PLoS ONE: Den Notch Pathway er vigtig i Vedligeholdelse af Cancer Stem Cell Befolkning i pancreas Cancer

Abstrakt

Baggrund

bugspytkirtelkræft stamceller (CSCS) udgør en lille delpopulation af bugspytkirtelkræftceller der har kapacitet til at igangsætte og udbrede tumordannelse. Imidlertid er de mekanismer, hvormed pancreas CSCS vedligeholdes ikke godt forstået eller karakteriseret.

Metoder

Angivelse af Notch receptorer, ligander og Notch signalering målgener blev kvantificeret i CSC og ikke- CSC befolkninger fra 8 primære humane pancreas xenografter. En y-sekretase hæmmer (GSI), der inhiberer Notch pathway og en shRNA rettet mod Notch målgenet Hes1 blev anvendt til at vurdere rollen af ​​Notch vej hos CSC population vedligeholdelse og pancreas tumorvækst.

Resultater

Notch pathway komponenter blev fundet at være opreguleret i bugspytkirtlen CSCS. Hæmning af Notch vej ved hjælp af enten en gamma sekretase hæmmer eller Hes1 shRNA i bugspytkirtelkræftceller reducerede procentdelen af ​​CSCS og tumorsphere formation. Omvendt aktivering af Notch-vejen med et exogent Notch peptidligand steg procentdelen af ​​CSCS samt tumorsphere formationen. In vivo behandling af ortotopisk pancreas tumorer i NOD /SCID mus med GSI blokeret tumorvækst og reducerede CSC befolkning.

Konklusion

Notch signalvej er vigtige for opretholdelsen af ​​pancreas CSC befolkning og er et potentielt terapeutisk mål i bugspytkirtelkræft

Henvisning:. Abel EV, Kim EJ, Wu J, Hynes M, Bednar F, Proctor E, et al. (2014) Den Notch Pathway er vigtig i Vedligeholdelse af Cancer Stem Cell Befolkning i kræft i bugspytkirtlen. PLoS ONE 9 (3): e91983. doi: 10,1371 /journal.pone.0091983

Redaktør: Martin Fernandez-Zapico, Schulze Center for nye lægemidler, Mayo Clinic, USA

Modtaget: Januar 6, 2014 Accepteret: 15 Februar 2014; Udgivet: 19 marts 2014

Copyright: © 2014 Abel et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev finansieret af Randy Pausch Family AACR-PANCAN Innovation Award (DMS). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kræft i bugspytkirtlen er den fjerde mest almindelige årsag til kræft-relaterede dødsfald i USA trods de 10

th mest almindelige kræftdiagnose [1]. Den høje dødelighed skyldes til dels det faktum, at langt størstedelen af ​​pancreascancer er diagnosticeret på et fremskredent stadium. Men mindst lige så vigtigt er, at pancreascancer generelt kun minimalt lydhøre over for kemoterapi og strålebehandling. Der er stigende tegn på, at denne resistens mod terapi er i det mindste delvis på grund af den iboende modstand af en subpopulation af cancerceller, der er tumorigene og deler mange egenskaber med stamceller og dermed er blevet mærket cancer stamceller (CSC). Cancerstamceller blev først isoleret i myeloid leukæmi [2] og blev vist at dele stamcelle egenskaber som potentiale for selvfornyelse og evnen til at differentiere og proliferere. Efterfølgende er CSCS også blevet identificeret i en lang række faste tumorer, herunder bryst-, hjerne-, lever-, colon, prostata, melanoma, og pancreatiske tumorer [3] – [10] _ENREF_3. Kræft i bugspytkirtlen stamceller (CSC), blev først isoleret fra humane pancreascancer ved hjælp af markør profil ESA

+ /CD44

+ /CD24

+ [10]. Disse markør positive CSCS kunne danne tumorer i NOD /SCID-mus, der syntes histologisk ligner den primære tumor, hvilket tyder multi-potens med rekonstitution af de forskellige typer tumorceller. In vitro beviser for en stamcelle fænotype såsom selvfornyelse blev påvist ved evnen til at danne tumor sfærer

in vitro

i modsætning til ESA

– /CD44

– /CD24

– celler, som ikke kunne.

