PLoS ONE: Zink Finger 280b Regulerer sGCα1 og p53 i Prostata Cancer Cells

Abstrakt

Zink Finger (ZNF) 280b protein blev identificeret som en uventet mål for en shRNA designet til sGCα1. Yderligere analyse viste, at disse to proteiner er forbundet på en anden måde, med 280b opregulering af sGCα1 ekspression. Knock-down og overekspression viste, at 280b tjener pro-vækst og pro-overlevelse funktioner i prostatakræft. Overraskende men disse pro-cancer funktioner 280b ikke medieret af sGCα1, der selv har tilsvarende funktioner i prostatakræft, men ved nedreguleret p53. P53-proteinet er et andet mål for 280b i prostatacancer, men i modsætning sGCα1, p53 er nedreguleret ved 280b. 280b inducerer p53 nuklear eksport, hvilket fører til efterfølgende proteasomalaktivitet nedbrydning. Proteinet er ansvarlig for p53 regulering af 280b er Mdm2, E3 ubiquitin ligase, der fremmer p53 nedbrydning ved at inducere dets nukleare eksport. Vi viser her, at 280b opregulerer ekspressionen af ​​Mdm2 i prostata kræftceller, og denne forordning er via Mdm2 promotor. At påvise en

in vivo

relevans for denne interaktion, ekspressionsundersøgelser viser, at 280b proteinniveauer er opreguleret i prostatakræft og disse niveauer svarer til reducerede niveauer af p53. Ved at øge ekspressionen af ​​Mdm2, den karakteriseret 280b protein giver en ny mekanisme af p53 undertrykkelse i prostatakræft

Henvisning:. Gao S, Hsieh CL, Zhou J, Shemshedini L (2013) Zink Finger 280b Regulerer sGCα1 og p53 i prostata cancer celler. PLoS ONE 8 (11): e78766. doi: 10,1371 /journal.pone.0078766

Redaktør: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, Østrig

Modtaget: 14. august 2013; Accepteret: September 23, 2013; Udgivet: November 13, 2013 |

Copyright: © 2013 Gao et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Arbejdet blev støttet af National Institutes of Health (NIH) R01CA127873-01A1. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

p53 tumor suppressor har en central rolle i koordineringen cellulære reaktioner på forskellige belastninger (herunder DNA-skader, over-udtrykte onkogener og forskelligartede metaboliske begrænsninger) [1]. Som reaktion på cellulære stress-situationer, p53-ekspression induceres, og proteinet translokeres til kernen for at binde til DNA i en sekvensspecifik måde, derved aktivere eller undertrykke målgener [2]. Således kan p53 orkestrere biologiske udgange såsom apoptose, celle-cyklus anholdelse, ældning eller modulering af autofagi. Adskillige downstream direkte mål er involveret i antiproliferativ p53, herunder pro-overlevelse

suvivin

[3] og cellecyklusinhibitor

p21 /CIP1

[4].

Mdm2 (Mouse dobbelt minutter 2 homolog) er den vigtigste regulator af p53 [5]. Principielt Mdm2 er en E3 ligase, der nedregulerer p53 gennem nuklear eksport og ubiquitin-afhængige nedbrydning proteasomalaktivitet [6] – [9]. Desuden histon acetyltransferase (HAT) proteiner p300 og CBP (CREB-bindende protein) stabilisere p53 gennem acetylering, og denne stabilisering virkning kan ophæves ved Mdm2 gennem dannelse af et ternært kompleks med p53 og p300 eller CBP [10], [11]. Mutationer i p53, at der fører til tab af funktion repræsenterer den mest almindelige genetiske ændringer i humane cancere [12], [13]. Interessant, er et fuldstændigt tab af p53 findes kun i fremskreden prostatacancer [14]. Det blev senere bestemt, at en samlet underskud på p53 og PTEN, en tumor-suppressor involveret i PI3-AKT signalering [15], var tilstrækkelig til at drive udviklingen af ​​invasiv prostatacancer [16]. En anden tumor suppressor, NKX3.1, blev vist at forøge acetylering og stabiliteten af ​​p53 via MDM2-afhængig mekanismer [17].

