PLoS ONE: Kræft i æggestokkene cellelinje Panel (OCCP): Klinisk Betydningen af ​​In Vitro Morfologisk Subtypes

Abstrakte

epitelovariecancer er en meget heterogen sygdom og er fortsat det mest dødbringende gynækologisk malignitet i den vestlige verden. Terapeutiske tilgange nødt til at tage højde for inter-patient og intra-tumor-heterogenitet og detaljeret karakterisering af

in vitro

modeller, der repræsenterer de forskellige histologiske og molekylære ovariecancer undertyper er afgørende for at gøre det muligt for pålidelig præklinisk afprøvning. Der er cirka 100 offentligt tilgængelige æggestokkene kræftceller, men deres cellulære og molekylære egenskaber er stort set ubeskrevet. Vi har karakteriseret 39 æggestokkene kræft cellelinjer under ensartede betingelser for vækst karakteristika, mRNA /microRNA udtryk, exon sekventering, narkotika respons for klinisk-relevante lægemidler og indsamlet alle tilgængelige oplysninger om de oprindelige kliniske funktioner og oprindelsesstedet. Vi testede til statistiske associationer mellem de cellulære og molekylære funktioner i de linjer og kliniske funktioner. Af de 39 ovarian cancer cellelinjer, blev 14 tildelt som high-grade serøs, fire serøs-typen, en lav kvalitet serøs og 20 ikke-serøs type. Tre morfologiske undertyper: Epiteliale (n = 21), Round (n = 7) og spindel (n = 12) blev identificeret, der viste tydelige biologiske og molekylære karakteristika, herunder overekspression af celle bevægelse og migration-associerede gener i Spindel undertype. Sammenligning med de oprindelige kliniske data viste sammenslutning af de spindel-lignende tumorer med metastaser, fremskredent stadium, suboptimal debulking og dårlig prognose. Desuden udtrykket profiler af Spindel, runde og Epitheliale morfologier grupperet med den tidligere beskrevne C1-stromal, C5-mesenkymale og C4 ovarie undertype ekspressionsprofiler hhv. Omfattende profilering af 39 æggestokkene kræft cellelinjer under kontrollerede, ensartede betingelser viser klinisk relevante cellulære og genomiske egenskaber. Disse data giver et rationelt grundlag for valg af modeller til at udvikle specifikke behandlingsmetoder til histologiske og molekylære undertyper af kræft i æggestokkene

Henvisning:. Beaufort CM, Helmijr JCA, Piskorz AM, Hoogstraat M, Ruigrok-Ritstier K, Besselink N et al. (2014) Kræft i æggestokkene cellelinje Panel (OCCP): Klinisk Betydningen af ​​

In vitro

Morfologiske undertyper. PLoS ONE 9 (9): e103988. doi: 10,1371 /journal.pone.0103988

Redaktør: Richard Pearson, Peter MacCallum Cancer Centre, Australien

Modtaget: November 15, 2013; Accepteret: 5 juli 2014; Udgivet: 17 September, 2014

Copyright: © 2014 Beaufort et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne forskning blev delvist understøttet af center for Personlig Kræftbehandling (et samarbejde mellem UMC Utrecht, Erasmus MC Rotterdam og Holland Cancer Institute Amsterdam), den KWF-Alpe (UU 2011-4977) og den Europæiske Organisation for forskning og behandling af kræft (tilskud nr. EORTC STrF 2008-03, JH). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

epitelovariecancer er den mest dødbringende gynækologisk malignitet i den vestlige verden og fremskreden sygdom er stadig uhelbredelig for de fleste patienter. Trods afprøvning af forskellige behandlingsstrategier og nye cytotoksiske midler, optimal primær terapi og overlevelseschancerne ikke har ændret sig væsentligt siden indførelsen af ​​platin og taxan behandling [1] – [3].