Det forbliver ufuldstændigt forstået hvordan bugspytkirtelkræft stamceller holdes i en heterogen tumor. En mulig bidragyder til CSC vedligeholdelse er Notch signalvejen. I de normale udviklingslande pancreas har Notch signalvej vist sig at være en vigtig regulator af balancen mellem selvfornyelse og differentiering [11] – [13]. Der er 4 medlemmer af den mammale Notch receptorfamilien (NOTCH 1-4), som er tilsvarende behandles og aktiveres gennem en række spaltningsbegivenheder. Det modne Notch-receptoren består af to underenheder, der frembringes som et resultat af en indledende spaltning begivenhed ved furin-lignende convertase [14]. Notch signalering pathway aktivering forekommer, når en hak receptor binder til en af ​​de fem kendte Notch-ligander [jagged1 (JAG1), jagged2 (JAG2), delta-like 1 (DLL1), delta-lignende 3 (DLL3), og delta-like 4 (DLL4)]. Ligandbinding forårsager en konformationel ændring i Notch receptor, som tillader en anden spaltning med tumornekrosefaktor-alfa-omdannende enzym (TACE) [15]. En tredje spaltningshændelse udføres af en y-sekretase (presenilin), som frigiver det intracellulære domæne af Notch tillader det at translokere til kernen for at aktivere ekspression af målgener [16].

Inhibering af Notch signalering pathway resulterer i udtømning af multipotente pancreasstamfaderceller [11], [13]. Omvendt inducerede Notch aktivering forhindrer pankreatisk epitheldifferentiering og resulterer i forøget vedligeholdelse af udifferentierede pancreasstamfaderceller [12]. Baseret på lignende fænotypiske kendetegn ved CSCS har Notch signalvej blevet evalueret for sin rolle i CSC selvfornyelse. Både bryst- og hjerne CSCS har vist sig at være steget Notch-aktivering [17], [18]. In vitro inhibering af Notch-signalvejen i disse to tumortyper resulterer i nedsat selvfornyelse, vist ved reduktion i tumorsphere formationen. Vi antager, at Notch signalvejen er yderligere opreguleret i pancreas CSC og bidrager til pancreas CSC funktion og bugspytkirtelkræft tumorigenese.

I denne undersøgelse har vi vurderet rolle Notch pathway i at opretholde CSC befolkning og dens virkninger af inhibering i pancreas tumorvækst. Vi registrerer opregulering af flere Notch pathway komponenter i pancreas CSCS og viser, at hæmning af en gamma sekretase hæmmer eller shRNA til Hes1, en nøgle Notch målgen, reducerer bugspytkirtel CSC selvfornyelse og tumorgenicitet. In vivo behandling af etablerede ortotopisk pankreatiske tumorer med en y-sekretase hæmmer reducerer tumorvækst og kombination med cytotoksisk kemoterapi yderligere forøger anti-tumor respons. Vores resultater tyder på, at Notch signalering er kritisk for pancreas CSC vedligeholdelse og at målrette Notch signalvejen i bugspytkirtelkræft har lovende terapeutisk potentiale.

Materialer og metoder

Etik Statement

pancreasadenocarcinom vævsprøver blev opnået fra patienter, der undergik kirurgiske procedurer inden University of Michigan Health System. Skriftligt informeret samtykke fra alle forsøgspersoner blev opnået før indsamling af væv, og alle protokoller involverer patientprøver blev gennemgået og godkendt af Institutional Review Boards fra University of Michigan Medical School (IRBMED). Original, er Papirudgaven af ​​alle skriftlige informerede samtykkeerklæringer holdes inden for en sikker fil på University of Michigan. De Institutional Review Boards fra University of Michigan Medical School (IRBMED) bestemt, at denne undersøgelse er i overensstemmelse med gældende retningslinjer, statslige og føderale bestemmelser, og University of Michigans Federalwide Assurance (FWA) med Department of Health og Human Services (HHS). Den IRBMED godkendte også alle skriftlige samtykke dokumenter, samt procedurerne for tilladelse, for denne undersøgelse. The University of Michigan Federalwide Assurance nummer for denne undersøgelse er FWA00004969, og studienævnet University of Michigan identifikationsnummer undersøgelse nummer er HUM00025339.