Opløselig guanylylcyclase (SGC) er den nitrogenoxid (NO) receptor, og er godt kendt for sin enzymatiske aktivitet til omdannelse guanosin-5′-triphosphat (GTP) til cyklisk guanosin-3 ‘, 5’-monophosphat (cGMP). Denne vej er for det meste involveret i de kardiovaskulære og nervesystem [18]. Vi har tidligere rapporteret, at α1-underenheden af ​​SGC (sGCα1; gennavn

GUCY1A3

) er et direkte mål for androgen receptor (AR) og spiller vigtig rolle som drivkraft prostatacancer celleproliferation [19]. Vi bestemt også, at sGCα1 serverer en pro-overlevelse funktion i prostatakræft ved at hæmme p53 aktivitet og selektivt undertrykke gener, der er involveret i apoptose, via en mekanisme af p53 cytoplasmatisk beslaglæggelse [20]. Interessant, disse pro-cancer funktioner sGCα1 er uafhængige af sGC enzymaktivitet. For nylig blev det terapeutiske potentiale af målretning sGCα1 udviklet via et bindende peptid, der har stærk anti-cancer-aktivitet [21].

zinkfingre (ZNF) er en fælles DNA-bindende motiv fundet i flere transkriptionsfaktorer, og C

2H

2 motiv er den mest almindelige type [22]. Dette motiv er kendetegnet ved to cystein og to histidinrester koordinerende et eller flere zinkioner og rager ind i en finger-lignende struktur, der interagerer med DNA [23]. Beviser er ved at opstå, at ZNF proteiner spiller vigtige roller i menneskelige kræftformer. F.eks ZNF23 inhiberer tumorcellevækst gennem forøgelse af P27 /kip-1-ekspression, og ekspressionsniveauerne af ZNF23 protein er stærkt reduceret i human cancer [24]. I kolorektal cancer, blev ZKSCAN3 (ZNF306) udtryk forhøjet, og under-ekspressionen af ​​ZKSCAN3 reducerede tumorgenicitet [25]. Desuden flere rapporter viser, at ZNF proteiner kan påvirke p53 aktivitet. ZNF668 blev identificeret som en tumorsuppressor ved brystcancer, som stabiliserer p53 ved at forhindre Mdm2-medieret p53 ubiquitinering og nedbrydning [26]. ZNF307 undertrykker aktiviteten af ​​p53 og p21 ved at øge transskription af Mdm2 og EP300 [22].

Mens man studerer funktionen af ​​sGCα1 hjælp RNAi, vi identificeret Zink Finger 280b (ZNF280B, derefter kaldet 280b) som et mål for en af ​​sGCα1 shRNAs. De begrænsede oplysninger tilgængelige om 280b og den mulige forhold ZNF proteiner med p53 tilskyndet os til yderligere at analysere 280b for en potentiel rolle i prostatakræft. I denne undersøgelse viser vi en funktionel interaktion mellem 280b, p53, og Mdm2. Over-ekspressionen af ​​280b faldt betydeligt p53 niveauer ved at reducere dets stabilitet. Denne effekt på p53 stabilitet medieres ved evnen af ​​280b til at inducere ekspressionen af ​​Mdm2, gennem en positiv effekt på Mdm2 promotoren. Ved at undertrykke p53, 280b giver pro-overlevelse og vækstfremmende funktioner i prostatacancer. Til støtte for dette, er høj ekspression af 280b forbundet med lave p53-niveauer i prostata tumorvæv.

Materialer og metoder

Cell kultur og siRNA transfektion

LNCaP, C81 og CWR-22Rv1 celler blev dyrket som tidligere beskrevet [20]. Normale prostata epitelceller (Prec) blev dyrket i PrEGM som anbefalet af leverandøren (Lonza). Scrambled kontrol siRNA, sGCα1 siRNA, MDM2 siRNA (GAACAAGAGACCCUGGUUA) og ZNF280B siRNA (GGAACAAUCAUGUGAGGAA) (Dharmacon) ved 40 nM slutkoncentration blev transficeret ind i celler ved anvendelse af Lipofectamine Simax (Invitrogen).

Reporter Assay og plasmidtransfektion

C81-celler blev dyrket til 80-90% konfluens i RPMI-1640 med 5% FBS. Efter 24 timer blev mediet erstattet med serumfrit medium, og cellerne blev transient transficeret med p53-Luc-reporterplasmid eller Mdm2-Luc-reporterplasmidet, og kontrollere siRNA, eller siRNA mod ZNF280B og p53. Den pCH110 plasmid, der koder B-galactosidase blev anvendt til at overvåge transfektionseffektivitet [27]. P53-Luc plasmid blev venligst stillet til rådighed af Dr. Andrei Gudkov og indeholder tre p53-responsive elementer. MDM2-Luc og Mdm2 ekspressionsplasmid blev venligst stillet til rådighed af Dr. Jason M. Shohet. Transfektionen blev udført ved anvendelse af Lipofectamine 2000 og luciferaseaktiviteten blev målt ved anvendelse luciferase assay-system fra Promega.