De seneste indsigter har indikeret, at kræft i æggestokkene er en samlebetegnelse for invasive bækken kræftformer, der er afledt af forskellige væv med forskellige histologiske og epidemiologiske funktioner. De fem store histiotypes har vist sig at have specifikke genetiske profiler og bør behandles som særskilte sygdomme. High-grade serøs (HGS) karcinom udgør 80% af ovariecancer og er defineret ved

TP53

mutation (96%), homologe rekombination DNA-reparation defekter (-50%),

CCNE1

forstærkning og genomisk ustabilitet [4] – [6]. Derimod lav kvalitet serøse carcinomer er

TP53

vildtype og viser ofte aktivere RAS pathway mutationer [7], [8]. De resterende histiotypes er mucinous, endometrioide og clear cell [3]. Aktivering RAS pathway mutationer findes i ~ 40% af de mucinøse tumorer mens endometrioide og klar celle tumorer har

PIK3CA

(PI3Kinase komponent, 12%, 31% henholdsvis), og

ARID1A

mutationer ( 30%, 46%, henholdsvis) [4], [5], [9], [10].

Desuden har store undersøgelser identificerede flere molekylære undertyper af HGS baseret på gen og microRNA udtryk [4] , [11]. Disse undertyper tyder foreninger med specifikke biologiske processer (såsom reaktiv stroma, mesenchymal, immunreaktive og proliferation) og dårlig prognose, for eksempel i C1 stromale-subtype identificeret ved Tothill et al. [4], [11]. Yderligere udforske de kliniske karakteristika for disse biologiske forskellige undertyper og identificere en optimal behandling kunne identificere nye terapeutiske strategier.

Det er bydende nødvendigt, at eksperimentelt medgørlige in vitro-modeller, såsom cellelinjer, præcist repræsenterer forskellige histologiske og molekylære undertyper for at afprøve nye undertype-specifikke behandlingsstrategier. På verdensplan er der omkring 100 ovariecancer cellelinjer genereret som beskrevet i litteraturen [12] – [17] og omkring 70 af disse er tilgængelige på ATCC, ECACC, Riken, DSMZ, JCRB eller Cancer Research Technology. Siden 1990 er et gennemsnit på ca. 100 papers /år offentliggjort, at stole på æggestokkene kræft cellelinjer som model. En væsentlig begrænsning for disse undersøgelser er, at for de fleste af ovarian cellelinjer deres oprindelse er dårligt defineret og som følge af utilstrækkelig karakterisering det ikke vides distinkte histologisk eller molekylær subtype er repræsenteret.

Vi her beskriver en omfattende og ensartet karakterisering af en samling af 39 ovarian cancer cellelinjer almindeligvis anvendes til

in vitro

studier. Vi identificerede histologisk samt morfologiske undertyper, der associerer med kliniske patologiske karakteristika ovariecarcinomer samt prognose. Endvidere er de morfologiske undertyper forbinder med de molekylære undertyper identificeret af Tothill et al. [11]. Sammenfattende kan disse resultater tjene som en guide til at vælge passende cellelinier, der repræsenterer forskellige histologiske og molekylære undertype af kræft i æggestokkene for

in vitro

terapeutiske undersøgelser.

Materialer og metoder

cellelinjer og dyrkning

Cellelinjer undersøgt blev CaOV3, CAOV4, ES-2, OV-90, OVCAR3, TOV-112D, TOV-21G, UWB1.289, UWB1.289 + BRCA1 (købt fra ATCC ), 59m, A2780, A2780CIS, A2780ADR, ‘COLO720E’, COV318, COV362, COV362.4, COV413A, COV413B, COV504, COV644, OAW28, OAW42, OV56, OV7, OV17R, PEA1, PEA2, PEO1, PEO4, PEO14, PEO16, PEO23, SKOV3 (købt fra den europæiske samling af cellekulturer, ECACC via Sigma), 2774, A2780, HOC7, SKOV3, SKOV6 (høflighed af Gunter Daxenbichler, Institut for Obstetrik og Gynækologi, University of Innsbruck, Østrig), IGROV1 (høflighed af Dr. Irene Hamelers, Institut for Biomembranes, Utrecht Universitet, Holland). Tabel S1 opsummerer den oprindelige kilde til de cellelinjer. Cellelinierne A2780 og SKOV3 blev begge opnået fra en akademisk laboratorie- og også indkøbt fra ECACC, og er beskrevet her som “A2780 ECACC” og “SKOV3 ECACC«. Tredive-ni af de 40 cellelinier blev dyrket som monolag, bortset fra den semi-adhærerende cellelinje ‘COLO720E’ for hvilke flydende og vedhæftede celler blev passeret. Vedhæftede celler blev fuldt opdelt efter trypsinisering mellem passager. Cellelinjerne blev opretholdt ved 37 ° C i en inkubator med befugtet luft med 5% CO2.

