PLoS ONE: Spotlight på differentielt udtrykte gener i Urinary Blære Cancer

Abstrakt

Introduktion

Vi har tidligere identificerede fælles differentielt udtrykte (DE) gener i blærekræft (BC). I den foreliggende undersøgelse analyserede vi i dybden, ekspressionen af ​​flere grupper af disse DE gener.

Materialer og metoder

Prøver fra 30 humane BCs og deres tilgrænsende normale væv blev analyseret ved hele genomet cDNA microarrays, QRT-PCR og Western blotting. Vores opmærksomhed blev fokuseret på cellecykluskontrol og DNA beskadigelse reparation gener, gener relateret til apoptose, signaltransduktion, angiogenese, såvel som cellulær proliferation, invasion og metastase. Fire offentligt tilgængelige GEO Datasæt blev yderligere analyseret, og udtrykket data for de gener af interesse (GOI’er) blev sammenlignet med dem af den foreliggende undersøgelse. Forholdet mellem den indiske regering blev også undersøgt. GO og Kegg molekylær pathway analyse blev udført for at identificere mulige berigelse af gener med specifikke biologiske temaer.

Resultater

Unsupervised klynge analyse af DNA microarray data viste en klar sondring i BC vs kontrolprøver og lav vs høj kvalitet tumorer. Gener med mindst 2 gange differentiel ekspression i BC vs. kontroller, såvel som i ikke-muskel invasiv vs. muskel invasive tumorer og i lave vs. high-grade tumorer, blev identificeret og rangordnes. Specifik opmærksomhed blev udbetalt til de forandringer i osteopontin (OPN, SPP1) udtryk, på grund af sine mange biologiske funktioner. Tilsvarende gener udviser samme eller lav ekspression i BC vs. kontrollerne blev bedømt. Væsentlige parvise korrelationer i genekspression blev bedømt. GO analyse afslørede multi-facet karakter GOI’er, da de deltager i en række forskellige mekanismer, herunder celleproliferation, celledød, metabolisme, celleform, og cytoskelet omorganisering. Kegg analyse viste, at den mest betydningsfulde vej var, at blærekræft (p = 1,5 × 10

-31).

Konklusioner

Den nuværende arbejde tilføjer til den aktuelle viden om molekylær signatur identifikation af BC. Sådanne værker bør udvikles med henblik på at få mere indsigt i molekylære sygdomsmekanismer

Henvisning:. Zaravinos A, Lambrou GI, Volanis D, Delakas D, Spandidos DA (2011) Spotlight på differentielt udtrykte gener i Urinary blærekræft. PLoS ONE 6 (4): e18255. doi: 10,1371 /journal.pone.0018255

Redaktør: I. Kong Jordan, Georgia Institute of Technology, USA

Modtaget: 13. oktober 2010; Accepteret: 1 mar 2011; Udgivet: April 5, 2011

Copyright: © 2011 Zaravinos et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Urinary blærekræft (BC) er den mest almindelige. malignitet i urinvejene, ansvarlig for væsentlig dødelighed og sygelighed i hele verden. I Europa er anslået 105.000 nye tilfælde af blærekræft diagnosticeret årligt, mens ca. 30.000 patienter dør af blærekræft hvert år [1]. Dens forekomst direkte stiger med alderen, bliver sjældent før en alder af 50, og det er tre til fire gange mere almindelig hos mænd end kvinder. Næsten alle blære kræftformer er karcinomer, som følge af overgangsordningen epitel. Opførslen af ​​overgangsordning celle karcinom (TCC) er meget varieret og defineret af to separate, men beslægtede processer: tumor tilbagefald og progression. Ved præsentationen, er 75-85% af tumorer begrænset til slimhinden, eller invadere

lamina propria slimhinder

. Resten stede med invasion af muskulære lag af blærevæggen eller udvide til perivesical væv, tilstødende organer og bækken væg. Mere end 60% af de overfladiske tumorer vil gentage sig mindst en gang og fremskridt til mindre differentierede eller invasive neoplasmer med dårligere prognose i en betydelig procentdel af patienterne [2]. Den mest nyttige prognostiske parametre er tumor kvalitet, scene, størrelse, før gentagelse sats og den synkrone tilstedeværelse af CIS [3]. Ikke desto mindre kan forventes bedre forståelse af den naturlige historie af TCC på belysning af de molekylære mekanismer i TCC.