Adenovirus og lentivirusinfektioner

C81-celler blev inficeret med 5-50 MOI af enten et adenovirus, der udtrykker ZNF280B (ABMGood)) eller en tom adenovirus som en kontrol. Efter 48 timer blev cellerne udsat for RT-PCR og western blotting.

sGCα1 shRNA, tom shRNA, og pakke vektorer blev købt fra Open Biosystems. De lentivirale partikler blev fremstillet ved at følge selskabets protokol. LNCaP-celler blev inficeret med lentivirus og udvælges under anvendelse af puromycin ved en koncentration på 4 mg /ml. Efter 4 dages selektion blev cellerne underkastet MTT-assay, QRT-PCR, Western blotting.

Immunhistokemi

Immunhistokemi blev anvendt til at sammenligne niveauet af ZNF280B i normal prostata væv og tumorvæv fås fra CHTN. ZNF280B antistof (1:200 fortynding Sigma) blev anvendt til immunohistochemisty som tidligere beskrevet [27]

Proliferationsassay

Efter siRNA transfektion i 3 dage, 20.000 celler fra hver betingelse blev podet i. 24-brønds plader. MTT-assayet (Sigma) blev anvendt som før [21] til at bestemme celleantallet.

Western blotting og Cell Fraktionering

Western blotting blev udført som beskrevet [19] ved brug af primære antistoffer mod sGCα1 ( Cayman Chemical), ZNF280B (Abgent), MDM2 (Santa Cruz), Survivin (Cell Signaling Technology), p21 (Cell Signaling Technology), p53 (Santa Cruz), β-tubulin (Abcam), RARa (Santa Cruz), β- actin (Abcam).

C81 celler behandlet med siRNA og adenovirus blev høstet og vasket en gang med kold PBS. 10% af cellerne blev reddet som input, og den resterende del blev delt i nukleare og cytosol fraktioner ved hjælp af Nuclear /Cytotsol Fraktionering Kit (MBL International). Fraktionerne blev derefter underkastet Western blotting for at måle ZNF280B og p53 proteinniveauer.

semikvantitativ RT-PCR og QRT-PCR

Totalt mRNA blev isoleret under anvendelse af Trizol-reagens følgende protokol fra fremstilling ( Invitrogen) og underkastet semi-kvantitativ RT-PCR og QRT- PCR-analyser som beskrevet [28]. PCR opstrøms og nedstrøms primere anvendt til hvert gen var:

Survivin

, 5′-GGACCACCGCATCTCTACAT-3 ‘og 5′-GACAGAAAGGAAAGCGCAAC-3’;

p53

, 5′-GGCCCACT TCACCGTACTAA-3 ‘og 5′-G TGGTTTCAAGGCCAGATGT-3’;

sGCα 1

, 5′-AGCAGTGTGGAGAGCTGGAT-3; og 5′-CTGATCCAGAGTGCAGTCCA-3 ‘;

p21

, 5′-GACACCACTGGAGGGTG ACT-3 ‘og 5’-CAGGTCCACATGGTCTTCCT;

GAPDH

, 5′-CGACCACTT TGTCAAGCTCA-3 ‘og 5′-AGGGGAGATTCAGTGTGGTG-3’.

MDM2

, 5′-TTTCGCAGCCAGGAGCACCG-3 ‘og 5′-AGTTTCCTTCACGGGGCGCG-3’;

ZNF280B

, 5′-TCCCAAAAGGGCTAAACTCA-3 ‘og 5’GTCCTTTGGAAAAGC- TGCTG-3’.