Alle cellelinier blev oprindeligt dyrket under anvendelse af mediet og kosttilskud som anbefalet af leverandørerne. I modsætning til andre undersøgelser, dyrkede vi alle cellelinier under de samme dyrkningsbetingelser for at undgå bias på grund af varierende koncentrationer af kosttilskud inden for forskellige medier (fx vækstfaktorer) eller forskellige procentdele af serum. Alle cellelinier blev dyrket i RPMI-1640 glutamax, Gibco /Invitrogen suppleret med 10% FCS (Lonza, kilde: Brasiliansk, Lot nr 1SB002), 100 U /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin, 50 ug /ml gentamycin. Alle eksperimenter og nukleinsyre-isolationer blev udført efter dyrkning af cellelinier i mindst en måned under disse standardbetingelser.

UWB1.289 er en BRCA1-nul cellelinie fra kvinde med en kimlinie

BRCA1

2594delC mutation. UWB1.289 + BRCA1 er stabilt transficeret med en pcDNA3 plasmid indeholdende et

BRCA1

indsætte og blev opretholdt med 200 ug /ml Geneticin (G418) for at opretholde selektion for transficerede celler. A2780ADR og A2780CIS blev provokeret gang om måneden med 100 nM doxorubicin og 1 uM Cisplatin henholdsvis.

Kort tandemgentagelse-analyse

anvendtes The PowerPlex 16 System (Promega) ifølge fabrikantens protokol under anvendelse af en ABI PRISM 3100 for at generere en STR (Short tandemgentagelse) fingeraftryk af hver cellelinie for at bestemme unikke identitet og /eller mangel på forurening co-kultur. Desuden blev STR profil kontrolleres før og under dyrkning af cellerne for at sikre, at krydskontaminering eller fejlagtig substitution ikke forekommer.

vækstkurver og lægemiddelfølsomhed assay

MTT kolorimetrisk assay , som måler metabolisk aktivitet af levedygtige celler, blev anvendt til dannelse vækstkurver og bestemme kemosensitivitet af cellelinierne.

først blev vækstkurver genereret i to eksemplarer at bestemme den optimale antal celler til brug for lægemidlet følsomhed assay. Dette blev gjort for at undgå væksthæmning som følge af podning ikke nok celler eller udtømning af mediet efter podning for mange celler. Det højeste antal celler viser fortsat eksponentiel vækst efter fem dage blev udvalgt til de lægemiddelrespons MTT assays (tabel S1, File S1).

Respons kurver blev genereret for carboplatin, Cisplatin, oxaliplatin, Doxorubicin og 5-fluorouracil (intravenøse opløsninger, Pharmachemie, Holland), Paclitaxel (intravenøs opløsning, Ebewe Pharma, Østrig), Docetaxel (opløst i DMSO, Sigma), og Gemcitabin (til intravenøs brug, opløst i PBS, Sun Pharmaceutical Industries Europe BV, Holland) . Cellelevedygtighed blev vurderet i fire eksemplarer ved anvendelse af MTT-assayet efter en fem dages eksponering til 18 koncentrationer af forbindelsen. Phoenix WinNonLin 1.1 software (Pharsight) blev anvendt til at passe en dosis respons kurve og til at beregne 50% vækst hæmning værdier (GI50) med fejl og 95% konfidensintervaller (se også File S1).

DNA og total RNA-isolering

NucleoSpin kittet (Machery-Nagel) blev anvendt ifølge producentens protokol til isolering af DNA fra celler, der er høstet med trypsin og vasket med PBS.

til isolering af total RNA (herunder microRNA’er), blev eksponentielt voksende celler direkte lyseret i dyrkningskolber med RNA-Bee at undgå ændringer i udtryk som følge af høst eller vask. Totalt RNA blev isoleret fra lysater som beskrevet tidligere [18]. Tre uafhængige isolater af RNA fra hver linie blev samlet til mRNA og microRNA ekspressionsanalyse at mindske mulig bias fra vildskudspunkter værdier.

microRNA og genekspression analyse

For microRNA ekspressionsanalyse, TaqMan Array Menneskelig MicroRNA En strømningsteknisk kort v2.0 (Applied Biosystems) indeholdende QRT-PCR-assays til kvantificering 381 unikke microRNAer blev anvendt ifølge producentens protokol. Udtrykket data blev normaliseret ved hjælp medianen Ct af alle målte microRNA’er som beskrevet af Vandesompele et al. [19] (se også File S1). De normaliserede udtryk data for alle 384 microRNA’er er givet i tabel S2.