Antistoffer og reagenser

Merck gamma sekretase hæmmer (MK-0752) var leveret af Dr. Max Wicha (University of Michigan) og blev anvendt til

in vitro

og

ex vivo

undersøgelser. Gamma sekretase hæmmer RO4929097 blev venligst stillet til rådighed af Roche (Indianapolis, IN) og blev anvendt til de

in vivo

undersøgelser. PE-konjugeret muse-anti-humant CD44 og FITC-konjugeret muse-anti-humane CD24-antistoffer blev anskaffet fra B.D. (Franklin Lakes, NJ). APC konjugeret muse-anti-humant ESA blev indkøbt fra Miltenyi Biotech og biotinyleret muse-anti-muse H2K blev indkøbt fra Southern Biotech. Hes1 antistof anvendes til Western Blot blev opnået fra Dr. Xing Fan (University of Michigan) eller købt fra MBL International (Woburn, MA). Notch1 og spaltede Notch1 antistoffer blev indkøbt fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA) og β-actin-antistof blev købt hos Sigma (St. Louis, MO). Matrigel blev købt fra B.D. (Franklin Lakes, NJ). Hes1 shRNA klon V2LHS 249.784 blev købt fra Open Biosystems (Huntsville, AL). Delta /Serrate /Lag-2 (DSL) peptid (sekvens CDDYYYGFGCNKFCRPR) blev syntetiseret af University of Michigan Protein Structure Facility.

Protokol godkendelse

Animal protokoller blev godkendt af University udvalg for Brug og pleje af dyr (UCUCA) ved University of Michigan og lentivirus protokoller blev godkendt af Institutional biosikkerhed udvalg (IBC) ved University of Michigan.

Udarbejdelse af enkelte celle suspensioner af tumorceller

single cellesuspension af tumorceller blev fremstillet som beskrevet [10] med følgende modifikationer. Primær human pancreas adenocarcinom xenograftvæv blev hakket fuldstændigt og derefter suspenderet i 200 enheder /ml ultrarent collagenase IV (Worthington Biochemicals, Freehold, NJ) i Media 199 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Efter enzymfordøjelse ved 37 ° C i 45 til 60 minutter og mekanisk dissociering ved pipettering hver 15 minutter med en 10 ml pipette, det fordøjede og dissocierede celler blev filtreret gennem et 40 um nylon mesh cell begrænseren (BD Franklin Lakes, NJ) og vasket med HBSS (Invitrogen, Carlsbad, CA) to gange. Cellerne blev derefter resuspenderet i 2% FBS i HBSS for forsøgene.

Flowcytometri

Flowcytometri blev udført som tidligere [10] beskrevne. Dissocierede celler blev talt og overført til 5 ml rør, vaskes med HBSS /2% FBS to gange og resuspenderet i HBSS /2% FBS ved en koncentration på 1 million celler pr 100 pi. Sandoglobin (1 mg /ml) blev tilsat til prøven ved en fortynding på 1:50, og prøven blev inkuberet på is i 20 min, derefter vasket to gange med HBSS /2% FBS. Antistoffer PE-konjugeret muse-anti-humant CD44, FITC-konjugeret muse-anti-humant CD24, APC-konjugeret muse anti-human ESA og biotinyleret muse-anti-muse H2K tilsat ved fortyndingen som anvist, og prøven blev inkuberet i 45 min på is og derefter vasket to gange med HBSS /2% FBS. Streptavidin konjugeret med APC-Cy7 blev tilsat ved fortynding af 1:200 og prøven blev inkuberet på is i 15 minutter. Efter vask to gange med HBSS /2% FBS blev celler resuspenderet i HBSS /2% FBS indeholdende 3 pM 4 ‘, 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) (Invitrogen, Carlsbad, CA). Flowcytometri blev udført under anvendelse af en FACSAria (B.D., Franklin Lakes, NJ). Side scatter og forward scatter profiler blev brugt til at fjerne celle dubletter