Resultater

En sGCα1 siRNA er rettet mod 280b i prostata kræftceller

for at undersøge betydningen af ​​endogene sGCα1 i prostata kræftceller, vi brugte shRNA til knockdown dette gen i LNCaP celler. Mellem fem forskellige shRNAs, to var mest effektive i nedregulering sGCα1 proteinekspression: shRNA7 og shRNA8 (data ikke vist). Disse shRNAs blev anvendt til yderligere undersøgelse. Som vist i fig. 1, shRNA8 var mere effektivt end shRNA7 på at mindske både niveauerne af sGCα1 mRNA og protein (figur 1B.) (Fig 1A.); lignende resultater blev observeret med siRNA7 og siRNA8 (fig. S1B, C). Men interessant nok, shRNA7 (og siRNA7) var signifikant stærkere end shRNA8 (og siRNA8) ved at blokere proliferation af LNCaP-celler (fig. 1C og fig. S1c). Dette overraskende resultat førte os til at overveje muligheden for off-target effekter af den ene eller begge shRNAs. En Blast søgning identificeret, at 17 ud af 21 nukleotider af siRNA7 matchede perfekt med en del af 280b genet (figur 1D.); en betydelig del af siRNA8 matches HIF1A genet (data ikke vist). shRNA7 og siRNA7 var i stand til signifikant nedregulerer 280b både på niveauet for mRNA (fig. 1E) og protein (fig. 1F), mens shRNA8 /siRNA8 havde ingen virkning, i LNCaP-celler, og de to hormon-uafhængige cellelinier C81 og CWR-22Rv1; interessant, hverken shRNA8 eller shRNA7 påvirket HIF1A ekspression (data ikke vist). På baggrund af disse data, vi hypotese, at den højere negativ effekt på cellevækst af shRNA7 /siRNA7, sammenlignet med shRNA8 /siRNA8, skyldes den ekstra effekt af shRNA7 /siRNA7 om 280b. For at teste denne hypotese, vi brugte en 280b-specifik siRNA, som interessant nok har en betydelig negativ effekt på LNCaP celleproliferation (fig. 1 H). Hypotesen var direkte testet ved at udføre en dobbelt knockdown af sGCα1 hjælp af siRNA8 og 280b-specifikke siRNA (fig. 1G), som blokerede celleproliferation stærkere end både siRNA8 eller 280b siRNA alene og næsten i samme omfang som siRNA7 ( fig. 1H). Disse data tyder på, at 280b serverer en pro-vækst funktion i prostata kræftceller.

(A, B, C) LNCaP celler blev inficeret med tomme lentivirus eller lentivirus udtrykker en af ​​to forskellige sGCα1 shRNAs (7, 8 ) og sGCα1 ekspression blev målt ved real-time PCR (A) eller Western blotting (B), og celletætheden blev målt ved MTT-assay (C). (D) Diagrammet viser nukleotid homologi mellem siRNA 7 og 280b. (E, F) blev LNCaP, C81, og CWR22-RV1 celler underkastet de samme infektioner og 280b niveauer blev målt ved real-time PCR (E) eller Western blotting (F). (G, H) C81-celler blev transficeret med kontrol (Ctrl), sGCα1 siRNA (7,8), 280b siRNA, og 280b plus sGCα1 siRNA 8, og sGCα1 niveauer blev målt ved Western blotting (G), og celletætheden var foranstaltning ved MTT-assay (H). Alle ekspressionsniveauer er i forhold til den første betingelse (A, D), og det blev sat til 1. β-actin tjente som en loading kontrol i Western blots. Søjlediagrammer repræsenterer gennemsnit af tre uafhængige forsøg plus SD. Stjerner angiver statistisk signifikans (P 0,01).

280b opregulerer sGCα1 mRNA og protein i prostatacancerceller

For at undersøge den rolle, 280b i prostata kræftceller, vi brugte den 280b-specifikke siRNA (fra fig. 1G). Den 280b siRNA kunne nedregulere, som forventet, 280b mRNA og protein (fig. 2A) og, overraskende, sGCα1 ekspression (fig. 2A). En Blast søgning af 280b siRNA sekvens kun identificeret den 280b genet som et direkte mål og klart viste, at sGCα1 ikke har nogen sekvens lighed med 280b siRNA sekvens. Disse data antyder, at sGCα1 mRNA og protein er et mål for den 280b proteinet, ikke siRNA.

(a, b) LNCaP-celler blev transficeret med kontrol eller 280b siRNA og sGCα1 niveauer blev målt ved realtid PCR eller Western blotting (A) og celletætheden blev målt ved MTT-assay (B); fasekontrast billeder blev taget på dag 6 (B). (C, D) LNCaP-celler blev inficeret med tomme eller sGCα1 adenovirus efter transfektion med kontrol (-) eller 280b siRNA (+), og sGCα1 niveauer blev målt ved Western blotting (C), og celledensiteten var foranstaltning ved MTT-assayet (D ). Alle ekspressionsniveauer er i forhold til den første betingelse (A), og det blev sat til 1. β-actin tjente som en loading kontrol i Western blots. Søjlediagrammer repræsenterer gennemsnit af tre uafhængige forsøg plus SD. Stjerner angiver statistisk signifikans (P 0,01).