Genekspression blev målt ved anvendelse af GeneChip Humant Exon 1.0 ST Array (Affymetrix) ifølge producentens protokol (se også File S1). Den erhvervede udtryk data var forbehandlet ved hjælp af den Robust Multichip Analysis (RMA) algoritme i Affymetrix Expression Console-softwaren, der udfører korrektion baggrund, normalisering og sonde sæt sammendrag pr udskrift resulterer i et udtryk værdi pr gen. Genekspression data er blevet deponeret i Gene Expression Omnibus (GSE53418)

snapshot mutationsanalyse

snapshot analyse blev udført som tidligere beskrevet [20] – [22]. Under anvendelse af et Applied Biosystems snapshot multiplex Kit. De nukleotid og tilsvarende aminosyreændringer evaluerede var for PIK3CA, BRAF, HRAS, nationale tilsynsmyndigheder og KRAS er opført i tillægget metoder (

File S1

).

Mutation og forstærkning analyser med solid exon sekventering

Behandling af prøver til sekventering på SOLiD5500 sekventering platform (Life Technologies) blev udført på en SciClone NGS væske håndtering robot (Perkin Elmer), baseret på protokollen for manuel bibliotek forberedelse [23]. Sure-Select berigelse for gener af interesse blev udført i en multiplekset måde på op til 16 prøver pr reaktion (baseret på Nijman et al. [24]) under anvendelse af et designet berigelse kit.

Data blev kortlagt til den henvisning genom (GRCh37 /hg19) ved hjælp af BWA og SNP og Indel kald blev gjort ved hjælp af en brugerdefineret analyse rørledning. Baseret på den COSMIC database [9] og gennemgangen af ​​Berns et al. [5], blev 53 gener, der ofte muterede eller forstærkede i kræft i æggestokkene udvalgt til analyser (se tillæg metoder i File S1 til listen over gener).

Til analysen af ​​genamplifikation, robuste Z-scores blev beregnet pr exon som beskrevet af Iglewicz og Hoaglin [25]. Et gen forstærkes med en Z-score større end 2 og meget forstærket, hvis der er større end 3.

de faste Exon sekventering er blevet deponeret i den europæiske Nucleotide Archive (PRJEB5114).

Mutation analyse ved Tagged-amplikon dyb sekventering (Tam-Seq)

de kodende sekvenser af TP53, BRCA1, BRCA2, PTEN, PIK3CA, EGFR og APC-gener blev amplificeret og sekventeret under anvendelse af Tam-Seq fremgangsmåde og den Fluidigm Access Array 48.48 (Fluidigm CA, USA) i overensstemmelse med producentens protokol som beskrevet tidligere [26]. Sekvensanalyse og variant kontrol blev udført som tidligere beskrevet [26], [27]. Primersekvenserne er tilgængelige efter anmodning. Tam-Seq data er blevet deponeret i den europæiske Nucleotide Archive (PRJEB5183).

mikrosatelitter ustabilitet

mikrosatelitter ustabilitet blev bestemt under anvendelse MSI Analysis System Version 1.2 (Promega) ifølge fabrikantens protokol og som udføres rutinemæssigt elektroforese ved hjælp af en ABI PRISM 3100. MSI fastlægges på fem mononukleotidbyggeblokken gentagne markører (BAT-25, BAT-26, NR-21, NR-24 og MONO-27).