Kvantitativ PCR

Primere til Notch pathway komponenter blev udvalgt fra en primer bank. (Wang Seed, 2003) og syntetiseret af Invitrogen (Carlsbad, CA). Totalt RNA blev ekstraheret fra sorterede cancer stamceller og ikke-cancer stamceller under anvendelse af et RNeasy Micro kit (Qiagen, Valencia, CA) som anvist. Omvendt transskription af cDNA blev udført ved hjælp af High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kits (Applied Biosystems, Foster City, CA) som anvist. qPCR blev udført på Rotorgene 6000 (Qiagen, Valencia, CA) under anvendelse af en Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystem, Foster City, CA) ifølge producentens instruktioner, med alle reaktioner normaliseret til GAPDH. Betingelser anvendt til qPCR var 95 ° C hold i 10 minutter, 40 cykler ved 95 ° C i 10 sek, 60 ° C i 15 sekunder og 72 ° C i 20 sek.

Tumorsphere kulturer

Etablerede bugspytkirtelkræft tumorspheres [10] blev holdt i kugle medier som beskrevet tidligere [19], [20] med modifikationer [50% NeuralBasal (Invitrogen, Carlsbad, CA), 1% N2 Supplement (Invitrogen, Carlsbad, CA), 2% B27 supplement (Invitrogen, Carlsbad, CA), 1% antibiotikum-antimykotikum (Invitrogen, Carlsbad, CA), 10 ng /mL BMP4 (Sigma), 10 ng /mL LIF (Sigma), 20 ng /ml human bFGF- 2 (Invitrogen, Carlsbad, CA), alle i 1:01 DMEM /F12 (Invitrogen, Carlsbad, CA)]. Tumorspheres blev passeret hver 6. dag. For passage blev tumorspheres dissocieret med 0,05% trypsin i 2-5 min og derefter straks vasket to gange med 40 ml PBS. Celler blev derefter passeret gennem en 40 um nylon mesh cellefilter, talt og udpladet i frisk sfære medium i Costar ultra low-fastgørelse plader med 6 brønde (Corning, Lowell, MA).

GSI behandling af tumorsphere celler

Tumorspheres blev dissocieret til enkelte celler og resuspenderet i sfære medium indeholdende GSI ved de angivne koncentrationer for de angivne tidsperioder. Celler blev derefter observeret under et mikroskop eller udtages til analyse.

Western blotting

celler behandlet med eller uden GSI i forskellige doser blev lyseret i lysepuffer (20 mM Tris pH 7,5 /150 mM NaCl /12 mM EDTA /10% glycerol /1% Triton X-100) indeholdende en proteasehæmmer cocktail (Roche Applied Science, Indianapolis, IN) og PhosphoStop (Roche Applied Science, Indianapolis, IN). Proteinkoncentrationen blev målt under anvendelse af et Bio-Rad Protein Assay (Bio-Rad, Hercules, CA). Halvtreds ug protein blev blandet med et tilsvarende volumen 2x SDS loading buffer (Invitrogen, Carlsbad, CA) og kogt i 5 minutter før påføring af prøven til SDS-PAGE. Efter SDS-PAGE blev proteinet gel blottet på en nitrocellulosemembran Hybond C ekstra (Amersham Biosciences, Pittsburgh, PA) ved anvendelse af en Bio-Rad blottingapparat (BioRad, Hercules, CA) i en time. Blottet blev blokeret med 5% tørmælk i TBST i en time, vasket to gange i TBST, og derefter inkuberet med antistoffer (1:1000) i 5% BSA ved 4 ° C natten over. Blottet blev vasket tre gange i TBST og dernæst inkuberet med peroxidase-konjugeret sekundært antistof (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) i 5% tørmælk ved stuetemperatur i 1 time. Efter vask tre gange i TBST blev blottet inkuberet i 5 minutter med SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate (Pierce, Rockford, IL) og røntgenfilm (Denville Scientific, Metuchen, NJ) blev derefter udviklet.

shRNA transductioin

lentivirus konstruerer pGIPZ vektor, der indeholder Hes1 shRNA eller kontrol shRNA blev foretaget i Vector kerne på University of Michigan. Transduktion blev udført ved hjælp af en ViraDuctin lentivirus Transduktion Kit (Cell Biolabs, Inc. San Diego, CA) som anvist.