For at afgøre, om nedreguleret sGCα1 er ansvarlig for den reducerede celleproliferation som følge af 280b knockdown, vi gentog transfektion med 280b siRNA, der som før (se fig. 1 H) resulterede i en markant nedgang i LNCaP-cellevækst (fig. 2B). Faktisk er de celler behandlet med 280b siRNA ændret deres morfologi og begyndte at dø (fig. 2B). For at bestemme om sGCα1 overekspression kan redde cellerne blev siRNA-transficerede celler inficeret med sGCα1 adenovirus, hvilket resulterer i inddrevet sGCα1 proteinniveauer (fig. 2C). Over-ekspression af sGCα1 undladt at redde cellerne (fig. 2D), hvilket indikerer, at sGCα1 er enten ikke i stand til eller ikke er tilstrækkelig til at redde prostatacancerceller har reduceret 280b ekspression og således tyder på, at en anden 280b målet er involveret.

280b nedregulerer p53 protein i prostatacancerceller

Da vores tidligere arbejde viste, at sGCα1 hæmmer p53 aktivitet i prostatakræft [20], og andet arbejde har vist, at ZNF proteiner kan påvirke p53 signalvejen [29] vi ønskede at afgøre, om 280b påvirker p53. Interessant siRNA knock-down af 280b ført til øget p53 proteinniveauer i LNCaP, C81 og CWR-22RV1 celler (Fig. 3A). Derimod adenovirus-medieret overekspression af 280b markant reduceret p53 proteinniveauer (fig. 3B). Effekten blev kun observeret på p53-proteinet, idet p53-mRNA-niveauer ikke var påvirket af 280b (fig. 3C, D). Tilsammen viser disse data, at 280b negativt regulerer p53 kun på proteinniveauet, hvilket adskiller den fra dens virkning på sGCα1, som er positivt og observeret på både mRNA og protein niveauer.

(A, C) LNCaP blev C81, CWR22-RV1 celler transficeret med kontrol (-) eller 280b siRNA (+) og p53, survivin, p21, og 280b ekspressionsniveauer blev målt ved Western blotting (A) eller real-time PCR (C). (B, D) C81-celler blev inficeret med tomme (-) eller 280b adenovirus (+) og p53, survivin, p21 og 280b ekspressionsniveauer blev målt ved Western blotting (B) eller real-time PCR (D). Alle ekspressionsniveauer er i forhold til den første betingelse (C og D), og det blev sat til 1. (E) C81-celler blev transficeret med 0,2 ug p53-Luc og kontrol (-), eller 280b (+) siRNA, i tilstedeværelse af kontrol eller p53 siRNA. Transkriptionsaktivitet af p53-aktivitet blev kvantificeret ved at måle Luciferaseaktivitet. Alle aktiviteter er i forhold til den første betingelse, og denne aktivitet blev sat til 1. (F, G) Celler fra (E) blev udsat for Western blotting for p53, Survivin, p21, og 280b (F), og måling af celledensitet ved MTT-assay (G). β-actin tjente som en loading kontrol i Western blots. Søjlediagrammer repræsenterer gennemsnit af tre uafhængige forsøg plus SD. Stjerner angiver statistisk signifikans (P 0,02).

Siden 280b ændrer p53 protein niveauer, vi ville forvente det påvirke p53 transkriptionsaktivitet. Dette blev overvåget ved reportergenassay eller ekspression af endogene p53-regulerede gener. Ved hjælp af en luciferase reporter plasmid indeholdende p53-responsive elementer [30], observerede vi en signifikant stigning i p53 aktivitet som respons på 280b siRNA transfektion (fig. 3E). Transient transfektion af 280b ekspressionsplasmid forårsagede en lille, men signifikant fald i p53-aktivitet (Fig. S2). At studere endogene gener, vi fokuseret på ekspression af survivin og p21, da 280b siRNA betydeligt hæmmet cellevækst (se fig. 2B). Survivin er en p53-represseret gen, som medierer celle overlevelse og p21 er et p53-induceret gen, der inhiberer cellecyklusprogression. Som svar på 280b udtømning, blev Survivin protein reduceret og p21 blev forøget i alle tre cellelinier (fig. 3A). Real-time PCR data bekræftede, at 280b påvirker survivin og p21 på mRNA-niveauet (fig. 3C). I mellemtiden blev observeret de modsatte virkninger, når cellerne blev behandlet med 280b overekspression, hvilket gav øgede Survivin og reducerede p21-proteiner (fig. 3B) og mRNA’er (fig. 3D).