FACS analyser

cellerne blev høstet og farvet med korrekt titrerede fluorokromkonjugerede monoklonale antistoffer (som beskrevet før [28]). Kort fortalt blev celler farvet med antistoffer mod luminal cytokeratin s (CK) konjugeret til PE (blanding af cytokeratin 8, 18 -clone C11- og cytokeratin 19 -clone A53-B /A2-, Veridex LCC, Raritan, NJ), CD24- FITC (klon SN3, eBiosciences, San Diego, CA), CD44-PeCy7 (klon IM7, eBiosciences) og EpCAM-FITC (klon EBA-1, BD Biosciences, San Jose). CK farvning blev forudgået af en fiksering og permeabilisering trin ved hjælp FIX PERM reagenser (An Grub Bio Research GmbH, Østrig). Proteinekspression blev målt på en FACSCanto flowcytometer (BD Biosciences). Signal-støj-forhold (S /N) blev beregnet (dvs. geometrisk gennemsnitlig fluorescensintensitet (MFI) på den farvede befolkning divideret med MFI af ufarvet befolkningen) for at korrigere for auto-fluorescens.

Statistik og visualisering

statistiske analyser blev udført på de 33 cellelinjer, der blev genereret fra enestående ovariecancer patientmateriale. Dubletter (SKOV3 og A2780),

in vitro

derivater (A2780ADR, A2780CIS, COV362.4 og UWB1.289 + BRCA1) og muligvis forurenede cellelinje ‘COLO720E “blev udeladt af disse analyser. Statistiske analyser blev udført ved hjælp af parametriske metoder i STATA statistisk pakke, frigive 12,0 (STATA Corp., College Station, TX). P-værdier var tosidede og P 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

BRB array-værktøjer (v4.3.1) blev anvendt til at vælge gener og microRNA differentielt udtrykte mellem de tre morfologiske undertyper.. Først microRNA med 80% manglende værdier blev filtreret fra. Så manglende værdier, der ikke blev markeret på grund af lav kvalitet blev erstattet med den minimale værdi over alle microRNA og prøver efterfulgt af 2log normalisering. Inden BRB blev de 50% mest variable microRNA og mRNA’er udvalgt og klassen sammenligning algoritme blev anvendt til at beregne den permutation p-værdi efter 10.000 permutationer. P 0,05 blev betragtet som signifikant. Hierarkisk klyngedannelse blev udført på median centreret mRNA og microRNA udtryk data ved hjælp af Eisen Gene klynge 3.0. For GSE9891 datasæt flere sonder pr gen blev midlet, som mest ligner den fremgangsmåde, som de exon arrays (dvs. sonden sæt sammendrag i Affymetrix Expression Console-softwaren). Dernæst cellelinjen genekspression data og GSE9891 data (bortset LMP prøver) var median centreret separat for at korrigere for forskelle mellem de anvendte platforme og efterfølgende kombineres før den hierarkiske klyngedannelse. Identifikation af biologiske funktion af morfologi gener blev udført ved hjælp af IPA (v16542223, Opfindsomt Systems).

Resultater

Figur 1 giver en oversigt over den eksperimentelle plan, herunder dyrkning af alle cellelinjer med det samme dyrkningsbetingelser for at undgå skævheder som følge af varierende koncentrationer af kosttilskud indenfor forskellige medier (f.eks vækstfaktorer) eller serum.

STR kort tandem repeat, MSI mikrosatellit ustabilitet, PFS progressionsfri overlevelse

.

Kort tandem repeat (STR) analyse

Det målte antallet af gentagelser for hver af de 16 STR loci samt henvisning STR-profiler fra offentlige databanker og litteratur er givet i tabel S3.

overensstemmelse mellem toppene af reference- profiler og de profiler, der genereres i denne undersøgelse var 100% for 22 cellelinjer, 90-99% for ti cellelinjer og 79-89% for fire cellelinjer. I tre cellelinier, er der ingen referencer til rådighed (Tabel S3).

Én cellelinie, ‘COLO720E’, viste kun 4% af overensstemmelse med de STR profiler offentliggjort af Korch et al. [29]. COLO720E er blevet beskrevet at være blanding af COLO684 og COLO685 cellelinier, som begge er afledt af uterine adenocarcinom [30]. ‘COLO720E’ havde to TP53 mutationer beskrevet (c.1118del1, c.C413T), støtter muligheden for to cellepopulationer. Imidlertid blev disse to TP53 mutationer nylig rapporteret af Anglesio et al. selv om deres COLO720E cellelinje svarede til offentligt tilgængelige STR reference [31]. Da ‘COLO720E’ er for nylig blevet trukket tilbage fra ECACC cellelinje repository, vi udelukket det fra yderligere data analyser.

