PLoS ONE: Humant RNA Polymerase II-Association Faktor 1 (hPaf1 /PD2) Regulerer histon Methylering og chromatin Remodeling i kræft i bugspytkirtlen

abstrakt

Ændring i genekspression forbundet med kræft i bugspytkirtlen kunne tilskrives variationen i histon posttranslationelle modifikationer fører til efterfølgende ombygning af kromatin templaten under transkription. Men det sammenkoblede netværk af molekyler involveret i regulering sådanne processer stadig vanskeligt at definere. hPaf1 /PD2, en underenhed af det humane PAF-kompleks, der er involveret i reguleringen af ​​transkriptionel forlængelse har onkogent potentiale. Vores undersøgelse udforsker muligheden for, at reguleringen af ​​histon methylering af hPaf1 kan bidrage til ændring i genekspression ved nukleosomal omlejring. Her viser vi, at knockdown af hPaf1 /PD2 fører til nedsat di- og tri-methylering på histon H3 lysin 4 rester i bugspytkirtelkræftceller. Interessant, hPaf1 /PD2 colocalizes med MLL1 (Blandet Lineage Leukæmi 1), en histon methyltransferase der methylerer H3K4 rester. Også en nedsættelse af hPaf1 niveau resulterede i reduceret MLL1 udtryk og et tilsvarende fald i niveauet af CHD1 (Chromohelicase DNA-bindende protein 1), en ATPase afhængig kromatin remodeling enzym, som specifikt binder til H3K4 di- og trimethyl varemærker. hPaf1 /PD2 viste sig også at interagere og colocalize med CHD1 i både cytoplasmatiske og nukleare ekstrakter af bugspytkirtelkræftceller. Endvidere kunne reduceret niveau af CHD1 lokalisering i kernen i hPaf1 /PD2 Knockdown celler blive reddet af ektopisk udtryk for hPaf1 /PD2. Micrococcal nuclease fordøjelse viste en ændret chromatinstruktur i hPaf1 /PD2-KD-celler. Samlet set vores resultater tyder på, at hPaf1 /PD2 i samarbejde med MLL1 regulerer methylering af H3K4 rester, samt interagerer og regulerer nukleare shuttling af kromatin remodeling protein CHD1, letter dens funktion i bugspytkirtelkræftceller

Henvisning:. Dey P, Ponnusamy MP, Deb S, Batra SK (2011) Humant RNA Polymerase II-Association faktor 1 (hPaf1 /PD2) Regulerer histon Methylering og chromatin Remodeling i kræft i bugspytkirtlen. PLoS ONE 6 (10): e26926. doi: 10,1371 /journal.pone.0026926

Redaktør: Mary Bryk, Texas A M University, USA

Modtaget: September 4, 2011; Accepteret: 5 oktober 2011; Udgivet: 27 okt 2011

Copyright: © 2011 Dey et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forfatterne på dette arbejde er støttet af tilskud fra National Institutes of Health (CA78590, CA111294, CA127297, CA133774 og CA131944) og Department of Defense (BC073541). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

post-translationelle modifikationer af basiske histon proteiner, såsom phosphorylering, methylering, acetylering, ubiquitylering eller sumoylation, spiller en vigtig rolle i reguleringen af ​​genekspression. En måde, hvorpå sådanne histon modifikationer funktion er ved rekruttering af nedstrømseffektor proteiner, som udfører specifikke uafhængige funktioner på kromatin skabelonen. Disse omfatter kromatin remodeling proteiner, som “læse” de modificerede histon mærker og bruge ATP energi til at ændre placeringen af ​​nukleosomer på DNA. Som et resultat heraf er kromatin skabelon enten blokeret eller gøres tilgængelige for transkriptionsmaskineriet, dermed regulering nedstrøms genekspression. Histon methylering, specifikt histon H3 lysin 4-rest mono-, di- og trimethylation, er for det meste forbundet med 5 ‘regioner af aktivt transkriberede gener [1]. en nylig undersøgelse viser imidlertid, at i områder af DNA-skader, ING proteiner rekruttere HDAC komplekser at lukke munden transskription af celleproliferation gener gennem anerkendelse af trimethyleret H3K4 rester af deres ph.d.-domæner [2]. Dette er den første rapport forbinder K4 trimethylation til aktivt undertrykte gener samt.

