PLoS ONE: Regulering af RKIP Funktion af Helicobacter pylori i Gastric Cancer

Abstrakt

Helicobacter pylori (H. pylori)

er en gram-negative, spiralformede bakterie, der inficerer mere end halvdelen af ​​verdens befolkning og er en væsentlig årsag til gastrisk adenocarcinom. De mekanismer, der knytter

H. pylori

infektion til gastrisk carcinogenese er ikke godt forstået. I den foreliggende undersøgelse rapporterer vi, at Raf-kinase inhibitor protein (RKIP) har en rolle i induktionen af ​​apoptose ved

H. pylori

i gastriske epitelceller. Western blot og luciferase transskription reporter analyser viser, at patogenicitet ø

H. pylori

hurtigt phosphorylerer RKIP, som derefter lokaliseres til kernen, hvor det aktiverer sin egen transkription og inducerer apoptose. Tvungen overekspression af RKIP øger apoptose i

H. pylori

-inficerede celler, hvorimod RKIP RNA hæmning undertrykker induktion af apoptose af

H. pylori

infektion. Mens inducere phosphorylering af RKIP,

H. pylori

samtidigt rettet mod ikke-phosphoryleret RKIP for proteasom-medieret nedbrydning. Stigningen i RKIP transskription og fosforylering ophæves ved at mutere RKIP serin 153 til valin, hvilket viser, at reguleringen af ​​RKIP aktivitet ved

H. pylori

er afhængig RKIP s S153 rest. Desuden

H. pylori

infektion øger ekspressionen af ​​Snail, et transskriptionsrepressor af RKIP. Vores resultater antyder, at

H. pylori

udnytter en tumor suppressor protein, RKIP, at fremme apoptose i gastriske kræftceller

Henvisning:. Moen EL, Wen S, Anwar T, Cross-Knorr S, Brilliant K, Birnbaum F, et al . (2012) Regulering af RKIP Funktion af

Helicobacter pylori

i Gastric Cancer. PLoS ONE 7 (5): e37819. doi: 10,1371 /journal.pone.0037819

Redaktør: Yoshio Yamaoka, Veterans Affairs Medical Center (111D), USA

Modtaget: December 30, 2011; Accepteret: April 24, 2012; Udgivet: 25. maj 2012 |

Copyright: © 2012 Møn et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Institute of General Medical Sciences i National Institutes of Health under Award Number P20GM103421 (DC); foregående segment af dette projekt blev støttet af National Center for Research Resources (NCRR) under P20 RR 017.695 (DC), R01 CA111533 (SFM) og R21 CA133601 (JMS). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

mavekræft er den fjerde hyppigst diagnosticerede malignitet i verden. I 2007, cirka en million nye gastrisk kræfttilfælde fører til ca. 800.000 dødsfald på verdensplan blev registreret, hvilket gør det den næsthyppigste dødsårsag af kræft [1]. Mavekræft er i øjeblikket den syvende hyppigste årsag til kræftdødsfald i USA, med cirka 21.500 nye tilfælde diagnosticeres i 2011 (https://www.cancer.gov/cancertopics/types/stomach). Den gram-negative, spiral formet bakterie

Helicobacter pylori (H. pylori)

inficerer mere end halvdelen af ​​verdens befolkning og er blevet identificeret som en væsentlig risikofaktor i gastrisk [2] carcinogenese. WHO og Det Internationale Agentur for Kræftforskning udpeget det som et klasse I kræftfremkaldende i 1994 [3]. Vores nuværende forståelse af

H. pylori

-induceret carcinogenese er, at bakterien og den tilhørende kronisk inflammatorisk respons fremme gastrisk epitel celledød ved apoptose [4], med efterfølgende hyper-proliferation [5], og produktionen af ​​frie radikaler [6] som alle bidrager til en langsom og progressiv sekvens af ændringer i maveslimhinden, der i sidste ende favoriserer progression mod kræft. Denne model stemmer overens med rapporter om, at pro-inflammatoriske cytokin gen-polymorfier, der øger intensiteten af ​​den inflammatoriske reaktion er relateret til øget gastrisk kræftrisiko [7].