Origin

De foreliggende oplysninger litteratur om oprindelsen af ​​de 39 cellelinjer er opsummeret i figur 2 (yderligere data i tabel S1) [32] – [53]. Tredive-tre cellelinjer blev genereret fra enestående patient materiale, ikke inklusive dublerede kilder (SKOV3, A2780), in vitro-derivater (A2780ADR, A2780CIS, COV362.4, UWB1.289 + BRCA1) og muligvis forurenede cellelinje ‘COLO720E’ . Histologi blev beskrevet for 30/33 cellelinjer og viste en lignende frekvens fordeling i forhold til ovariecarcinomer med de fleste er serøs (21/33) (Figur 2)

Morfologi

:. E Epithelial , R runde, S Spindel,

Histologi Formodede Histologi

: S serøs, HGS høj kvalitet serøs, LGS lav kvalitet serøs, E endometrioide, C klar celle, Mx blandet, M mucinøs.

Origin

: En ascites, T tumorvæv, TM væv fra metastaser, TO æggestokkene tumorvæv, P pleural effusion.

Tid

: P primær sygdom, R recidiverende sygdom, CR på klinisk resistens.

Platinum behandlet

: U ubehandlet, P platinbaseret behandling, O anden kemoterapi, R strålebehandling.

Protein markører

: lyse rødt ingen udtryk (signal til-støj-forholdet 5), let rød lav ekspression (signal til-støj-forholdet 5-20), lysegrøn udtryk (signal til-støj forholdet 20-200), lys grøn høj ekspression (signal til-støj-forholdet 200), grå ikke bestemt.

Terapi svar

: grøn til rød skala følsom over for resistente.

Fordobling tid

: grøn mindre end én dag, gule 1-2days, orange 2 dage.

MSI

mikrosatellit ustabilitet.

Genmutationer

: mørkeblå identificeret ved mindst to metoder, lyseblå identificeres ved en metode, lys rød identificeret med én metode, men ikke med anden metode.

Gene forstærkning

: Orange forstærkes (2-3x SD over medianen), rød stærkt forstærket ( 3x SD over medianen). Den WNT /bCatenin vejen (WNT /bCAT) og homolog rekombination reparation (HRR) søjler viser antallet af muterede gener i disse veje.

Oprindelsen (ascites, tumorvæv eller pleural effusion), tid (primær sygdom, tilbagefald, ved klinisk resistens), og om patienten havde modtaget platinbaseret kemoterapi før kultur blev kendt i 32, 21 og 25 cellelinier hhv. De væv-stammer cellelinjer var for det meste fra platin-naive patienter (7/8, 88%) og den primære sygdom (6/7, 86%), mens ascites-stammede cellelinjer var oftere platin-behandlet (9/15, 60%) og dyrket efter tilbagefald eller klinisk resistens (10/12, 83%)

mikrosatelitter ustabilitet

mikrosatelitter ustabilitet for alle fem markører studerede blev observeret for:. 2774, begge SKOV3 kilder, IGROV1, TOV21G og “COLO720E« (figur 2). A2780ADR og A2780CIS viste ustabilitet for fire af de fem markører (NR-21, BAT26, NR-24, MONO-27) og var bi-allel for femte markør BAT25. I modsætning hertil den parentale A2780 ECACC cellelinie (også fra den europæiske cellekultur samling ECACC) viste kun mikrosatellit ustabilitet for en markør (NR-21) og var også bi-allele for BAT25. Den anden A2780 kilde fra en akademisk laboratorium viste ingen mikrosatellit instabilitet (kun en lille forskydning for NR-21), men var også bi-allel for BAT25. Dette indikerer, at forskellige kulturer i samme cellelinje kan udvikle eller vælge genetiske forskelle, som vi beskrev tidligere for forskellige A2780 cellelinier [54].