Disse resultater antyder, at 280b kan tjene en pro-overlevelse funktion i prostatacancer. For at teste denne hypotese, monitorerede vi apoptose ved at måle PARP-spaltning. Både LNCaP og CWR-22Rv1 celler udviste forhøjede niveauer af spaltet PARP i afhængighed 280b knockdown (Fig. S3). For at undersøge rollen af ​​p53 i denne proces, vi anvendte etoposid, hvilket som forventet, inducerede høje niveauer af p53 og forhøjet PARP-spaltning (fig. 3F). Vigtigere, blev disse virkninger formindskes eller væk, når 280b var overudtrykt (fig. 3F), klart viser, at 280b kan beskytte celler fra etoposid-induceret apoptose.

Vi udforskede næste hvis p53 er involveret i væksthæmning induceret af 280b siRNA. For at gøre dette, brugte vi siRNA at mindske ekspressionen af ​​endogen p53 i C81-celler, som blev bekræftet af reduceret reporter gen aktivitet (fig. 3E) og ekspression af p53-regulerede proteiner (fig. 3G). Betydeligt, siRNA knockdown af p53 var i stand til næsten fuldstændigt redning cellevækst inhiberet af 280b siRNA depletion (Fig. 3H), hvilket kraftigt antyder, at forhøjet p53 er ansvarlig for cellevækst undertrykt af 280b knockdown.

280b destabiliserer p53-protein i prostatacancerceller ved opregulering Mdm2

ovennævnte data viser, at 280b inhiberer p53 transkriptionel aktivitet og nedsætter p53 proteinniveauer uden at ændre dets mRNA-niveau antyder, at 280b målretter p53-proteinet. For at bestemme om 280b kan påvirke p53 proteinstabilitet anvendte vi cycloheximid (CHX) til at måle p53 halveringstid. Under-ekspression af 280b ved specifik siRNA fører til en stigning i p53 halveringstid fra 14 min til 24 min (fig. 4A), mens overekspression af 280b faldt svagt halveringstiden (fig. 4B).

(a, b) C81-celler blev transficeret med kontrol siRNA eller 280b siRNA (A) eller inficeret med tom adenovirus eller 280b adenovirus (B) i 48 timer og derefter behandlet med 100 mg /ml cycloheximid (CHX) for den gange, hvorefter Western blotting blev anvendt til måling p53 niveauer. Venstre paneler repræsenterer kvantificeret Western blots. (C, D) C81-celler blev transficeret med 280b siRNA eller inficeret med 280b adenovirus og underkastet celle fraktionering, efterfulgt af Western blotting for at måle det cytosoliske (C) eller nuklear (N) niveauer af p53 og 280b. Bemærk, at tallene ovenfor banerne repræsenterer relative niveauer af p53 protein, standardiseret til p-actin niveauer, med den første bane sat til 1. (E) C81 celler blev inficeret med tom adenovirus eller 280b adenovirus i 48 timer og derefter behandlet med 10 mM Nutlin-3A eller køretøj, efterfulgt af Western blotting for at måle det cytosoliske (C) eller nukleare (N) niveauer af p53 og 280b. For alle eksperimenter β-actin tjente som en loading kontrol. β-tubulin og RAR, der anvendes som markører for cytosol og nukleare fraktioner, henholdsvis (C, D, E).

For bedre at forstå den 280b effekt på p53 protein stabilitet, vi overvåget p53 subcellulære lokalisering. Bemærk, at Western blotting for β-tubulin (cytosol) og RARa (nuklear) bekræftede renheden af ​​de to cellefraktioner, og at 280b er overvejende eller udelukkende et kerneprotein (fig. 4C). Reduktion endogene 280b proteinniveauer resulterede i signifikant forhøjede nukleare p53 men ingen ændring i cytosoliske niveauer (fig. 4C). Den komplementære eksperiment, overekspression af 280b, reduceret nuklear p53 uden igen at ændre de cytosoliske niveauer (Fig. 4D). Disse resultater antyder, 280b fremmer p53 proteasomalaktivitet nedbrydning ved at inducere p53 nuklear eksport. For at opnå bevis for dette, blev p53 subcellulære lokalisering overvåget i tilstedeværelse af Nutlin 3A, en inhibitor af Mdm2 interaktion med p53 og dermed nukleare eksport [31]. Som vist i fig. 4E, Nutlin-3A næsten helt elimineret den 280b-medierede reduktion i nukleare p53 niveauer, et resultat i overensstemmelse med en 280b rolle i p53 nukleare eksport.