I pattedyr er methylering ved H3K4 rest udføres af histon methyltransferase MLL1, en SET-domæne indeholdende protein, som forbliver i et kompleks med andre underenhedsproteiner WDR5, RbBP5 og ASH2 [3]. Gæren homolog af MLL1, Sæt1, er en del af et makromolekylært kompleks kaldet COMPASS (kompleks af proteiner associeret med Sæt1), der interagerer med gær PAF kompleks for histon methylering [4]. Det er blevet postuleret, at nogle bevarede gener, fra Drosophila til mennesker, bære denne methylering varemærke, der udelukkende og ekspression af disse gener reguleres af Pol II generelle forlængelsesfaktorer [1]. De H3K4 histon methylering mærker kan yderligere genkendes af specifikke proteiner, hvilket resulterer i rekruttering og efterfølgende enzymatiske eller fysiologisk aktivitet på stedet for rekruttering. CHD1 (Chromodomain Helicase DNA bindende protein 1) er et protein, der tilhører familien af ​​ATPase afhængig kromatin remodeling faktorer, der specifikt forbinder med dimethylerede og trimethyleret H3K4 [5], [6]. Den menneskelige CHD1 binder sig til methylerede histon H3K4 rest gennem både sine tandem chromodomains, mens gæren CHD1 ikke binde denatureret H3K4 rester [7].

Kræft udvikling og progression tilskrives dysreguleret genekspression, som måske ofte korrelerer med enten defekt epigenetisk aktivering eller inaktivering af gener [8]. Ændrede histon modifikation mønstre forårsage mistargeting af kromatin remodeling enzymer, der kan føre til ukontrolleret genekspression og dermed forårsage normale celler, der skal omdannes til kræftceller. Kræft i bugspytkirtlen er den fjerde hyppigste årsag til kræft med en meget dårlig prognose og fem års overlevelse på mindre end 5%. Ligesom andre former for malignitet, er pancreascancer også korreleret til epigenetiske ændringer såsom DNA methylering og histon modifikationer, hvilket fører til en ændret genekspression [9].

PD2 er den humane homolog af gær-RNA-polymerase II associeret faktor 1 (yPaf1), som udgør kernen underenheden af ​​det humane RNA-polymerase II associeret faktor (hPAF) kompleks. Svarende til sin gær modstykke er hPAF kompleks består af fire andre underenheder nemlig hLeo1, hCtr9, hSki8 og parafibromin [10] – [12]. De vigtigste funktioner i hPAF komplekset indebærer transkriptionel forlængelse, mRNA-processering og modning, svarende til den i gær PAF-komplekset [12]. Chromatin modifikation og remodeling er også nogle af de karakteristika af transkriptionsfaktorer. Åbenbart, har et væld af histon modifikationer blevet forbundet med PAF-komplekset og transcription forlængelse samt [4], [13]. Både gær og det humane PAF-komplekset viser sig at være nødvendig for Rad6 /Bre1-afhængig ubiquitylering af histon H2B [14]. Den monoubiquitylation af H2B ved hPAF fjerner nukleosomal barriere, hvilket er en forudsætning for effektiv transkription forlængelse på kromatin af RNA Pol II [14]. Tilstedeværelsen af ​​ubiquitylated H2B udløser yderligere H3K4 di- og tri-methylering. I gær er Paf1C funktion i H3K4-Me3 dannelse tillagt ved Rtf1 underenheden ved at rekruttere den SÆT1 histon methyltransferase kompleks [15], som er homolog til det humane MLL-komplekset [16]. Gær undersøgelser viser også, at Paf1 komplekset er nødvendig for rekruttering af COMPASS methyltransferase komplekse til RNA-polymerase II gennem underenhed interaktion. I humane celler, hCdc73 synes at være nødvendig for fuld niveauer af H3K36-Me3 [17], men ikke H3K4-Me3, mens Cdc73 i gær er nødvendig for begge ændringer [18]. Derfor rolle PAF kompleks i transskription forlængelse har været tæt korreleret til histon modifikationer.