Selvom tallene er meget små, viste signifikant mindre de fire MSI cellelinier overensstemmelse mellem deres STR profil til referencen STR-profil (Mann-Whitney U test, p 0,0013) og flere mutationer end de 29 ikke-MSI cellelinjer (median 13 versus 2 mutationer pr cellelinie, Mann-Whitney U test p 0,001 ).

morfologiske undertyper

Tre morfologiske fænotyper blev skelnes baseret på to uafhængige observationer af morfologiske og vækst karakteristika ved dyrkning fra low-density op til 70/80% sammenløb, dvs. celle form, celle størrelse og vækstmønster under dyrkning samt proliferationshastighed. Figur S1 viser repræsentative billeder af seks eksempler på hver af de tre morfologiske undertyper at illustrere forskellene i celle form, størrelse og vækstmønster mellem de morfologiske undertyper. Den “Epiteliale ‘morfologiske undertype var præget af flade epitel-lignende celler, der voksede i ark af regelmæssige eller uregelmæssige klynger (n = 21). I “Round« subtype (n = 7), cellestørrelse var mindre med en rund form og høj proliferativ hastighed. Celler voksede separat eller som uregelmæssige klynger, klæbet løst til vævskulturskåle og ofte voksede oven på hinanden. Celler med den “Spindel” undertype (n = 12), blev strakt og spindel formet og voksede som separate celler eller uregelmæssige klynger.

Der var en sammenhæng mellem morfologi og oprindelsen af ​​de 33 unikke cellelinjer, 74 % af epitelcellelinier stammede fra ascites (14/19), alle fire runde cellelinjer var kultur fra væv, mens Spindel cellelinjer stammer ligeledes fra ascites, væv eller pleural effusion (alle 3/9, 33%) (Fishers eksakte p = 0,002). Selvom det ikke er signifikant, epitelcellelinier var oftere af serøs oprindelse (83%) sammenlignet med Round (33%) og spindel (56%) cellelinjer (Fishers eksakte, p = 0,095).

Interessant morfologiske undertype var signifikant forbundet med tidligere platinbaseret kemoterapi (10/14 Epithelial havde tidligere fået platinbaseret behandling versus 4/4 Rund og 7/7 Spindel ubehandlede linjer; Fishers eksakte test, p 0,002).

Protein markører

udtryk for CD44, CD24, EpCAM og luminale cytokeratin s er givet i figur 2.

stamcelle markør CD44 blev udtrykt i 31/33 af cellelinjer og var forbundet med morfologi (Kruskal-Wallis p = 0,0037). Interessant nok viste 6/9 Spindel cellelinier høj CD44-ekspression kombineres med fraværende CD24-ekspression, som er blevet foreslået som en egenskab ved stamceller cellepopulationer. Derimod CD44

høj /CD24

-. Udtryk blev ikke observeret i de fire Runde cellelinjer og på kun 6/20 Epiteliale cellelinjer

Den epitel markører EpCAM og luminale Cytokeratin s blev udtrykt i fleste epitelcellelinier (19/20 og 18/20 henholdsvis), men kun i en runde cellelinie (1/4). Alle Spindel cellelinjer viste fraværende eller meget lav udtryk for EpCAM men 5/9 gjorde udtrykkelig luminale Cytokeratin s. EpCAM og luminale Cytokeratin udtryk var forbundet med morfologi (Kruskal-Wallis, s 0,001 og p 0,024 henholdsvis). Samt serøs versus ikke-serøs histologi (Mann-Whitney, p = 0,004 og p = 0,108 henholdsvis)

Gene mutation og forstærkning

mutation status 53 gener blev bestemt med tre teknikker: snapshot, solid og /eller Tam-Seq exon sekventering. Diskordante data mellem disse tre teknikker blev kontrolleret manuelt med de rå sekvensdata. Tabel S4 viser alle mutation data, der er sammenfattet i figur 2. I alt har vi registreret 178 mutationer i 45 gener i alle 39 cellelinjer. Den hyppigst muterede gen var TP53, muteret i 27/33 cellelinjer, herunder 7/8 høj kvalitet serøs, 9/10 serøs og uventet i 3/3 lav kvalitet serøs.