Nuklear eksport af p53 afhænger Mdm2, hvilket er et vigtigt skridt, der fører til p53 proteasomalaktivitet nedbrydning [6], [7]. Vi bekræftede denne effekt i prostata kræftceller, hvor Mdm2 siRNA inducerede højere niveauer af nukleare p53 mens transient overekspression af Mdm2 reducerede disse niveauer (fig. S4), efterligne 280 effekt på p53. Da ZNF proteiner har evnen til at regulere transkription, vi den hypotese, at 280b kan påvirke p53 ved at regulere ekspressionen af ​​Mdm2. Vi begyndte at undersøge denne mulighed ved at måle ekspressionen af ​​Mdm2, som er væsentligt reduceret i både mRNA og protein niveauer, når 280b er opbrugt (fig. 5A). I modsætning hertil 280b overekspression har den modsatte effekt, hvilket resulterer i markante stigninger i både

Mdm2

mRNA og protein-ekspression (fig. 5B). Da den

Mdm2

mRNA er påvirket af 280b, er det muligt, at effekten er transkriptionelle. For at teste denne mulighed, analyserede vi en potentiel 280b aktivitet på

Mdm2

promotor, under anvendelse af et luciferasereportergen assay. Transient ekspression af 280b i C81-celler steget

Mdm2

promotoraktivitet i en dosisafhængig måde (fig. 5C) og siRNA udtømning af 280b blokeret

Mdm2

promotoraktivitet (fig. 5D). Disse resultater viser tydeligt, at 280b virker på

Mdm2

promotor og foreslå, at initiativtageren kan være et direkte mål for 280b.

(A, B, E) C81-celler blev transficeret med (A , E) kontrol siRNA (-) eller 280b siRNA (+) eller (B, E) inficeret med tomme adenovirus (-) og 280b adenovirus (+) og underkastet real-time RT-PCR og Western blotting for at måle ekspressionen af MDM2 og 280b. (C, D) C81cells blev transficeret med 0,1 ug Mdm2-Luc og co-transficeret med (C) Kontrol siRNA (-) og 280b siRNA (+), (D) Tomme pClneo (-) og 0,2 ug og 0,4 ug 280b, og overvåges for 280b aktivitet ved at måle Luciferaseaktivitet. (E) C81cells blev co-transficeret med tom pClneo (-) eller MDM2 (+) og kontrol-siRNA (-) eller Mdm2 siRNA (+), efterfulgt af Western blotting for at måle det cytosoliske (C) eller nuklear (N) niveauer af p53, 280b, og Mdm2. For alle eksperimenter β-actin tjente som en loading kontrol. p-tubulin og Rara blev anvendt som markører for cytosoliske og nukleare fraktioner, henholdsvis (E). Alle p53 protein niveauer var i forhold til den første betingelse, og det blev sat til 1. Stjerner * og ** angiver statistiske betydninger af P 0,05 og P. 0,01, henholdsvis

Til at begynde at studere inddragelse af Mdm2 i 280b-medieret nuklear eksport af p53 blev Mdm2 udtryk ændres i C81-celler til at afgøre, om dette vil påvirke 280b aktivitet på p53 subcellulære lokalisering. Ja, dette var tilfældet, da overekspression af Mdm2 signifikant reducerede nukleare akkumulering af p53, der blev udløst af 280b knockdown (fig. 5E). I det supplerende eksperiment, Mdm2 knockdown elimineret den negative aktivitet, 280b overekspression har på nukleare p53 niveauer (fig. 5E). Tilsammen disse data tyder på, at 280b effekt på p53 er medieret via 280b regulering af Mdm2 udtryk. Bemærk, at Mdm2 primært cytoplasmatisk i prostata kræftceller.