Ud over sin rolle i transskription regulering, de menneskelige PAF komplekse underenheder har også været forbundet med en malign fænotype. Parafibromin (hCdc73) viser sig at være muteret i parathyroidea tumorer og forstærkes i lever og bryst carcinom. Leo1, til stede ved 15q21 locus, forstærkes i kolorektal cancer og maligne fibrøst histiocytom af knoglen, mens

Ctr9

gen locus findes at blive slettet i kræft i bugspytkirtlen. Den hPaf1 underenheden af ​​den humane PAF kompleks, også kendt som PD2, forstærkes og overudtrykkes i bugspytkirtelkræft og dens mulige rolle i tumorigenese indikeres ved induktion af en transformeret fænotype overekspression [19]. I denne undersøgelse identificerer vi en rolle hPaf1 /PD2 i reguleringen histon methylering på H3K4 rest i bugspytkirtelkræftceller ved interaktion med histon methyltransferase MLL1. Det viste sig også at regulere ekspressionen af ​​kromatin remodeling faktor, CHD1 som specifikt binder til di og trimethyleret H3K4 og lette dens kerneimport, sandsynligvis gennem direkte interaktioner. Endvidere micrococcal nucleasefordøjelse analyser viser, at knockdown af PD2 fører til ændret nukleosomal positionering i bugspytkirtelkræftceller.

Materialer og metoder

Cell kultur

Humane bugspytkirtelkræft cellelinjer Panc1 og MiaPaCa blev opnået fra ATCC. Cellerne blev kultur i DMEM-medium (Sigma) suppleret med 10% føtalt bovint serum (Sigma) og 1% penicillin-Streptamycin opløsning (Sigma). Dyrkningsmediet blev skiftet hver 2. dag, og celler blev videredyrket med trypsin-EDTA-behandling.

RNA-isolering og QRT-PCR

Totalt cellulært RNA blev ekstraheret fra Panc1 celler under anvendelse af RNAeasy (Qiagen) og forarbejdet til revers transkription. Den indledende PCR aktiveringstrin var ved 94 ° C i fire minutter, efterfulgt af denaturering ved 94 ° C i et minut, primer-annealing trin ved 58 ° C i 30 sekunder, forlængelse ved 72 ° C i et minut, og det sidste forlængelsestrin ved 72 ° C i ti minutter. PCR reaktionsprodukterne blev derefter separeret ved elektroforese under anvendelse af en 2% agarosegel. Geler blev farvet under anvendelse af 0,5 ug /ml ethidiumbromid, oplyst med UV-lys. Totalt celle-RNA blev revers-transkriberet og analyseret ved kvantitativ realtids-PCR under anvendelse af SYBR Green inkorporering. Udtrykket af alle gener blev normaliseret til den for interne kontrolsystemer β-actin og udtrykkes i forhold til den angivne referenceprøve (gennemsnit ± standardafvigelse for tredobbelte reaktioner). Udtrykkene for linjespecifikke gener blev sammenlignet mellem de krypterede og PD2 knockdown Panc1 celler ved den tosidede t-test. En p-værdi på 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

RNA Interference

Regionen Paf1 /PD2 blev målrettet med specifikke siRNA (sekvens 5’AACAGGUUCGUCCAGUACAAA-3) «.. Syntetisk sense- og antisense-oligonukleotider (Dharmacon, Lafayette, CO) blev annealet i 100 mM kaliumacetat, 30 mM HEPES-KOH (pH 7,4) og 2 mM magnesiumacetat i et minut ved 90 ° C og en time ved 37 ° C, og frosset. Oligonukleotider blev transficeret ind i celler med

Trans

IT-TKO (Mirus, Madison, WI) i overensstemmelse med leverandørens anbefalinger.

immunblotassay

Panc1 og MiaPaCa cellelinjer var forarbejdet til protein ekstraktion og Western blotting under anvendelse af standardprocedurer. Kort beskrevet blev cellerne vasket to gange i PBS og lyseret i RIPA-buffer (100 mM Tris, 5 mM EDTA, 5% NP40; pH 8,0) indeholdende proteaseinhibitorer (1 mM phenylmethyl sulfonylfluorid, 1 ug /ml aprotinin, 1 ug /ml leupeptin) og holdt ved 4 ° C, og supernatanter blev opsamlet. Tyve ug proteinlysater blev løst i 10% SDS-PAGE. Opløste proteiner blev overført til PVDF-membranen. Efter hurtig vask i PBST (phosphatbufret saltvand og 0,1% Tween 20) blev membranerne blokeret i 5% fedtfri tørmælk i PBS i mindst 2 timer og derefter inkuberet med primære antistoffer (anti-Paf1 /PD2, anti-Leo1, anti-Cdc, anti-Ski8, anti Oct3 /4, anti-SOX2, anti-β-actin) (fortyndet i 3% BSA i PBS) natten over ved 4 ° C. Membranen blev derefter vasket (3 x 10 min) i PBST ved stuetemperatur og probet med 1:2000 fortyndet peberrodsperoxidasekonjugeret anti-muse- eller anti-kanin sekundære antistoffer i 1 time ved stuetemperatur og vasket 5 x 10 min med PBST . Signalet blev detekteret med en ECL chemiluminescens-kit (Amersham Bioscience, UK). Alle Western blots blev kvantificeret ved hjælp af ChemiImager 4400-softwaren. Graferne genereret show fejlsøjler repræsenterer standard fejl som beregnet ud fra tre uafhængige eksperimentelle replikater. Forskellen i hvert protein niveau mellem røræg og PD2 Knockdown celler analyseres ved Studerende t-test med en p-værdi på mindre end 0,05 overvejes statistisk signifikant.