H. pylori

klæber nøje til gastriske epitelceller og kan inducere apoptose direkte [8]. KAG (cytotoksiske-associeret gen) patogenicitet ø (CAG PAI) af

H. pylori

er en 40 kB segment af DNA, som indeholder gener, der koder for bestanddele af et type IV bakterielt sekretionssystem [9]. Inden for denne region er den

CagA

gen, der koder CagA, en immunodominant protein på 121-145 kDa [9].

H. pylori

stammer med og udtrykker den cag PAI oftere associeret med peptisk ulcussygdom og gastrisk cancer hos vestlige populationer end stammer, der ikke gør [9]. Ved injektion via type IV sekretion systemet til værten gastriske epitelceller, kan CagA efterfølgende blive phosphoryleret med Src-familie tyrosinkinaser ved sin C-terminalen [10], hvilket CagA at binde og aktivere SHP2 og signal via ERK [11]. Vigtigere er det, CagA er også ansvarligt for aktivering af signalet transducer og aktivator af transkription 3 (STAT3)

in vitro

in vivo

[12], selv om dette ikke nødvendigvis er afhængig af CagA fosforylering [11]

STAT proteiner konstitutivt udtrykkes i flere neoplasmer, herunder gastrisk, bryst, hoved og hals, og prostatakræft [13] -. [16]. Upon fosforylering af tyrosin 705 rest og acetylering ved lysin 685, STAT3 dimeriserer og kommer ind i kernen, hvor det fungerer til transkriptionelt regulere en bred vifte af gener [17], [18]. Konstitutiv aktivering af STAT3-protein har vist sig at forhindre apoptose og øge celleproliferation og metastase i en række cancere, herunder mavecancer [19], [20].

Et af kendetegnene ved gastrisk tumor progression er den erhvervelse af mere invasive og vandrende fænotyper under epitel-mesenkymale overgang (EMT). Under EMT, gastriske epitelceller undergå fænotypiske ændringer karakteriseret ved tabet af celleadhæsionsmolekyler, især epitel cadherin (E-cadherin) [21]. Transkriptionsfaktoren Sneglen, en zink-finger-protein, er tidligere blevet karakteriseret som en vigtig regulator af EMT grund af sin aktivering via Nuclear Factor kappa Beta (NF-kB) [22] og efterfølgende undertrykkelse af E-cadherin i epiteliale tumorceller [ ,,,0],23], [24]. Derudover studerer bruger gain-of-funktion og tab af funktion tilgange har identificeret Snail som en repressor af RKIP transskription i metastatisk prostatacancer celler [25].

RKIP er medlem af phosphatidylethanolamin protein familie og en negativ regulator af ERK1 /2 (Ekstracellulær Signal-kinase) [26], NF-kB [27] og GRK (G-protein-koblet receptor kinase) [28] pathways. RKIP spiller således en vigtig rolle i reguleringen af ​​celle overlevelse og apoptose, foruden at potensere virkningen af ​​kemoterapeutiske midler [29]. RKIP er også blevet identificeret som en metastase suppressor protein [30], og i gastrisk adenocarcinom patienter der eksisterer en positiv sammenhæng mellem RKIP udtryk og patient overlevelse og en omvendt korrelation mellem ekspressionen af ​​RKIP og STAT3 [19]. RKIP ekspression og funktion kan reguleres ved post-translationelle modifikationer. For eksempel phosphorylering af RKIP af proteinkinase C i serin-153 forhindrer RKIP evne til at binde til dets målmolekyle, derved inaktivere RKIP funktion [31]. Endvidere kan RKIP undertrykkelse via promotor methylering overvindes ved methylering og histondeacetylaseinhibitorer [25].

På grund af de vigtige roller RKIP, STAT3 og

H. pylori

i patogenesen af ​​mavekræft, vi undersøgt, om

H. pylori

signaler gennem RKIP. Vores undersøgelser tyder på, at et komplekst samspil mellem

H. pylori s cagPAI

, RKIP, STAT3, og Snail virker til at dysregulate gastrisk epitelcelle apoptose ved at modulere RKIP funktion, en mekanisme, der definerer en central rolle for RKIP i

H. pylori

associeret gastrisk carcinogenese.