Vi har tidligere identificerede fælles differentielt udtrykte (DE) gener i urin BC [4]. I den foreliggende undersøgelse, blev vores interesse fokuseret på analyse af forskellige grupper af De gener, såsom gener involveret i kontrollen af ​​cellecyklussen, DNA beskadigelse reparation, apoptose, signaltransduktion, transkriptionsfaktorer, angiogenese, cellulær proliferation, invasion og metastase. Vi udforskede udtrykket profil i BC vs sundt væv, i ikke-muskel-invasiv (stadie T1) vs. muskel-invasive tumorer (stadie T2-T4), og i lave vs høj kvalitet tumorer ved microarray analyse. Vores resultater blev yderligere bekræftet af immunhistokemi, qPCR og Western blotting. Desuden har vi udført GEO beregningsmæssige analyse i microarray data ekstraheret fra andre offentligt tilgængelige datasæt, og sammenlignede dem med vores resultater.

Vores resultater fokuseret på gener, som spiller en væsentlig rolle i de mest vigtige cellulære processer og demonstrerede en stor forskel i deres ekspressionsmønstre mellem BC og kontrolprøver. Gener med mindst 2 gange differentiel ekspression i BC vs. kontroller, såvel som i ikke-muskel-invasiv vs. muskel-invasive tumorer, og i lave vs. high-grade tumorer, blev identificeret og rangordnes.

Materialer og Metoder

Undersøgelse design og klinisk-patologiske data

Parret tumor og normale vævsprøver fra en fortløbende serie af 30 patienter med nyligt diagnosticeret BCs gennemgår transuretral blære tumor resektion ved Institut of Urology, ” Asklipieio “General Hospital, Athen, blev erhvervet efter den mængde væv er nødvendig for rutinemæssig patologi undersøgelse var blevet fjernet (tabel 1). Alle tumor prøver blev klassificeret og sorteres efter samme patolog. Cancerpatienter blev kategoriseret i overensstemmelse hermed i en muskel-invasiv (T2, T3 eller T4) og ikke-invasive tumorer (Ta, T1, og CIS). Til sammenligning med tidligere rapporter, blev 1973 World Health Organization (WHO) klassificering systemet [lav kvalitet (kvaliteter 1-2) og høj kvalitet (grad 3)] anvendes i denne undersøgelse, som stadig er den mest almindeligt anvendte system trods bliver afløst af 2004 WHO /International Society of Urologic Patologi (ISUP) klassificeringer [5]. Skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle patienter inkluderet i denne undersøgelse. Undersøgelsen protokol Den blev godkendt af den etiske komité i Kreta Universitet. Kriterier anvendte elektivt resektion primære BCs og tilgængeligheden af ​​DNA fra normalt og tumorvæv for biomolekylær analyser. Eksklusionskriterier var en historie af tidligere neoplasmer og kemoterapi eller strålebehandling før operationen

Vævsprøver blev opnået ved kirurgi fra tumoren, og følgende tre groft normale udvalgte steder (kold kop biopsier):. Posterior væg, trigone, og området støder op til tumoren. Dele af resektion normale prøver blev sendt til histopatologisk analyse. Tumor og normalt væv blev frosset øjeblikkeligt i flydende nitrogen, transporteres og opbevares ved -80 ° C indtil DNA-ekstraktion.

Patienter med ikke-muskel-invasiv BCs blev fulgt op med periodiske cystoskopisk undersøgelser og intravesikal behandling som angivet. Patienter med invasive BCs blev tilbudt radikal cystektomi med eller uden systemisk kemoterapi. Efter en gennemsnitlig opfølgning på 24 ± 3 måneder 8 (26,6%) patienter havde tilbagevendende tumorer. I Ta /T1 tumorer frekvensen af ​​tilbagefald var 29,4% (5/17) i forhold til 23% (3/13) af T2-T3 tumorer. Hos patienter med non-muskel-invasiv BCs, progressionen sats var 11,1% og 22,2% for klasse 2 og klasse 3 tumorer hhv. Alle gentagelser blev bevist ved biopsi.