konfokalmikroskopi

Celler udpladedes onto sterile runde dækglas (CIR 18-1 Fisher brand 12-545-10) og dyrket i 12-brønds plader i 24 timer. Celler blev fikseret i iskold methanol (forkølet til -20 ° C) og permeabiliseret med 0,1% Triton X-100 i PBS. Derefter blev cellerne vasket i PBS og blokeret under anvendelse af 10% gedeserum i 30 minutter. Efter blokering blev det inkuberet med primær (PD2 muse monoklonale, CHD1 kanin polyklonale) antistoffer i en time og fluorescerende mærkede sekundære antistoffer (FITC gede-anti-muse, Texas-Red gede-anti-kanin) i 30 minutter ved stuetemperatur. Antistoffer blev fortyndet i 5% gedeserum. Endelig efter sekundært antistof inkubation blev cellerne vasket med TBST tre gange og dækglas blev monteret med Vectashield indeholdende DAPI (Vector).

Isolering af cytoplasmatisk og kerneekstrakt

Protokollen for cytoplasmiske og forberedelse kerneekstrakt blev tilpasset fra tidligere publicerede procedurer. Celler blev skyllet to gange i iskold PBS og inkuberet på is i 30 minutter i hypotonisk cytoplasmatisk ekstraktionsbuffer (10 mM Hepes, pH 7,4, 10 mM KCI, 0,2% NP-40, 0,1 mM EDTA, 10% glycerol, 1,5 mM MgC

2, 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 5 mM Na

3VO

4, 5 mM NaF), suppleret med komplet proteaseinhibitorcocktail [Roche]. Celleødelæggelse blev opnået ved adskillige passager gennem en 25G nål. Kerner blev opsamlet ved centrifugering ved 16.000 g, og supernatanten centrifugeres yderligere ved 16.000 g til opnåelse af endelige cytoplasmatiske ekstrakt. Nukleare pellets blev vasket to gange med iskold PBS efterfulgt af inkubation i hypertonisk ekstraktion nukleare puffer (20 mM Hepes, [pH 7,6], 420 mM NaCl, 1 mM EDTA, 20% glycerol, 1,5 mM MgCl

2, 1 mM DTT , 1 mM PMSF, 5 mM Na

3VO

4, 5 mM NaF), suppleret med komplet proteaseinhibitorcocktail [Roche]. Opløsningen blev yderligere lydbehandlet ved 60% amplitude to gange i 10 sekunder hver. Uopløselige materialer blev udfældet ved centrifugering. Supernatanten blev opsamlet og anvendt som kerneekstrakt.

immunpræcipitationsanalyse

Lige store mængder protein A + G-Sepharose-perler (Oncogene Research, Boston, MA) blev inkuberet natten over med anti-PD2 (kanin polyklonale) og anti-CHD1 (kanin polyklonale) antistoffer i en 1 ml totalvolumen. Den blev derefter vasket to gange for at fjerne ubundet antistof og 1,5 mg protein lysat blev sat til perle-antistof mix og inkuberet på en roterende platform i 5 timer ved 4 ° C. Efter inkubationsperioden blev blandingerne vasket fem gange med lyseringsbuffer. Immunopræcipitaterne eller totale cellelysater blev elektroforetisk opløst på SDS-PAGE (10%). Opløste proteiner blev overført til PVDF-membranen. Efter hurtig vask i PBST (phosphatbufret saltvand og 0,1% Tween 20) blev membranerne blokeret i 5% fedtfri tørmælk i PBS i mindst 2 timer og derefter inkuberet med primære antistoffer (anti Paf1 /PD2, Oct3 /4 og RNA Pol II). Immunoblots blev vasket fem gange (5 x 10 min), inkuberet i 1 time med peberrodsperoxidasekonjugeret sekundære antistoffer, vasket fem gange (5 x 10 min), omsat med forøget kemiluminescens ECL reagens (Amarsham Bioscience, Buckinghamshire, UK), og udsat for røntgenfilm registrere signalet.