Materialer og metoder

Reagenser

Alle reagenser og kemikalier blev indkøbt fra Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO), medmindre andet er angivet. MG-132 blev indkøbt fra Calbiochem (Gibbstown, NJ) opløst i DMSO og anvendt i en koncentration på 10 mM. Interleukin-6 (IL-6) blev indkøbt fra BD Biosciences (San Diego, CA). Protein-kvantificering reagenser blev opnået fra Bio-Rad Laboratories, Inc. (Hercules, CA). Forøget kemiluminescens reagenser og sekundær mus og kanin-peberrodsperoxidase-konjugeret til Western blot-analyse var fra GE Healthcare (Piscataway, NJ). Den actin-HRP, phosphoryleret-RKIP (pRKIP) og STAT3 antistoffer blev indkøbt fra Santa Cruz Biothechnology (Santa Cruz, CA). Antistofferne for STAT3 pS727 og pY705 og PARP blev indkøbt fra Cell Signaling Technology (Beverly, MA) og antistoffet mod RKIP fra Millipore, Billerica, MA. Antistoffet til snegl blev indkøbt fra Abcam (Cambridge, MA).

Celler og plasmider

Den humane gastriske carcinoma-cellelinie AGS (CRL 1739) blev indkøbt fra American Type Culture Collection (Manasas , VA). MKN28 celler blev doneret af Dr. Richard Peek, Vanderbilt University, Nashville, TN og blev oprindeligt købt fra Riken Cell Bank, Ibaraki, Japan. Ekspressionsplasmiderne for pcDNA3, c-myc STAT3, CMV-HA-RKIP (HA-RKIP) og CMV-HA tom vektor (EV), er blevet beskrevet [18], [26]. Den RKIP S153V plasmidet blev leveret af Dr. Marsha Rosner, University of Chicago, Chicago, IL.

H. pylori

Stammer og dyrkningsbetingelser

Vild typen

H. pylori

stammer eller isogene

H. pylori

mutanter blev co-dyrket med AGS eller MKN gastrisk cellelinier som beskrevet tidligere [32] ved en infektionsmultiplicitet (MOI) på 100:1 i alle forsøg med mindre andet er angivet.

Transfektion af AGS celler

AGS celler blev transient transficeret under anvendelse af GenJet plasmid transfektionsreagens (Signagen Laboratories, Gaithersburg, MD) ifølge fabrikantens protokol for en 6-brønds pladeformat. Totalt DNA mængder på mellem 1 og 2 ug transficeret per prøve. Transfektionsbetingelser blev vurderet og optimeret ved analyse af celler transficeret med en grønt fluorescerende protein (GFP) udtrykkende RKIP plasmid. Transfektionseffektiviteten var konsekvent i området fra 75-85%.

Protein Extraction og Western blot-analyse

Total celleekstrakter og subcellulære fraktioneringer blev fremstillet og immunblottet som beskrevet tidligere [29], [32 ]. Proteinkoncentrationer blev bestemt under anvendelse af BCA Protein Assay (Thermo Scientific). Densitometri af Western blots blev udført i overensstemmelse med den protokol anført på følgende websted:. https://lukemiller.org/journal/2007/

Realtime PCR

To ug RNA blev omdannet til cDNA under anvendelse RevertAid First-Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Scientific). Kvantitativ realtids-PCR blev udført under anvendelse af 2 × QIAgen QuantiFast SYBR Green I (Roche). Primerne for Snail var frem: AGCTCTCTGAGGCCAAGGATCT, omvendt: TGTGGCTTCGGATGTGCAT og beta-actin: fremad: CTGGCACCACACCTTCTACAA, omvendt: CAGCCTGGATAGCAACGTACA. Følgende typiske profil gange anvendt, var i 40 cykler: et indledende trin ved 95 ° C i 10 minutter, efterfulgt af 95 ° C i 15 s og 60 ° C i 1 min. Den relative ekspression blev beregnet ved anvendelse af 2-ΔΔCT fremgangsmåde som tidligere beskrevet [33].