Apoptose assay

Tumorsphere celler transduceret med kontrol eller Hes1 shRNA blev dyrket i sfære medier indeholdende 4 ug /ml puromycin til 4 dage efterfulgt af trypsinisering og PBS vask. Celler blev filtreret gennem et 40 um nylonnet for at opnå enkeltcellesuspensioner. De resulterende enkeltceller blev fikseret med iskold 50% ethanol i PBS natten over. Celler blev derefter farvet med PI og FITC-annexin V under anvendelse af et Annexin V:. FITC Apoptose Detektion Kit II indkøbt fra BD Biosciences (San Jose, Californien)

DSL behandling af tumorspheres Salg

sfærer blev dissocieres til enkeltceller og re-suspenderet i sfære medium indeholdende DSL peptid ved angivne koncentrationer i de angivne tidsrum. Behandlede celler blev observeret under mikroskop eller høstet til analyse.

Ex vivo GSI behandling af tumorspheres og implantation i NOD /SCID-mus

Enkelte celler adskilles fra tumorspheres blev dyrket i sfære medium indeholdende DMSO eller 8 pM GSI i 48 timer, før de dissocieret med trypsin og farvet med DAPI og et antistof mod H2K. Celler blev sorteret ved FACS og DAPI negative og H2K negative celler blev opsamlet til opnåelse af en ren levende, human pancreascancer cellepopulation. Efter vask med HBSS blev sorterede celler resuspenderet i sfære medium. Cellelevedygtighed blev valideret ved anvendelse af Trypan blå (Invitrogen, Carlsbad, CA). Fyrretusinde celler i 50 pi medium blev blandet med et tilsvarende volumen af ​​Matrigel og injiceret subkutant i midflank region NOD /SCID-mus under anvendelse af en 23 gauge nål. Fem mus blev injiceret for hver behandlingsgruppe. Tumorstørrelse blev målt ugentligt. Tumorer fik ikke lov til at overstige 2 cm i diameter før eutanasi. Derudover blev dyrene overvåges dagligt af University of Michigan veterinære personale og aflivet på ethvert tegn på angst eller vægttab. Ved afslutningen af ​​undersøgelsen blev dyrene aflivet ved carbondioxid-kvælning efterfulgt af cervikal dislokation at sikre død.

ortotopisk Implantation af pancreas tumorceller i NOD /SCID-mus og GSI behandling

Pankreatiske tumorceller inkuberet med luciferase-udtrykkende lentivirus natten over blev vasket med serumfrit HBSS og suspenderes i en PBS /Matrigel blanding (01:01 volumen) ved en koncentration på 10 millioner celler /ml for implantation. Mus blev bedøvet med en intraperitoneal injektion af 100 mg /kg ketamin og 5 mg /kg xylazin, og en lille venstre subcostal indsnit blev udført. 500.000 bulk-tumorceller i et volumen på 50 pi blev injiceret i halen af ​​bugspytkirtlen anvendelse af en 30-gauge nål. Buprenorphin blev indgivet hver 6. time i de første 24 timer efter operation for at lindre smerter. Behandling med kemoterapi blev initieret 2 uger efter tumorer kunne påvises. Tre individuelle lav passage humane pankreatiske xenotransplantattumorer blev inkluderet i analysen. Der var 4 grupper af mus: kontrol, RO4929097 (GSI), gemcitabin, og GSI plus gemcitabin, med 5 mus per gruppe. Dyr blev evalueret ved bioluminescerende billeddannelse og tumorvækst blev evalueret ugentligt. GSI (30 mg /kg) blev indgivet ved oral sondeernæring ved frekvensen af ​​5 dage på 2 dage off. Denne tidsplan blev anvendt til at minimere GSI-induceret diarré sekundært til bæger-hyperplasi [21]. Gemcitabin (50 mg /kg) blev leveret ugentligt ved intraperitoneal injektion som tidligere beskrevet [22]. Behandling blev givet i 4 uger på hvilket tidspunkt dyrene blev aflivet ved carbondioxid-kvælning efterfulgt af cervikal dislokation at sikre døden. Inden aflivningen blev dyrene overvåges dagligt af University of Michigan veterinære personale og aflivet på ethvert tegn på angst eller vægttab. Nekropsi blev udført, og tumorer blev udskåret til analyse.