Micrococcal nucleaseassayet

micrococcal nuklease-assay blev udført som tidligere nævnt [20] med nogle modifikationer. Fifty × 10

6 celler blev pelleteret ved 2000 rpm ved 4 ° C i 10 minutter, efterfulgt af vask med 10 ml iskold PBS og igen pelleteret som før. Cellerne blev derefter resuspenderet i 5 ml iskold NP-40 lysisbuffer (10 mM Tris-HCI (pH 7,4), 10 mM NaCl, 3 mM MgCb

2, 0,5% Nonidet P-40, 0,15 mM spermin og 0,5 mM spermidin), inkuberet i 5 minutter på is, og kernerne blev pelleteret. Kernerne blev vasket med 2,5 ml MNase digestionspuffer (10 mM Tris-HCI, 15 mM NaCl, 60 mM KCI, 0,15 mM spermin og 0,5 mM spermidin), og efter centrifugering yderligere resuspenderet i 1 ml MNase fordøjelse buffer indeholdende 2 mM CaCl

2. Fra de resuspenderede opløsninger blev 100 pi prøver udtaget og inkuberet med stigende mængder af den Micrococcal nucleaseenzym (0, 80 og 100 enheder) i 5 og 10 minutter. Reaktionen blev standset ved tilsætning af 80 pi MNase digestionspuffer, 20 pi MNase stopbuffer (100 mM EDTA, 10 mM EGTA), 3 pi proteinase K (25 mg /ml) og 10 pi 20% SDS og inkuberet natten over ved 37 ° C. Den følgende dag prøverne ekstraheret med 200 pi phenol-chloroform-opløsning. Prøverne blev centrifugeret, og en vandig fase blev opsamlet. To pi RNAse A (10 mg /ml) blev tilsat til opløsningen, og inkuberet ved 37 ° C i 2 timer og igen phenol-chloroformekstraktion blev udført. Endvidere blev DNA’et udfældet ved tilsætning af 100% ethanol og efter centrifugering blev DNA-pelleten resuspenderes i DNA hydrering buffer eller vand. Fem pg af det isolerede DNA blev løst i en 1,4% agarosegel og visualiseret ved ethidiumbromidfarvning. ImagJ software blev anvendt til densitometri analyse af DNA-banding mønstre i kontrol, Scrambled og PD2 KD PC celler.

Resultater

hPaf1 /PD2 påvirker andre PAF komplekse underenheder i PC celler

det humane PAF komplekset består af fem underenheder, der ligner dens gær modstykke, nemlig hPaf1, parafibromin (hCdc73), hCtr9, hLeo1 og hSki8 underenheden, som også er en del af det menneskelige SKI kompleks. Tidligere rapporter har vist, at underenheder af humane PAF kompleks demonstrerer koordineret udtryk, hvor knockdown af enten hCtr9 eller hSki8 underenheden ført til en reduktion i niveauet af de andre underenheder såsom hPaf1 og hLeo1 [12]. Dette er i overensstemmelse med den observation i gær, hvor sletning af enkelte underenheder fører til forskellige grader af reduktion i protein niveauer af andre underenheder [21]. Interessant, har de seneste data fra vores laboratorium vist, at de PAF komplekse underenheder fungerer uafhængigt i muse embryonale stamceller, således at knockdown af Paf1 underenheden ikke påvirker niveauet for de andre underenheder [22]. For at analysere den funktionelle betydning hPaf1, den store underenhed af hPAF komplekset i bugspytkirtelkræft, vi forbigående slået ned hPaf1 /PD2 i pancreas cancer cellelinjer Panc1 og MiaPaCa. I bekræftelse med tidligere rapporter, fandt vi, at hPaf1 /PD2 har en koordineret udtryk med de andre underenheder af hPAF kompleks. Western blot analyse af hCdc73 (parafibromin), hLeo1, hSki8 og hCtr9 proteiner og efterfølgende kvantificering viste reduceret ekspression niveauer af hLeo1, hCdc73 og hCtr9 underenhed i hPaf1 knockdown Panc1 og MiaPaCa-celler sammenlignet med scrambled siRNA behandlede celler (fig. 1) men ikke statistisk signifikant. (P 0,05) Men der var ingen observerbar ændring i proteinniveauet af hSki8 underenhed ved nedregulering af hPaf1 underenheden. Vi bekræftede yderligere resultater ved at bruge en anden pulje af siRNA’er (Santa Cruz, CA) rettet mod PD2 og observerede lignende effekt (Fig. S3). Disse resultater viser, at knockdown af en underenhed af hPAF komplekset påvirker ekspressionen af ​​de andre medlemmer for at opretholde et generelt støkiometrisk forhold af komplekset i bugspytkirtelkræftceller. Endvidere er det understreger også forskellen udtryk og funktion af de enkelte underenheder af PAF kompleks i forskellige carcinomer.