STAT3 og RKIP Luciferase reporterassays Salg

Celler (2 x 10

5 celler /brønd i 6-brønds plader) blev transient transficeret med 0,1 pg (STAT3, RKIP) eller 0,05 ug (NF-kB) af et reporterplasmid indeholdende enten STAT3 binding SIE-fragment af promotorregionen af ​​muse IRF1 genet (p2xSIE-Luc) eller RKIP promotorregionen plus de indikerede plasmider som beskrevet tidligere [18]. Ca. 24 timer efter transfektion blev celler behandlet med den angivne lægemiddel eller inficeret med

H. pylori

natten eller venstre ubehandlet. Luciferaseaktiviteten i cytosoliske supernatant blev evalueret under anvendelse af luciferase Reporter Assay (Promega) og målt ved anvendelse af et luminometer til at estimere transkriptionsaktivitet [18].

apoptoseassays Salg

Apoptose blev kvantificeret i separate assays ved flowcytometri og DNA-fragmentering ELISA. Til flowcytometri, procentdelen af ​​apoptotiske celler (sub-G

O) blev bestemt ved flow-cytometri af propidiumiodid farvede celler [29]. Cytoplasmatisk histon-associerede DNA-fragmentering blev målt med celledøden Detection ELISA Plus kit (Roche, Indianapolis, IN) ifølge producentens instruktioner.

cytoplasmatisk histon-associerede DNA-fragmentering blev målt med celledøden Detection ELISA Plus kit (Roche, Indianapolis, IN) ifølge producentens instruktioner. Forsøgene blev gentaget 3 gange og udført i to eksemplarer.

lentivirus-medieret Knockdown af RKIP

lentivirus konstruerer.

pLKO.1 puro-modstand lentiviral konstruere RHS3979-97070798 og RHS3979-98492779 blev købt fra Open Biosystems (Huntsville, AL). Konstruktionerne indeholdt en puromycinselektion markør og blev dyrket i Luria Broth indeholdende ampicillin ved 37 ° C. Bouillon blev centrifugeret ved 10.000 ×

g

i 10 min. og supernatanten blev kasseret. DNA fra disse pellets blev oprenset ved anvendelse af QIAGEN Plasmid Maxi Plus Kit.

lentivirus produktion. Salg

293T emballage celler blev podet i lav-antibiotikum vækstmedier (DMEM, 10% varmeinaktiveret FBS, 0,1 × Penicillin /Strepomycin /glutamin). Celler blev inkuberet i 24 timer (37 ° C, 5% CO

2), eller indtil de var ca. -70% konfluente. Medierne på 293T emballage cellerne blev erstattet med høj vækst medier, der indeholder DMEM. En blanding af transfektions- plasmider blev fremstillet som følger:. Pakkende plasmid (ΔVpr.89), kuvert plasmid (VSV-G), hårnål-pLKO.1 og tom vektor

Fugene transfektionsreagens blev fremstillet i DMEM ifølge til fabrikantens anvisninger. Kort fortalt blev 3 plasmider tilsat dråbevis til Fugene og DMEM og blandes. Blandingen fik derefter lov til at inkubere i 20-30 min. ved stuetemperatur. Transfektionsblandingen blev derefter forsigtigt tilsat til pakkecellerne. Cellerne blev inkuberet i ca. 18 timer. Transfektionen Medierne blev derefter kasseret den følgende morgen og erstattet med high-vækstmedium. Cellerne blev inkuberet i 24 timer. Lentivirus holdige medier blev høstet containingand ekstra høj vækstmedier tilføjet. Celler blev inkuberet i 24 timer, og medierne høstet. Typisk samling var for 2-3 tidspunkter. Alle virale høst blev samlet.

lentivirus infektion af AGS-celler. Salg

AGS celler blev dyrket til ca. 50% konfluens. De virale supernatanter blev tilsat polybren. Tolv timer efter infektion, blev den virale medier fjernes og erstattes med virale medier og inkuberet i yderligere 12 timer. Medierne blev kasseret og erstattet med Hams F12-medium. Cellerne blev inkuberet i 24 timer. Celler blev opdelt i selektionsmedium indeholdende puromycin og fik lov at inkubere i 24 timer.