280b er overudtrykt i prostata tumorer og korrelerer med reduceret p53 protein

At etablere betydningen af ​​280b i prostatakræft, vi først undersøgt ekspressionen af ​​280b i et panel af prostatacancercellelinjer og én normal cellelinje. RT-PCR-resultater viste 280b mRNA-niveauer var 6-7 gange højere i cancerceller end normale prostata-epitelceller (Prec) (fig. 6A). Western blotting viste den samme konklusion, med betydelige proteinniveauer i prostatacancerceller og intet påviseligt i PREC celler (fig. 6A). At udvide vores indlæg for kliniske omgivelser, vi udførte immunhistokemi på match-parrede væv fra 4 patienter. Patienter 2 og 4 viste stærkere 280b immunreaktivitet end de normale væv (fig. 6B), hvilket viser, 280b ekspression er forhøjet i nogle prostata cancertumorer. Som det kunne forventes for en transskriptionsfaktor, er 280b udelukkende udtrykkes i cellekernerne af alle tumorer (fig. 6B). Vævet Undersøgelsen blev udvidet til at omfatte flere væv og for at søge efter en mulig sammenhæng mellem 280b og p53 udtryk. Som vist i fig. 6C, er 280b protein udtrykt i 6 af 10 prostatatumorer, mens kun 1 af 3 i normal prostata. Interessant er p53 protein udtrykt højest i de tumorer (# 1 og # 7), som ikke udtrykker detekterbare niveauer af 280b, og den laveste p53 niveau findes i tumoren med den højeste 280b ekspression. Disse data viser et omvendt forhold i ekspression af 280b og p53 i prostatatumorer og er således i overensstemmelse med en vigtig rolle for 280b som en negativ regulator af p53 i prostatacancer.

(A) Real-time PCR og Western blotting blev brugt til at detektere ekspressionen af ​​280b i normal prostata (Prec) og prostatakræft-cellelinier (LNCaP, C81, og CWR-22Rv1). (B) immunofarvning af 280b i 4 matchede par af prostatavæv, normale versus tumor. (C) Cell ekstrakt fra 4 normale prostatavæv og 9 tumorvæv blev underkastet Western blotting til påvisning 280b, p53, og MDM2 ekspressionsniveauer. β-actin tjente som en belastning kontrol.

Diskussion

Forud for denne undersøgelse, 280b var en ukarakteriseret protein, med den eneste tilgængelige oplysninger, der beskriver forholdet til den store familie af zink finger transkriptionsfaktorer [32]. I denne undersøgelse har vi identificeret to mål for 280b, sGCα1 og p53, som begge har væsentlige funktioner i prostatacancer. Den første, sGCα1, har et velkarakteriseret rolle i NO signalering og en mindre kendte rolle i prostatakræft progression. Med hensyn til sidstnævnte rolle, har vores tidligere data vist, at sGCα1 er en vigtig mediator af androgen støtte af prostatacancer celleproliferation [33] og en repressor af p53, der giver prostatacancerceller en pro-overlevelse funktion [20]. Vores konklusion, 280b øger ekspressionen af ​​sGCα1 er i overensstemmelse med 280b have pro-cancer funktioner, som er klart angivet ved dets høj ekspression i prostatakræft og dens pro-proliferativ funktion i prostata kræftceller. Interessant nok blev der observeret den positive effekt af 280b på både sGCα1 mRNA og protein, hvilket antyder, at mRNA og måske sGCα1 promotoren, kan være målet for 280b. Anvendelse af en 1-kb strækning af sGCα1 promotoren på hvilken AR handlinger [33], vi observeret nogen 280b aktivitet (data ikke vist). Dette kunne skyldes enten 280b virkning på sGCα1 er uden for vores 1-kb region, eller er post-transkriptionel, noget, der vil blive undersøgt i fremtiden. Det er bemærkelsesværdigt, at 280b deler en begrænset fælles DNA-sekvens med sGCα1, den sekvens, der er målrettet af siRNA7, som førte os til at identificere 280b. På baggrund af disse oplysninger, er det spændende at overveje muligheden for en fælles endogene miRNA eller siRNA, der virker på både sGCα1 og 280b. Hvis en sådan regulerende RNA eksisterer, ville dette RNA forventes at blive nedreguleret i prostatakræft da både sGCα1 og 280b er over-udtrykt i denne sygdom. Identifikation af en sådan specifik RNA er en vigtig fremtidig mål for laboratoriet.

På trods af den positive regulering af 280b af sGCα1, overekspression af sGCα1 overraskende undladt at redde celler hæmmes af 280b udtynding, hvilket tyder på et andet mål af 280b . Vi søger førte til p53. I modsætning til sGCα1, er p53 negativt reguleret af 280b og denne forordning er rettet mod p53-proteinet. Under-udtryk for p53 er i stand til næsten helt rednings celler hæmmes af formindsket 280b udtryk. Således i forbindelse med aftagende 280b udtryk i prostata kræftceller, hvilket resulterede i reducerede niveauer af sGCα1 og øget p53, stigningen i p53 var hovedsagelig eller udelukkende er ansvarlig for den reducerede cellevækst og sandsynligvis den forbedrede apoptose.