Panc1 og MiaPaCa bugspytkirtelkræftceller blev transficeret med scrambled og PD2 specifikke siRNA oligoer og proteinlysater blev indsamlet på 72 timer post-transfektion. Western blot analyse af cellelysaterne ved hjælp tilsvarende antistoffer viste ekspressionen af ​​hPaf1 /PD2 og andre PAF komplekse molekyler (parafibromin, hLeo1, hSki8 og hCtr9) i krypteret og Paf1 /PD2 RNAi behandlede Panc1 og MiaPaCa celler. Ekspressionen af ​​histon 3 Lysin 4 rest mono-, di- og tri-methylering varemærker viste et reduceret niveau i hPaf1 /PD2 Knockdown Panc1 og MiaPaCa celler sammenlignet med scrambled RNAi behandlede celler. Det samlede Histone H3 niveau er det samme i både krypteret og PD2 slået ned celler. β-actin tjente som en loading kontrol. Kvantificering af Western blots for hver cellelinje er vist nedenfor immunblottet tal med tilsvarende fejlsøjler. * Repræsenterer betydelig ændring (p 0,05) i protein-niveau mellem røræg og PD2 Knockdown celler

hPaf1 /PD2 påvirker histon methylering i PC celler

gær PAF Komplekset har en brønd. etableret rolle i histon modifikationer, såsom ubiquitylering og methylering [4], [23] – [25]. Det er kendt at mediere interaktionen mellem Rad6-Bre1 kompleks, kompas histon methyltransferase, og RNA Pol II, hvilket fører til ubiquitinering af histon H2B ved lysin 123 rest, der er en efterfølgende udløser for methylering ved lysin 4 rest af histon H3 [24]. En tidligere undersøgelse har vist, at RNAi mod hCtr9 eller hSki8 ført til en reduktion i det cellulære niveau af histon H3K4 mono- og trimethylation varemærker, men ikke dimethylering mærker i Hela celler, hvilket indikerer en mulig rolle af den menneskelige PAF kompleks i histon methylering samt [12 ]. Vi fandt, at forbigående knockdown af hPaf1 /PD2 via bestemte RNAi i bugspytkirtelkræftceller påvirker histon methylering på H3K4 rest (fig. 1). Western blot analyse af mono-, di- og trimethylation varemærker histon H3 lysine4 rest viste en signifikant reduktion (* p 0,05) i di- og trimethyleret H3K4 niveauer i PD2 Knockdown Panc1 og MiaPaCa-celler sammenlignet med scrambled RNAi behandlede celler. Men der var ikke meget variation i H3K4 monomethylation niveauer på grund af PD2 udtømning i bugspytkirtelkræftceller. Forsøgene blev gentaget med en anden pulje af PD2 specifikke siRNA’er i begge cellelinier (fig. S3). Vi igen observerede nedregulering af histon di- og trimethylation mærker som før med lidt eller ingen variation i histon monomethylsteroler niveauer.