Immunhistokemi

Sektioner, 3 mm tyk, af formalin-fikseret, blev paraffinindstøbt væv skæres og placeres på objektglas belagt med 3-aminopropyltriethoxysilone. Objektglas blev tørret ved 56 ° C i 1 time, før immunhistokemisk farvning. Vævssnit blev afparaffiniseret i xylen før rehydrering i graduerede alkoholer, og endogen peroxidaseaktivitet blev blokeret ved behandling med 3% H

2O

2 ved stuetemperatur i 15 min. Antigen demaskering blev udført ved 30 minutters inkubation ved 80 ° C i 10 mM trinatriumcitrat (pH 6,1). Immunfarvning og åbenbaring blev udført på en Dako automatisere. Objektglas blev inkuberet ved stuetemperatur med primære polyklonale gede-antistoffer mod anti-ErbB2 (1:800, Dako), cyclin D1 (1:100; SP4, Epitomics), monoklonalt antistof mod anti-p53 (1:250; E26; Epitomics) og monoklonalt antistof mod anti-Ki-67 (1:100, SP6, Epitomics). Epitoper af det primære antistof blev lokaliseret ved immunoperoxidaseteknik hjælp det sekundære antistof avidin-biotin kompleks og peroxidasesubstrat kit (kit 5001, Dako) i overensstemmelse med producentens protokol. Snittene blev derefter behandlet med Chromagen 30-30 diaminobenziden tetrahydrochlorid at identificere sites for immunfældning ved lysmikroskopi. Endelig blev snit vasket, modfarvet med hematoxylin, og monteret under dækglas. Ingen specifik farvning blev observeret, når det primære antistof blev udeladt fra protokollen (negativ kontrol). Specificitet af immunfarvning blev yderligere kontrolleret ved samtidig farvning af prøver brystkræft med kendt ErbB2, cyclin D1, p53 og Ki67 ekspressionsmønstre. En erfaren patolog scorede farvningen intensitet på fire niveauer (negative, svage, moderate og stærke), overvejer både farve intensitet og antal farvede celler. Kort fortalt er andelen score repræsenterede anslåede procentdel af positive-farvede tumorceller (0 = 0%, 1 = 1%, 2 = 1 til 10%; 3 = 10 til 33%; 4 = 33 til 66%; 5≥ 67%), og intensiteten score repræsenterede dybet af tumor celle farvning (1 = svagt positive, 2 = moderat positive,. 3 = stærkt positiv)

RNA oprensning og cDNA forberedelse

vi isoleret totalt RNA fra rå tumor biopsiprøver med en mekanisk homogenisator og TRIzol® reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA), som tidligere beskrevet [6], [7]. Vi bruges 2 pg totalt RNA som udgangsmateriale til cDNA præparat. Vi udførte den første og anden cDNA-syntese ved hjælp af StrataScript First-Strand Synthesis System, som tidligere beskrevet [8].

microarray analyse

oligoer microarray chips (~57K gener) var fås fra GE HealthCare (IL) og AppliedMicroarrays (MA) (CodeLink 57k Menneskelig samlede genom). Hybridisering blev udført med CodeLink RNA-amplifikation og mærkning kit, benytter det Cy5 fluorescerende farvestof. Objektglas blev scannet med en microarray scanner (ScanArray 4000XL). Billeder blev genereret med erhvervelse ScanArray microarray software (GSI Lumonics, USA). cRNA’er fra tre forsøgsopstillinger blev anvendt i enkelte eksperimenter med indvendige pigge som kontroller. De eksperimentelle opstillinger bestod af 10 urinary BC prøver af forskellige histologier (T1 /2-grade 3, T1-grade 1/2, T3-grad 3) og 5 kontrolprøver. De scannede billeder blev yderligere behandlet med CodeLink Expression Analysis Software v5.0 fra Amersham Biosciences. Den eksperimentelle opstilling blev analyseret på grundlag af reference design som tidligere beskrevet [9], [10], [11]. Alle tumorprøver blev sammenlignet mod middelværdien af ​​kontrolprøver. Baggrund korrektion blev udført ved at subtrahere medianen globale baggrund fra medianen lokal baggrund fra signalintensiteten. En tærskel på 2 blev sat som cut-off, hvilket betyder, at stedet intensitet i mindst én kanal skal være dobbelt så meget som for baggrunden. Microarray data blev normaliseret ved at dividere spot intensiteter af den globale median. Normaliserede data blev udvundet, præ-behandlet og sorteret med Microsoft Excel®. Array data er tilgængelige på Gene Expression Omnibus (National Center for Biotechnology Information) med tiltrædelse numre GSM678186 gennem GSM678385 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE27448). Desuden blev hvert gen testet for dets betydning i differentiel ekspression under anvendelse af en z-test. Gener blev anset for at være væsentligt forskelligt udtryk, hvis de opnåede en p-værdi 0,05. Den False Discovery Rate blev beregnet som tidligere beskrevet [12], [13], [14]. Gener blev yderligere klassificeret ved hjælp af to-vejs (Genes-mod prøver) gennemsnitlig sammenkædning hierarkisk klyngedannelse med euklidisk afstand ved hjælp af Genesis 1.7.2 software (Technische Universitaet-Graz, Østrig) [15].