Vi bestemmes forstærkning af CCNE1, MYC, TPX2 og ERBB2 ved at sammenligne sekventering dækning for hver exon midterplan samlede dækning [55]. Amplifikation blev observeret for CCNE1 (n = 5), MYC (n = 3), TPX2 (n = 3) og ERBB2 (n = 2) (figur 2, figur S2A-C). Når vi sammenlignet genomisk amplifikation af hvert gen med mRNA-ekspression blev MYC og TPX2 stærkt udtrykt i de fleste af de cellelinjer, herunder linjer, der viste amplifikation (data ikke vist). De cellelinjer, der viser

ERBB2

eller

CCNE1

forstærkning viste det højeste udtryk for disse gener. For

CCNE1

denne forening var signifikant (Mann-Whitney p 0,001, figur S2D).

Reaktion på kemoterapeutika

For alle stoffer, den koncentration, der forårsager 50% væksthæmning (GI50-værdier) viste et to log interval mellem følsomme og resistente cellelinier (figur 3). Især median GI50-værdier (nM) viste markante forskelle mellem lægemidler med de mest adskilte forbindelser, Docetaxel og Carboplatin, der har et 10000-fold forskel (figur 3).

De whiskers udvides til 1,5 gange højden af ​​boksen (dvs. 25

percentil til median og median til 75

percentil), eller, hvis der ikke er nogen værdi i dette område, til minimum eller maksimum værdier

.

kønscellelinie mutationer i

BRCA1

BRCA2

har været forbundet med respons på platin narkotika. Der var dog ingen klar sammenhæng mellem respons på platin og mutation status eller udtryk for

BRCA1

BRCA2

i vores eksperimenter (data ikke vist). Ca. 50% af de BRCA mutationer observerede var ikke kendt for at være klinisk relevant (tabel S4), og derfor måske ikke påvirke BRCA funktion. Men de to cellelinjer med kendte kim-line mutationer i BRCA1 (UWB1.289) og BRCA2 (PEO1) var relativt følsomme over for Cisplatin.

respons for alle stoffer viste en signifikant positiv korrelation med spredning sats af cellelinierne, dvs. fordoblingstiden (tabel 1).

tabel 1 viser sammenhængen mellem lægemiddelrespons og ekspressionen af ​​proteinmarkørerne CD44, CD24, EpCAM og Luminalt cytokeratin s. Interessant cellelinjer med en høj CD44-ekspression var mere følsom over for taxaner. Derimod cellelinier viser høj ekspression af luminale cytokeratin s var relativt resistente over for de tre platin testede medikamenter og doxorubicin. Høj ekspression af EpCAM blev også korreleret med relativ resistens over for cisplatin. Luminale cytokeratin og EpCAM er stærkt korreleret og fraværende udtryk af begge mærker var mest almindeligt ses i Round cellelinjer, der var generelt meget følsomme over for de fleste lægemidler. Hvis de fire Runde cellelinjer er udelukket, den eneste betydelige forening observerede var mellem Oxaliplatin respons og udtryk for luminale cytokeratin s, hvilket indikerer, at denne lille gruppe af cellelinjer primært er årsag andre foreninger.

Vi brugte næste Spearman rang korrelation at teste for korrelation mellem GI50 værdier og ekspressionen af ​​hvert mRNA eller microRNA for at identificere gener og microRNA forbundet med respons på behandlingen. Antallet af mRNA’er associeret med svar på de otte testede terapeutiske varierede fra 22-310 gener (p 0,001) og 1-10 microRNA (p 0,01). Figur 4 viser for hver mRNA og microRNA sammenhængen og betydning mellem sit udtryk og respons på cisplatin og paclitaxel.

X-akser Spearman korrelation, Y-akser -Log af p-værdi.

formodet histologiske undertyper

Vi udpegede cellelinjer som formodede HGS eller endometrioide /klare celle cellelinjer baseret på fire kriterier. Kriterier for den formodede HGS oprindelse var: 1) HGS oprindelse med TP53 mutation og ingen MSI, eller 2) serøs oprindelse med TP53 mutation og forstærkning af CCNE1, MYC eller TPX2. Kriterier for formodet endometrioide /klar celle oprindelse var:. 1) endometrioide og /eller klar celle oprindelse, eller 2) ARID1A mutation

Brug disse kriterier, vi udledte den formodede histologiske subtype for de 39 cellelinier som 20 ikke -serous (Figur 2, sidste kolonne gruppe 1 2). og 19 serøse cellelinjer, som omfattede 14 high-grade serøs og en lav kvalitet serøs streg (Figur 2, sidste kolonne gruppe 3-5)