hPaf1 /PD2 regulerer histon methyltransferase MLL1 proteinniveauet

Baseret på den iagttagelse, at hPaf1 /PD2 regulerer histon di og tri-methylering på H3K4 rest, vi ønskede at undersøge effekten af ​​hPaf1 knockdown på histon methyltransferaser. Den MLL1 proteinet tilhører SÆT1 familien af ​​lysin methyltransferaser er kendt for specifikt at regulere di- og trimethylation på histon H3 lysin 4 rester. Derfor analyserede vi effekten af ​​hPaf1 /PD2 knockdown på MLL1 proteinekspression ved hjælp af to forskellige sæt af PD2 siRNAs i Panc1 og MiaPaCa bugspytkirtelkræft cellelinjer. Western blot-analyse afslørede, at et fald i hPaf1 /PD2 niveau i bugspytkirtelkræftceller fører til et signifikant fald (* p 0,05) i MLL1 proteinniveau (figur 2A, S3.). Graferne leveres under immunoblotting resultater repræsenterer kvantificering af Western blots for hver cellelinje. Vi kiggede nærmere på PD2 og MLL1 proteiner i bugspytkirtelkræftceller ved konfokal mikroskopi og fundet, at de to proteiner colocalize i kernen, hvorved der antyder en mulig interaktion mellem dem (fig. 2B). Men mængden af ​​co-lokalisering af de to proteiner var forholdsvis lav, hvilket indikerer en eventuelt svag og /eller forbigående interaktion. Disse resultater var i bekræftelse med tidligere undersøgelser, der viste, at både gær og menneskelige PAF komplekser interagerer med den tilsvarende homolog af MLL eller Sæt1 protein [4], [26], [27]. Derfor er vores resultater tyder på, at hPaf1 /PD2 regulerer, og muligvis interagerer med MLL1, at kontrollere H3K4 methylering i bugspytkirtelkræftceller.

(A) Panc1 og MiaPaCa bugspytkirtelkræftceller blev transficeret med scrambled og PD2 RNAi oligoer og lysater blev opsamlet ved 72 timer post-transfektion. Western blot-analyse under anvendelse af specifikke antistoffer viser et fald i MLL1 histon methyltransferase proteinekspression i knockdown-celler sammenlignet med scrambled celler. β-actin tjente som en loading kontrol. Kvantificering data for western blot er tilvejebragt under de tilsvarende immunblotresultaterne for respektive cellelinier. Fejlsøjlerne angivne repræsenterer standardafvigelsen beregnet ud fra tre uafhængige eksperimenter. * Repræsenterer betydelig ændring (p 0,05) i protein-niveau mellem røræg og PD2 knockdown celler. (B) konfokalt mikroskop billeder, der illustrerer PD2 og MLL1 lokalisering i kernen af ​​Panc1 celler. MLL1 colocalizes med PD2 i diskrete regioner i kernen (farvet med DAPI) af Panc1 celler. Det indsatte repræsenterer et forstørret billede af de co-lokaliseringstoppe pletter af PD2 og MLL1.

Knockdown af hPaf1 /PD2 nedsætter CHD1 niveau i bugspytkirtelkræftceller

Reguleringen af ​​histon methylering af hPaf1 /PD2 underenheden af ​​hPAF komplekset rejser den mulighed, at det kan påvirke forskellige andre proteiner, såsom chromatin remodeling faktorer, som interagerer med modificerede histoner på steder med transkription. En formodet chromatin remodeling kompleks, CHD-1 (Chromodomain Helicase DNA-bindende protein 1), blev identificeret adventitiously som en mammal DNA-bindende protein, som indeholder tre signatur sekvensmotiver: 52-aminosyre chromodomain fundet i heterochromatin protein HP- 1 og homeotiske repressor Polycomb, den SnF2 /SWI2 ATPase domæne, og motiver karakteristiske for minor-groove DNA-bindende proteiner [28], [29]. Interessant er det CHD1 kromatin remodeling protein kendt for at binde specifikt til den methylerede lysin 4 rest af histon H3, hvilket er kendetegnende for aktiv transkription. Det påstås, at den menneskelige CHD1 chromodomains er ansvarlige for anerkendelse og samspil med histon methylering mærker [30]. Eftersom hPaf1 /PD2 reguleret histon methylering på H3K4 rest, vi undersøgte CHD1 regulering af hPaf1 ved forbigående knockdown af hPaf1 /PD2 i bugspytkirtelkræftceller og analyseret variationen i niveauer af CHD1 protein. Western blot-analyse sammen med tilsvarende kvantificering data tilvejebragt under immunoblotting tal (fig. 3A) viser, at knockdown af hPaf1 /PD2 i bugspytkirtelkræftceller fører til et fald i niveauet af CHD1 sammenlignet med scrambled kontrolceller. Nedregulering af CHD1 som en effekt af PD2 knockdown blev yderligere bekræftet i de samme cellelinier under anvendelse af en anden siRNA pool mod PD2 (fig. S3). For at validere denne effekt blev immunfluorescensmikroskopi brugt. I overensstemmelse med de biokemiske data, viste immunfluorescens analyse, at CHD1 niveauet er faldet i hPaf1 /PD2 Knockdown Panc1 og MiaPaCa celler i forhold til de krypterede MiaPaCa eller Panc1 celler (Fig. 3B). Kvantitativ real-time PCR-analyse viser endvidere, at sammen med PD2 mRNA, er der også et fald i CHD1 mRNA-niveau i PD2 siRNA behandlet Panc1 celler, hvilket indikerer, at hPaf1 regulerer CHD1 ekspression både transkription og translationelle niveauer (fig. S1a). Samtidig overekspression af PD2 i HPAF /CD18 bugspytkirtelkræftceller opregulerer også CHD1 udtryk (fig. S1B). Disse resultater indikerer, at hPaf1 /PD2 regulerer ekspressionen af ​​kromatin remodeling protein CHD1, hvilket antyder dets mulige rolle i omdannelsen af ​​chromatinstruktur under transkription forlængelse i bugspytkirtelkræftceller.

