvens (AGCAGCA). Den Targetscan databasen identificerede 6.730 gener, der var kandidat mål for

miR-195/497

klynge. Kegg pathway analyse viste, at disse gener var impliceret i 113 veje, herunder “veje i kræft”, “MAPK signalering”, “Endocytose”, “Insulin signalering” og “Wnt signalering”.

Blandt disse veje, vi fokuseret på “Veje i Cancer” på grund af deres direkte relevans. Ifølge vores hypotese, target gener af

miR-195/497

skal opreguleret i kræftceller. Når vi undersøgte ekspressionsniveauerne af 104 gener i “Pathways i kræft” gruppe blev 27 gener opreguleret i BC kliniske prøver, hvilket tyder på, at disse gener var kandidat

MIR-195/497

mål og fungerede som onkogener i BC. For at bekræfte pålideligheden af ​​vores

i silico

analyse af potentielle target gener, vi kontrolleret, om

BIRC5

WNT7A

gener blev faktisk reguleret af

miR- 195/497

klynge i BC. Vores data viste, at

BIRC5

WNT7A

var direkte reguleret af

miR-195/497

klynge i BC.

BIRC5

er medlem af inhibitoren af ​​apoptose (IAP) familie fortrinsvis udtrykkes af mange cancere herunder BC [46]. Det kan måles i urin ved mRNA og protein niveauer, og urin

BIRC5

blev rapporteret som et diagnostisk biomarkør for BC [47]. Nylige undersøgelser fra andre grupper har vist, at flere microRNA som

miR-542-3p

,

miR-218

,

miR-708

miR-203

direkte hæmmet

BIRC5

udtryk i forskellige typer af kræft [48]. Vores undersøgelse er den første til at foreslå, at

BIRC5

kunne reguleres af

miR-195/497

klynge i BC celler. Derfor er vores strategi at identificere nye tumor-undertrykkende, miRNA-regulerede molekylære mål /veje i BC er en effektiv metode til miRNA-kræftforskning.

Konklusioner

Sammenfattende konstrueret vi miRNA udtryk underskrifter fra kliniske BC prøver vha dybe sekventering som en gold standard metode. I alt 60 miRNA blev væsentligt reduceret i BC prøver. Vi identificerede adskillige nedreguleret miRNA, der var placeret inden for samme genomiske region udgør en miRNA klynge, herunder

MIR-1 /133a

,

miR-143/145

,

miR-99a /lad-7c

,

miR-195/497 og miR-144 /451a

. Nedregulering af

miR-195/497

klynge var en hyppig begivenhed i BC kliniske prøver. Restaurering af disse miRNA betydeligt hæmmet kræft proliferation, migration og invasion, tyder på, at

miR-195/497

fungerer som tumorsuppressorer i BC. Vores analyse af

miR-195/497

klynge foreslog, at det regulerede formodede kræft veje og onkogene gener. Disse resultater vil bidrage til analysen af ​​BC onkogenese. Identifikation af tumor-undertrykkende

miR-195/497

klynge i human BC kunne give nye oplysninger om potentielle terapeutiske mål i behandlingen af ​​BC.

Materialer og metoder

Kliniske prøver og cellekultur

Vævsprøver for miRNA screening ved hjælp af dyb sekventering blev opnået fra fem BC patienter og fem NBEs. BC patienter havde gennemgået cystektomi eller transuretral resektion af blæretumorer (TUR-BT) på Kagoshima Universitetshospital mellem 2003 og 2010. Fem NBEs stammede fra patienter med ikke-BC sygdomme. Ingen forurening af kræftceller blev opdaget af patologer. En anden serie af 29 BCs og 20 NBEs blev opnået fra Kagoshima Universitetshospital mellem 2003 og 2010. Denne gruppe blev udsat for real-time RT-PCR for at evaluere miRNA ekspressionsniveauerne. Prøverne blev iscenesat i overensstemmelse med tumor-node-metastaser klassifikationssystem for amerikanske Blandede kræft /Union Internationale Contre le Cancer (UICC) og histologisk gradueret [49]. Skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle patienter, og vores undersøgelse blev godkendt af bioetik udvalg Kagoshima Universitet. Patienternes baggrund og klinisk-patologiske karakteristika er sammenfattet i tabel 1 og 6.

Vi brugte to humane BC cellelinier: Dreng, som blev etableret i vores laboratorium fra en asiatisk mandlig patient, 66-år , der blev diagnosticeret med stadium III BC med lunge metastase; og, T24, som var invasive og opnået fra American Type Culture Collection. Disse cellelinier blev opretholdt i minimum essentielt medium (MEM) tilsat 10% føtalt bovint serum i en fugtet atmosfære af 5% CO

2 og 95% luft ved 37 ° C.

Tissue indsamling og RNA ekstraktion

Vævsprøver blev nedsænket i RNAlater (QIAGEN, Valencia, CA, USA) og opbevaret ved -20 ° C indtil RNA-ekstraktion blev udført. Totalt RNA, herunder miRNA, blev ekstraheret fra frosne friske væv under anvendelse af Mirvana ™ miRNA isolation kit (Ambion, Austin, TX, USA) ved at følge fabrikantens protokol. Integriteten af ​​RNA blev kontrolleret med RNA 6000 Nano Assay Kit og et 2100 Bioanalyzer ™ (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA).

Lille RNA bibliotek forberedelse og profilering af dyb sekventering

Totale RNA’er fra fem BCs og fem NBEs blev underkastet dyb sekventering. Den eksperimentelle proces omfattede følgende trin: lille RNA isolering, cDNA bibliotek forberedelse, og sekventering. Totalt RNA af hver prøve blev størrelsesfraktioneret fraktioneret på en 15% PAGE-gel, og en 18-30 nukleotid fraktion blev opsamlet. 5′-RNA-adapter blev ligeret til RNA med T4-RNA-ligase. Ligeret RNA blev størrelsesfraktioneret fraktioneret, og fraktionen 36-50 nukleotid blev udskåret. 3′-RNA-adapter blev efterfølgende ligeret til udfældet RNA ved anvendelse af T4 RNA-ligase. Ligeret RNA blev størrelsesfraktioneret fraktioneret, og 62-75 nucleotid fraktionen (små RNA + adaptere) blev udskåret. Tabel S1. Tabel S2. Tabel S3. Tabel S4.