Real-tid PCR validering

transkriberede produkter blev underkastet real-time PCR assay med SYBR Green i i en Mx3000P programmerbar termisk controller apparat (Stratagene, La Jolla, CA). Primerparrene blev designet til at spænde over i det mindste en intron for at undgå amplifikation af den kontaminerende genomisk DNA sammen med cDNA. Deres rækkefølge og de tilsvarende PCR-produkt størrelser er anført i tabel S1. GAPDH og ACTB generne blev anvendt som intern kontrol [16].

En mikroliter af cDNA fra normale eller TCC prøver henholdsvis blev amplificeret i en PCR reaktion med 2x Brilliant SYBR® Green QPCR Master Mix (indeholdende 2,5 mM MgCl

2), 300 nM af hver primer og 30 pM Rox passiv henvisning farvestof i et endeligt volumen på 20 pi. Efter indledende denaturering ved 95 ° C i 10 minutter blev prøver underkastet 40 amplifikationscykler omfatter denaturering ved 95 ° C i 30 sek, annealing ved 60 ° C i 30 sekunder, og forlængelse ved 72 ° C i 30 sek. Amplificeringsprodukter og forlængelse trin blev efterfulgt af en smelte kurve analyse, hvor temperaturen blev forøget fra 55 ° C til 95 ° C ved en lineær hastighed på 0,2 ° C /sekund. Dataindsamlingen foregik under både udglødning og udvidelse, med to målinger på hvert trin og på alle tidspunkter under smelte kurve analyse. For at bekræfte resultaterne af smelten kurve analyse blev qPCR produkter analyseret ved elektroforese på 2% agarosegel, farvet med ethidiumbromid og fotograferet på en UV-lys transilluminator (fig S1). I hver qPCR reaktion blev to negative kontroller inkluderet, med ingen cDNA skabelon og én uden revers transkription behandling. Alle prøver blev behandlet i duplikat. Gentransskription niveauer blev beregnet under anvendelse af ΔΔCt metoden, som tidligere beskrevet [17], [18].

Total proteinekstraktion og Western blot-analyse

Efter tilsætning af 250 pi iskold GST- fisk lysepuffer (10% glycerol, 50 mM Tris (pH 7,4), 100 mM NaCl, 1% (vol /vol) Nonidet P-40, 2 mM MgC

2, og en proteasehæmmer cocktail (Roche Diagnostics GmbH, Tyskland) blev de homogeniserede vævsprøver centrifugeret ved 14.000 xg i 15 minutter ved 4 ° C, for at fjerne uopløseligt materiale, og supernatanten blev opsamlet og opbevaret ved -80 ° C. Proteinkoncentration af hver prøve blev bestemt ved fremgangsmåden ifølge Bradford anvendelse af et protein assay farvereagens (Bio-Rad, Hercules, CA). prøver blev opløst i LDS prøvebuffer (Invitrogen) og opvarmet ved 70 ° C i 7 min. Lige store mængder af prøverne (20-30 ug) blev elektroforesebehandlet i NuPAGE 4-12% Bis-Tris-gel (Invitrogen) og overført til en 0.45- um nitrocellulosemembran (Bio-Rad Laboratories, Inc.). membranen blev nedsænket i 5% fedtfri mælk eller BSA, 0,1% Tween 20 og opløst i Tris-pufret saltvand for at blokere uspecifik binding. Membranerne blev inkuberet natten over ved 4 ° C med de følgende primære antistoffer: muse polyklonalt anti-HRAS (fortyndet 1:1,000; Abnova, CA), mus monoklonalt anti-CDKN2A (fortyndet 1:500; Abnova, CA), mus monoklonale anti p53 (fortyndet 1:500; klon DO-7, BD Transduction Laboratories), monoklonalt muse-anti-VEGFA (fortyndet 1:500; Santa Cruz Biotechnology, CA), kanin polyklonale anti-TGFp1 (fortyndet 1:1000, Novus Biologicals, CO) og muse monoklonalt anti-OPN (fortyndet 1:500; Santa Cruz Biotechnology, CA). Membranerne blev derefter vasket og inkuberet i 90 min. ved stuetemperatur med et sekundært antistof, der omfattede peberrodsperoxidase-konjugeret gede-anti-kanin eller anti-mus IgG (fortyndet 1:1,500; Santa Cruz Biotechnology). Western blots blev normaliseret under anvendelse af et monoklonalt anti-

β-actin-antistof (fortyndet 1:5,000; Sigma Chemicals, St. Louis, MO). De specifikke signaler blev visualiseret ved ECL reagens (GE Healthcare Bio-Sciences, Piscataway, NJ) efter redegørelsen til ECL film. Den relative densitet af polypeptidbånd detekteret på ECL film blev bestemt under anvendelse stedet DENSO værktøj af AlphaEaseFC software.