Bioluminescent Imaging

Bioluminescent billeddannelse af implanterede ortotopisk tumorer i mus blev udført under anvendelse af en Xenogen IVIS 200 Imaging System (Xenogen Biosciences, Cranbury, NJ) som tidligere beskrevet [23].

Immunhistokemi

Vævsprøver blev fikseret i 10% phosphatpufret formalin og indlejret i paraffin. Formalinfikserede, paraffinindlejrede snit blev skåret 4-um tyk, monteret på poly-L-lysin-coatede objektglas (Sigma) og tørret natten over ved 37 ° C. Snit blev derefter afvokset i xylen, rehydreret ifølge standard histopatologiske procedurer og farvet med H 0.05.

Resultater

Notch signalvejen opreguleres i bugspytkirtelkræft stamceller

Notch signalvej har vist sig at være aktiveret i bugspytkirtelkræftceller [24]. Vi antager, at Notch-signalvejen komponenter kan yderligere opreguleres i pancreascancer stamcelle subpopulation. Brug primære humane pancreas cancer-xenotransplantater fra 8 forskellige patientgrupper tumorer vi evaluerede ekspressionsniveauer for Notch signalvej komponenter i cancer stamceller i forhold til bulk-tumorceller. Tumorer fra xenotransplantater blev isoleret og forarbejdet til enkeltcelle-suspensioner, der blev sorteres derefter på grundlag af den triple-markør profil CD44 + /CD24 + /ESA + til opnåelse CSCS og separat ikke-CSCS (figur 1A). Kvantitativ RT-PCR-analyse af RNA opnået fra CSCS og ikke-CSCS til ekspression af bestanddele af Notch-signalvejen blev udført. Resultaterne tyder opregulering af Notch pathway komponenter i CSCS over denne ikke-CSCS (figur 1B). CSCS i 6 af 8 tumorer udtrykkes mindst et Notch-receptoren på et niveau 1,5 gange i forhold til ikke-CSC. Tilsvarende blev mindst én Notch ligand opreguleret 1,5 gange i CSC i forhold til ikke-CSC i 6 af 8 tumorer. Notatet vi ikke påvise ekspression af enten Notch4 receptor DLL3 ligand i enten CSC eller ikke-CSC-rum i en hvilken som helst af de primære xenotransplantater testet (data ikke vist). Der var en gennemsnitlig 1,75 gange større ekspression af Notch pathway målgenet Hes1 i CSCS sammenlignet med ikke-CSCS. Disse resultater antyder, at CSCS differentielt udtrykker forøgede niveauer af Notch pathway komponenter, og at pathway tilsvarende aktiveres som vist ved forøget ekspression af Hes1.

A. Flowcytometrianalyse. Dissocierede lav passage human bugspytkirtelkræft xenograft celler blev farvet med DAPI og antistoffer til H2K, ESA, CD44 og CD24. DAPI-positive døde celler og H2K positive museceller blev begge slået fra analysen. CSC befolkning (med overflade markør ESA

+ /CD44

+ /CD24

+) blev gated af både P5 og P7, og den ikke-CSC befolkning fra P6. B. Udskrift niveauer af Notch pathway komponenter i CSC i forhold til i ikke-CSC opnås ved qPCR, normaliseret til GAPDH. Den gennemsnitlige fold skift mellem tumorer er repræsenteret af en vandret stang.