(A) Western blot-analyse viser en nedsat niveau af CHD1 protein i PC celler upon RNAi-medieret hPaf1 /PD2 inhibering. β-actin tjente som en loading kontrol. Grafen nedenfor hver Western blot tal repræsenterer de tilsvarende kvantificering resultaterne for de enkelte cellelinjer. (B) Immunofluorescensanalyse viser en reduceret hPaf1 /PD2 niveau (grøn) sammen med en tilsvarende reduktion i CHD1 niveau (rød) i PD2 siRNA behandlet PC celler sammenlignet med scrambled siRNA behandlede celler.

hPaf1 /PD2 interagerer med CHD1 i både cytoplasmaet og kernen i bugspytkirtelkræftceller

kromatin remodeling protein CHD1 er kendt for at interagere med transskription forlængelsesfaktorer og lokalisere aktivt transskriberede gener [31]. I gær CHD1 funktioner under transskription forlængelse gennem interaktioner med forlængelsesfaktorer, Spt4-Spt5 og Spt16-Pob3. Interessant er CHD1 også fundet at interagere med Rtf1 underenhed af gær PAF kompleks, der forbinder med RNA-polymerase II og regulerer transkription forlængelse [31]. Selvom Rtf1 er til stede hos mennesker, er det ikke som en del af hPAF komplekset. Derfor testede vi muligheden for, at hPaf1 /PD2 underenheden af ​​den humane PAF-komplekset interagerer med CHD1 hjælp co-immunopræcipitationsundersøgelser. Western blot analyse af de co-immunopræcipitater viser, at PD2 interagerer med CHD1 i både cytoplasma samt nukleare ekstrakter af bugspytkirtelkræftceller, Panc1 og MiaPaCa (fig. 4). Vi analyserede yderligere interaktionen mellem PD2 og CHD1 ved co-lokalisering undersøgelser under anvendelse af konfokal mikroskopi (fig. 5A). Den CHD1 farvning (rød) viste sig at overlappe den PD2 farvning (grøn), både i cytoplasmaet og i kernen af ​​bugspytkirtelkræftceller i bekræftelse med de biokemiske data. Disse resultater tyder på, at PD2 og CHD1 interagere og deltage yderligere i kromatinstruktur remodeling i bugspytkirtelkræft.

(A) Cytoplasmisk og nuklear ekstrakt fraktionering blev udført i Panc1 og MiaPaCa bugspytkirtelkræftceller efterfulgt af gensidig co-immunopræcipitering af endogen proteiner i cellefraktioner. Western blot analyse viser, at hPaf1 /PD2 interagerer med CHD1 i både cytoplasmatiske og nukleare ekstrakter af Panc1 og MiaPaCa bugspytkirtlen kræftceller. Anti-PD2 immunopræcipitater fra ekstrakter af Panc1 og MiaPaCa celler blev immunoblottedes med et anti-CHD1 antistof. Ligeledes blev anti-CHD1 præcipitater blottet med anti-PD2 antistof. Kanin-IgG blev anvendt som kontrol.

(A) Panc1 og MiaPaCa-celler blev transficeret med krypteret og PD2 RNAi oligoer og 48 timer efter transfektion immunfluorescens blev udført. Konfokal billeder viser, at der er nedsat lokalisering af CHD1 i kernen (blå, farvet med DAPI) af PD2 KD bugspytkirtlen kræftceller (midterste panel) sammenlignet med de kodede celler (øverste panel). Celler blev yderligere retransficeret med pBABE-hygro PD2 konstruktion til ektopisk ekspression af PD2, 72 timer efter intital transfektion. Konfokale billeder illustrerer tilsætning af eksogent PD2 reshuttles CHD1 tilbage til kernen (nederste panel). Det indsatte repræsenterer PD2 og CHD1 lokalisering i kernen (farvet med DAPI).