GEO Dataset beregningsanalyse

Computational analyse blev udført for yderligere at undersøge forskellene i den OPN, VEGFA, TGFp1, FGF2, EGFR, EGF, P14

ARF, p16

INK4a, p53, KRAS, HRAS, nationale tilsynsmyndigheder, araf, BRAF, RAF1, RKIP, MMP2, MMP9, TIMP1, TIMP2 og CyclinD1 transkriptniveauer mellem forskellige urinblære kræftformer, dens metastatisk modstykke og den relative normale væv. Fire offentligt tilgængelige genekspression Omnibus (GEO) datasæt blev analyseret af denne grund, med tal GEO-serien tiltrædelse GSE89, GSE7476, GSE3167 og GSE12630 [19], [20], [21]. Expression mønstre af generne blev udvundet fra de normaliserede datasæt og blev udtrykt som gennemsnitlige niveauer af loggen

2 intensitet (tabel S2).

Gene ontologi (GO) og Kyoto Encyclopedia of Gener og genomer (Kegg ) analyse

Gene ontologi (GO) og Kyoto Encyclopedia of gener og genomer (Kegg) molekylær pathway-analyse blev udført for at identificere mulige berigelse af gener med specifikke biologiske temaer (https://www.genome.jp/kegg /pathway.html).

Statistisk analyse

mikroarraydata blev normaliseret af den globale medianen af ​​stedet intensiteter. Hvert gen blev testet for dets betydning i differentiel ekspression under anvendelse af en z-test. GOI ekspressionsniveauerne blev først vurderet af en stikprøve Kolmogorov-Smirnov Goodness-of-Fit test, for at afgøre, om de fulgte en normalfordeling mønster. Den ikke-parametrisk Spearman rank korrelation blev anvendt til at undersøge parvise korrelationer mellem mRNA niveauer og deres forbindelse med kontinuerte variable (alder, rygning, tumor fase /stilling). Mann-Whitney U test blev anvendt til at undersøge ekspressionen status af generne med de forskellige klinisk-patologiske parametre efter stratificering. Kaplan-Meier-metoden blev anvendt til at estimere den samlede overlevelse som en funktion af tid. Overlevelse forskelle blev vurderet ved Log-rank (Mantel Cox) og Gehan-Breslow-Wilcoxon test. Numeriske værdier udtrykkes som middelværdi ± standardafvigelse (SD), og medianer. Data ekstraheret fra GEO databaser blev sammenlignet statistisk ved Mann-Whitney U test. Statistisk signifikans blev fastsat til 95% niveau (p 0,05). Alle statistiske analyser blev udført med SPSS 11.5 (SPSS, Chicago, IL).

Resultater

Immunohistokemiske resultater

Tumor prøver blev farvet med antistoffer for ErbB2, cyklin D1, p53 og Ki-67 (figur 1). Hvis tilstede, anti-ErbB2-farvning i tumorprøver er en membran farvning, diffus i urothelium. Alle BC prøver (100%) viste moderat /strong (++, +++) immunfarvning, hvorimod ingen BC prøve viste ingen /svag immunfarvning (0, +) for ErbB2. Tærskelværdier for høje indekser mærkning blev fastsat for Ki-67 ved ≥10% positive tumor kerner og for p53 på 10 og 20%. T1-grade 1/2 tumorer udviste svag farvning for anti-Ki-67 (7,5% og 40%, henholdsvis), hvorimod T1 /2-grade 3 tumorer udviste den stærkeste immunofarvning (+++, 70%). Tilsvarende udviste T1-grade 1/2 tumorer svag farvning for anti-p53 (10% og 35%, henholdsvis), hvorimod T1 /2-grade 3 tumorer udviste den stærkeste immunfarvning (53-70%). Med hensyn cyclin D1, viste alle tumorer intens farvning for anti-cyclin D1, mens dem af en højere kvalitet udstillet forholdsvis lavere immunfarvning. For T1-grade 1/2 tumorer, farvning for anti-cyclin D1 var 80%; henviser til T1 /2-grade 3 tumorer immunofarvning var 50%.