Notch vej hæmning

Baseret på den iagttagelse, at Notch signalvej komponenter er opreguleret i bugspytkirtelkræft og især pancreas CSC , vi yderligere studeret bidrag Notch pathway aktivering til pancreas CSC-funktion. Y-sekretase katalyserer tredje spaltningstrin af Notch-receptoren som frigiver Notch intracellulære domæne. Dette trin tillader Notch receptoren til derefter translokerer til kernen og aktivere Notch signalering, hvilket resulterer i opregulering af målgenekspression. Inhibering af y-sekretase med en y-sekretase hæmmer kan således blokere aktivering af Notch-signalvejen. Inkubation af pancreascancer tumorspheres med stigende doser af GSI reducerede ekspressionsniveauer af indhakket målgenet Hes1 på en dosisafhængig måde (figur 2A, B) (p .001 versus kontrol). Efter at have bekræftet, at GSI kan hæmme Notch signalering i bugspytkirtelkræftceller, vi næste evalueret effekten af ​​Notch vej hæmning specifikt på CSC rum. Kræft i bugspytkirtlen celler behandlet med GSI viste en signifikant reduktion i CSCS med ESA

+ /CD44

+ /CD24

+ markør profil i forhold til ubehandlede celler (2,76 ± 0,16% kontrol vs. 1,43 ± 0,15% med GSI p = 0,013) (figur 2C, D). Dette resultat tyder på en rolle for Notch-aktivering i CSC vedligeholdelse.

A. Primære pankreatiske cancercellelinier tumorspheres (afledt fra patient 5) blev dyrket i sfære medium indeholdende forskellige koncentrationer af GSI som angivet i 48 timer før Western blot analyse med et antistof mod Hes1 eller β-actin. B. Kvantificering af Hes1 mRNA-niveauer efter GSI behandling i 48 timer (* P lt; .001 versus kontrol). C. bugspytkirtelkræftceller i sfære medium blev behandlet med kontrol køretøj (DMSO) eller 8 uM GSI i 48 timer. FACS-analyse af kontrol- DMSO behandlede celler (

øverste panel

) og GSI behandlede celler (

nederste panel

). CSC befolkning med overflade markør for ESA

+ /CD44

+ /CD24

+ blev identificeret af de celler i både portene P5 og P7. D. Kvantificering af ESA

+ /CD44

+ /CD24

+ CSC befolkning efter DMSO og GSI behandling (* p = 0,013 vs. DMSO).

En af de definere funktioner i CSCS er selv-fornyelse, som kan analyseres in vitro ved at måle tumorsphere dannelse gennem flere passager. Pancreas CSCS identificeret med markøren profil ESA

+ /CD44

+ /CD24

+ har evnen til at danne sfærer i ikke-klæbende forhold, som adskiller dem fra ikke-cancer stamceller, som mangler denne evne [10]. Under observeret dosisafhængig inhibering af Notch-vejen med stigende doser af GSI og en resulterende reduktion i procentdelen af ​​pancreas CSC, vi vurderet den funktionelle indvirkning på CSC funktion ved at teste virkningerne af GSI i tumorsphere assays. I overensstemmelse med en dosisafhængig effekt på Notch vej hæmning, behandling af kræft i bugspytkirtlen celler med GSI forårsagede en dosisafhængig reduktion i primær tumorsphere dannelse frekvens (figur 3A, s 0,01 vs. kontrol)

A.. Pankreatisk cancercellelinie tumorspheres dyrket i 5 dage i sfære medium indeholdende angivne koncentrationer af GSI. Repræsentative billeder af primære tumorspheres som udviklede sig fra 1000 celler per brønd dyrket med stigende koncentrationer af GSI. Kvantificering af antallet af primære tumorspheres (sorte søjler) dannet ved hver koncentration med 1000 celler podet per brønd (* p 0,01 versus kontrol). Sekundær tumorsphere formation (grå søjler) fra tumorspheres behandlet med GSI blev dissocieret til enkelte celler, vasket og dyrket i 5 dage i normal sfære medium uden GSI (** p .01 vs. kontrol). B. Tumorspheres behandlet med GSI ved stigende koncentrationer farvet med propidiumiodid (PI) og FITC-Annexin V (ANV) og analyseret ved flowcytometri at vurdere omfanget af apoptose (* p. .05 8 uM over for kontrol, ** p 0,01 16 uM vs. kontrol). C. Cellecyklusanalyse af pancreas tumorspheres behandlet med DMSO kontrol eller GSI ved 0, 24, 48 og 72 timer. (* P 0,01 versus kontrol). D. bugspytkirtelkræftceller dyrket med enten 8 uM GSI eller køretøj kontrol (DMSO) i 48 timer injiceret subkutant i NOD /SCID-mus. Repræsentative billeder af mus implanteret med celler fra de angivne behandlingsgrupper taget 21 dage efter injektion. Pile angiver placeringen af ​​tumorerne. Serial tumorstørrelser målinger fra mus behandlet med DMSO kontrol eller GSI på angivne tidspunkter. N = 5 (* p 0,01 versus kontrol).