Tumorer blev farvet med anti-cerbB2, anti-Ki67, anti-p53 og anti-cyclin D1. H . E, Repræsentative hæmatoxylin-eosin slides

Microarray udtryk og klyngedannelse på en 22-gen sat

Vi har tidligere identificeret 831 gener, der blev udtrykkes forskelligt i alle 10 BC prøver, samtidigt. Af disse blev 33 gener opreguleres og 85 gener blev nedreguleret i alle blærekræft prøver sammenlignet med de 5 normale væv, samtidigt (data ikke vist). I den foreliggende undersøgelse, vi udført to-vejs gennemsnit-kobling hierarkisk klyngedannelse med euklidisk afstand til en 22-gen sæt, der omfattede følgende gener: VEGFA, araf, BRAF, OPN (SPP1), MMP2, KRAS, nationale tilsynsmyndigheder, TGFp1, Akt1 , HRAS, TIMP1, EGF, RKIP (PBP), FGF2, EGFR, RAF1, CDKN2D, TP53, CDKN2A (P14

ARF /p16

INK4a), MMP9 og MKI67, i 10 f.Kr. prøver vs. 5 kontroller. En detaljeret billede af prøven klynge dendrogram vises i figur 2A. Vi analyserede log

2 forvandlet fold udtryk mønster af den indiske regering og partitioneret tumorer i 3 hovedgrupper baseret på den differentielle ekspression af disse 22 gener: Det første princip gren indeholdt T1-klasse 3, T2-grade 3, T1 grad 2 og T3-grade 3 tumorer. Den anden gren bestod af T1-grade 2 og T2-grade 3 tumorer. Den tredje gren bestod af tumorer med in situ carcinom, T2-grade 3 (CIS). Den 22-gen sæt blev delt op i to hovedgrupper. Den første klynge var sammensat af gener, der var overudtrykt (VEGFA, araf, BRAF, OPN, MMP2, KRAS, nationale tilsynsmyndigheder, TGFp1, Akt1, HRAS og TIMP1) og den anden klynge indeholdt gener, der var lige så eller under-udtrykt (EGF , RKIP /PBP, FGF2, EGFR, RAF1, CDKN2D, TP53, CDKN2A, MMP9 og MKI67) i TCC vs. normalt væv. De relative ekspressionsniveauer af GOI’er i hver tumor gruppe blev udtrykt som et forhold af de normaliserede ekspressionsniveauer fra tumoren gruppen til middelværdien niveauer af de normale væv, der blev sat til 1,0 (figur 2B og tabel S2).

hver række i diagrammet repræsenterer et gen og hver søjle en tumorprøve. Farvemætningen repræsenterer forskelle i genekspression tværs tumorprøverne; rød indikerer udtryk højere end medianen (sort), og grøn indikerer udtryk lavere end medianen. Farveintensiteten indikerer graden af ​​genregulering (A). Fold ekspression af GOI’er med hensyn til tumorhistologi, som påvist ved microarray analyse (B).

fold ekspression (middel ± SD) i GOI’er i hver af de tre tumor grupper sammenlignet med det normale væv, som er erhvervet af vores microarray analyse, er vist i (fig S2)

Verifikation af mRNA og proteinekspression i forhold til klinisk-patologiske karakteristika Salg

mRNA-ekspression af generne:. VEGFA, araf, BRAF, OPN (SPP1), MMP2, KRAS, nationale tilsynsmyndigheder, TGFp1, Akt1, HRAS, EGF, RKIP (PBP), FGF2, EGFR, RAF1, TP53, CDKN2A (P14

ARF /p16

INK4a) , MMP9 blev bestemt ved qPCR i både blærecancer og normalt væv (tabel S3). Scatter plots blev konstrueret for bedre visualisering af generne, der var opreguleret ( 2 gange), nedreguleret ( 2 gange) eller ligeså udtrykt (2-fold forskel tærskel) mellem BC og kontroller. Vulkan plots graftegningshandlinger loggen

2 af folden ændring i ekspressionen af ​​hvert gen mellem BC prøver vs dens p-værdi fra t-test blev også konstrueret (figur 3).

Den sorte linje angiver fold ændringer 1. de lyserøde linjer angiver tærsklen i genekspression fold-change (2-fold forskel). qPCR afslørede op- og nedreguleret gener i urinblæren kræft. Totalt RNA fra den normale tilstødende væv og urin blærecancer blev karakteriseret i tekniske tre eksemplarer, og de relative ekspressionsniveauer for hvert gen i de to vævstyper blev plottet mod hinanden i Scatter Plot. VEGFA, OPN, P14

INK4a, p6

CDKN2A, nationale tilsynsmyndigheder og TGFp1 blev opreguleret, mens FGF2 og EGF blev nedreguleret af mindst to gange (uden for de lilla linjer). Generne KRAS, MMP2, Akt1, p53, EGFR, MMP9 og HRAS udviste lige ekspression mellem blærecancer og normalt væv (A). Volcano afbilder grafer loggen

2 af folden ændring i ekspression af hvert gen mellem BC prøverne versus dets p-værdi fra t-test. Den sorte linje angiver fold ændringer 1. De lyserøde linjer angiver tærsklen i genekspression fold-change (2-fold forskel). Den blå linje angiver grænsen for p-værdien af ​​t-test (0,01) (B).

Generne OPN, VEGFA, TGFp1, p16

INK4a, p53, RKIP og nationale tilsynsmyndigheder var betydeligt over-udtrykt i BC vs normale væv (p 0,001; t-test) (figur S3A). De gennemsnitlige mRNA-ekspression værdier mellem BC og normalt væv for hvert gen er afbildet i tabel 2.

mRNA ekspressionsniveauer af gener p14

ARF, Akt1, HRAS, araf, BRAF, RAF1 , MMP9, EGFR og KRAS, ikke signifikant forskellig mellem BC og kontrol væv (p 0,01; t-test). De gennemsnitlige mRNA udtryk værdier mellem BC og normalt væv for hvert gen, var som følger: P14

ARF, 0,0325 ± 0,0488 vs. 0,0100 ± 0,0118 (p = 0,1087); Akt1, 0,0321 ± 0,0230 vs. 0,0262 ± 0,0174 (p = 0,3632); HRAS, 0,0015 ± 0,0021 vs. 0,0015 ± 0,0021 (p = 0,9752); Araf, 0,9931 ± 0,0047 vs. 0,9942 ± 0,0040 (p = 0,5201); BRAF, 0,8933 ± 0,0657 vs. 0,9053 ± 0,0486 (p = 0,8999); RAF1, 0,9348 ± 0,0527 vs. 0,9419 ± 0,0293 (p = 0,6681); MMP9, 0,0014 ± 0,0015 vs. 0,0023 ± 0,0054 (p = 0,1265); EGFR, 0,0078 ± 0,0073 vs. 0,0049 ± 0,0048 (p = 0,0948); . KRAS, 0,0876 ± 0,0997 vs. 0,0773 ± 0,0900 (p = 0,4035; Mann-Whitney U test) (figur S3B)

EGF, FGF2 og MMP2 udstillet betydelig under-udtryk i BC vs normale væv: EGF , 0,00004 ± 0,000047 vs. 0,000151 ± 0,000235 (p = 0,0017); FGF2, 0,0003 ± 0,0004 vs. 0,0023 ± 0,0019 (p 0,0001); MMP2, 0,0752 ± 0,0858 vs. 0,1341 ± 0,0834 (p = 0,0007; Mann-Whitney U test) (figur S3C)

mRNA ekspression af generne, der udstillede over-, lig med eller under-udtryk efter. vores qPCR-analyse blev også undersøgt i forhold til den fase /stilling af tumorer. Alle statistisk signifikante forskelle i ekspression af hvert gen blandt tumor grupper T2 /T3-grade 3, T1-grad 3 og T1-grade 2, er afbildet i figur 4.

Grupper par blev statistisk sammenlignet under anvendelse af Mann -Whitney U test. Barer skildrer de medianværdier (A). Scatterplot afbilder mRNA-niveauerne af de gener, der var lige så udtrykt blandt urinblæren kræft i forskellige trin /stilling, og normalt væv. Grupper par blev statistisk sammenlignet under anvendelse af Mann-Whitney U test. Barer skildrer de medianværdier (B). Scatterplot afbilder mRNA-niveauerne af generne, der var under-udtrykt i forskellige urinblære kræft i andet stadium /stilling, versus normalt væv. Gruppe par blev statistisk sammenlignet under anvendelse af Mann-Whitney U test. Barer skildrer de medianværdier (C).

Udtrykket af OPN (SPP1), TGFp1, VEGFA, CDKN2A (P14

ARF /p16

INK4a), HRAS og TP53, var også kontrolleret på proteinniveau, ved densitometrisk analyse af Western blots (figur 5). De normaliserede proteinniveauer i BC vs. normale væv var som følger: OPN, 0,645 ± 0,287 vs. 0,261 ± 0,020 (p = 0,0286); TGFp1, 0,837 ± 0,114 vs. 0,300 ± 0,195 (p = 0,0286); VEGFA, 0,678 ± 0,183 vs. 0,295 ± 0,133 (p = 0,05); CDKN2A, 0,687 ± 0,157 vs. 0,429 ± 0,088 (p = 0,0286); HRAS, 0,663 ± 0,258 vs. 0,420 ± 0,121 (p = 0,1143); p53, 0.760 ± 0.167 vs. 0,448 ± 0,295 (p = 0,2000; Mann-Whitney U test)..