For at bestemme, om den observerede hæmning af tumorsphere dannelse blev bevaret efter kortvarig udsættelse for Notch hæmning, blev behandlet tumorspheres dissocieret til enkelte celler og re -cultured i normal sfære medier uden GSI. Navnlig blev virkningen på tumorsphere dannelse bevaret selv efter fjernelse af y-sekretase hæmmer, som det fremgår af nedsat produktion af sekundære tumorspheres (figur 3A, p .01 over for kontrol).

En virkning af GSI på apoptose kunne forklare denne reduktion i tumorsphere formation. Faktisk vi observeret en øget hyppighed af apoptose baseret på PI og AnnexinV farvning af celler fra i tumorspheres behandlet med GSI sammenlignet med vehikelbehandlede tumorspheres (figur 3B, s 0,05 8 uM vs. kontrol p 0,01 16 uM vs. kontrol). Dette resultat antyder, at apoptose bidrager til faldet tumorsphere dannende evne af cellerne behandlet med GSI. Vi udførte også cellecyklusanalyse i fravær og nærvær af GSI som afslørede forøget akkumulering af celler i G1 med GSI sammenlignet med kontrol (p 0,01). Nedsat cellecyklusprogression kan derfor også bidrage til reduktion i tumorsphere formation med inhibering af Notch-signalvejen med GSI (figur 3C).

For yderligere at validere denne observerede funktionelle virkningen af ​​in vitro-Notch pathway inhibering, studerede vi hvorvidt forbehandling med GSI kunne inhibere tumordannelse in vivo. I dette assay vi pre-behandlede bugspytkirtelkræftceller etableret som tumorspheres med GSI i 48 timer og derefter implanteret levedygtige behandlede celler subkutant i NOD /SCID-mus (5 mus pr gruppe). Celler, der var ubehandlede dannede tumorer 5 dage tidligere end de forbehandlet med GSI og voksede signifikant større (p .01) end dem, der udgår fra celler forbehandlet med GSI (figur 3D)

Notch pathway inhibering ved hjælp Hes1. shRNA

Som observeret i figur 1B, mRNA-niveauet af Hes1, et direkte mål /effektor af Notch-signalering, blev opreguleret i CSCS sammenlignet med ikke-CSCS i flere primære xenotransplantater. Opregulering af Hes1 konsekvent observeret på tværs af xenotransplantater, i modsætning til andre Notch mål som Hey1 og HEYL (data ikke vist). For at vurdere, om de observerede virkninger af GSI var specifikt resultat af at hæmme Notch signalvejen og ikke off-target effekter, vi brugte lentivirale konstruktioner udtrykker kontrol og Hes1 shRNA til specifikt at målrette Hes1. Knockdown af Hes1 af shRNA blev bekræftet på både mRNA (p .001 vs. kontrol) og protein niveauer (Figur 4A, B) og påvirkede ikke opstrøms Notch1 spaltning (figur 4B). Nedregulering af Hes1 resulterede i nedsat tumorsphere dannelse (figur 4C, D, s 0,001 versus kontrol). Giver yderligere beviser for, at Notch-aktivering bidrager til pancreas CSC-funktion

A. Bugspytkirtelkræftceller transduceret med enten kontrol eller Hes1 shRNA høstet efter dyrkning i 4 dage. Hes1 transkriptniveauer kvantificeret ved QRT-PCR, normaliseret til GAPDH (* p 0,001 vs. kontrol). B. Cellelysater blev Western blottet for Hes1, Notch1, spaltet Notch1 eller β-actin.