β-actin (43 kDa) blev anvendt som ladningskontrol

Sammenhæng mellem mRNA /protein-ekspression af GOI’er og overlevelsesrater af blæren kræftpatienter

i alt 30 urinblære kræfttilfælde blev undersøgt for den samlede overlevelse. Patienter med tumorer i fase 1 præsenterede bedre samlet overlevelse sammenlignet med dem af fase 2 eller 3 [p = 0,0008, χ

2 = 14,32, Log-rank (Mantel Cox) test; p = 0,0041, χ

2 = 8,260, Gehan-Breslow-Wilcoxon test]. Desuden patienter med klasse 2 tumorer viste en bedre samlet overlevelse vs. dem af grad 3 tumorer [p = 0,0475, χ

2 = 6,094, log-rank (Mantel Cox) test].

median værdi for MMP2 mRNA ekspression i blære kræft prøver var 0,038. Tilfældene blev inddelt i to grupper med ekspression over og under denne medianværdien. Ligeledes vi inddelt sagerne i grupper baseret på medianværdier for MMP9 (0,0007), OPN (0,031), VEGFA (0,141), TGFp1 (0,0001), FGF2 (0,0002), P14

ARF (0,011), p16

INK4a (0,013), p53 (0,013), Akt1 (0,025), EGFR (0,005), EGF (0,00002), HRAS (0,0011), KRAS (0,051), de nationale tilsynsmyndigheder (0,024), araf (0,994), BRAF (0,916 ), RAF1 (0,956), RKIP (0,764) mRNA-ekspression (tabel 2)

De sager, hvis tumorer udviste lave niveauer af VEGFA ( . median værdi, 0,141) og EGFR ( medianværdi, 0,0051 ) mRNA-ekspression udstillet værre samlet overlevelsesrater end de sager, der udtrykker øget VEGFA ( median værdi, 0,141) og EGFR ( median værdi, 0,0051) mRNA-niveauer, henholdsvis [for VEGFA, p = 0,04; for EGFR, p = 0,02; Log-rank (Mantel Cox) test]. Patienter med højt TGFp1, FGF2, P14

ARF, Akt1, RKIP, KRAS og p53 mRNA niveauer viste også en bedre samlet overlevelse mønster, men korrelationen ikke var statistisk signifikant. Kaplan-Meier kurver for alle GOI’er er afbildet i figur 6.

De sager, hvis tumorer udviste lave niveauer af VEGFA ( median værdi, 0,141) og EGFR ( medianværdi, 0,0051) mRNA ekspression, udstillet værre samlet overlevelsesrater, end de sager udtrykker øget VEGFA ( median værdi, 0,141) og EGFR ( median værdi, 0,0051) mRNA-niveauer [for VEGFA, p = 0,04; for EGFR, p = 0,02; Log-rank (Mantel Cox) test]. Forskelle i overlevelse blev vurderet ved hjælp af Log-rank (Mantel Cox) test. Statistisk signifikans blev fastsat til 95% niveau (p 0,05)

Sammenligning af GEO Datasæt

Vi yderligere i forhold vores qPCR resultater til 4 offentligt tilgængelige BC microarray GEO datasæt:. GSE89 af Dyrskjøt et al. (2003) [19]; GSE7476 af Mengual et al. (2009) [21]; GSE3167 af Dyrskjøt et al. (2004) [20] og GSE12630 af Monzon et al. (2009) [22]. Alle logaritmisk

2 transformerede forhold mellem BC prøver vs. kontroller er afbildet i tabel S2.

Datasæt GSE12630 indeholdt kun data fra overgangsordning celle karcinom i urinblæren og metastatisk urothelial karcinom. Da ingen data fra det normale væv var tilgængelige for dette datasæt, udvundet vi normale væv data fra datasæt GSE89, og beregnet den logaritmiske

2 transformerede forhold mellem BC vs disse udtrukne data, som vi bruges som kontroller (tabel S2) .

Korrelationsanalyse

Vi udforskes korrelationen af ​​mRNA niveauer i GOI’er i BC samt i normalt væv, der udfører Spearman rank test (tabel S4).