Statistiske metoder Salg

Alle cellekultur forsøg blev gentaget mindst 3 gange, medmindre andet er angivet, og parret t- tests blev anvendt til at bestemme statistisk signifikans.

Resultater

H. pylori

Infektion Øger Phosphorylering af RKIP

RKIP hæmmer flere celleoverlevelsesforløb, herunder dem, medieret gennem NF-kB og Jak /STAT [22]. For at belyse effekten af ​​

H. pylori

infektion på RKIP i mavens celler blev AGS celler inficeret med

H. pylori

og høstet 2 h og 6 h senere. Som vist i fig. 1A, blev niveauet af phosphoryleret RKIP (pRKIP) forhøjet efter 2 h (3,126 gange) og 6 h (2,9-fold) efter

H. pylori

infektion mens total RKIP protein-ekspression øget 1,4 gange efter 2 timer og 1,75 gange efter 6 timer af

H. pylori

infektion. Lignende resultater blev også opnået med MKN gastrisk cancerceller (se figur S1).

(A) Western blot-analyse af AGS-celler co-dyrket med

H. pylori

(HP) ved MOI på 100:1 til 2 og 6 timer og undersøges for pRKIP, RKIP, og actin udtryk. Densitometri blev udført på tre uafhængige forsøg og båndintensiteter normaliseret i forhold til actin for hvert tidspunkt. Vores resultater indikerede et 3.126 ganges forøgelse (gennemsnit intensitet 0,44 vs 1,376) i pRKIP efter 2 timer og 1,384 gange forøgelse (gennemsnit intensitet 0,6774 vs 0,938) i RKIP efter 2 timers

H. pylori

infektion. (B) AGS celler co-dyrket i 6 timer i nærvær eller fravær af PKC-inhibitoren Bisindolylmaleimide (Bis), blev undersøgt for ekspression af pRKIP blev RKIP og actin.All behandlinger udført i 1% DMSO som en vehikelkontrol ( Bis).

H. pylori

induceret Phosphorylering af RKIP er PKC-afhængig

fosforylering af RKIP på serin 153 af protein kinase C (PKC) ophæver sin evne til at binde til Raf og hæmme nedstrøms MAP-kinase signalering [31]. Vi undersøgte, om phosphorylering af RKIP af

H. pylori

var PKC-afhængig. AGS celler blev inficeret med

H. pylori

i 6 timer i nærvær eller fravær af 40 uM Bisindolylmaleimide (Bis, en PKC-inhibitor). Vores resultater indikerer, at niveauerne af phosphoryleret RKIP blev inhiberet 3,9 gange og RKIP 1,36 gange efter

H. pylori

infektion i nærvær af PKC-inhibitoren, hvilket antyder, at RKIP phosphorylering af

H. pylori

indebærer, men måske ikke helt afhængig af, at PKC-regulerede vejen (fig. 1B).

IL-6 inducerer Phosphorylering af RKIP og

H. pylori

aktiverer STAT3

Da der er et omvendt forhold mellem RKIP og STAT3 udtryk i mavekræft prøver [19], vi vurderet om STAT3 og dens centrale regulator IL-6 [17] påvirker pRKIP udtryk. IL-6 behandling med en dosis på 25 eller 50 ng /ml forøgede niveauer af pRKIP protein 1,8 og 1,35 gange, henholdsvis og total RKIP proteinekspression faldt 0,8 og øget 1,05 gange, henholdsvis (fig. 2A). Phosphorylering af RKIP som respons på IL-6 var PKC-afhængig (data ikke vist). Disse data indikerer, at IL-6 også kan inducere phosphorylering af RKIP i gastriske celler, der kan opstå, til dels en PKC-afhængige vej.

(A) Western blot-analyse af AGS celler behandlet med de angivne koncentrationer af IL-6 og i 6 timer. Densitometri blev udført, og for pRKIP ekspression, vore resultater indikerer en 1,8 fold incerase af pRKIP (gennemsnitlig intensitet 0,59 vs 1.051) i celler behandlet med 25 ng /ml IL-6 og en 1,35 ganges forøgelse (gennemsnit intensitet 0,59 vs 0,772) i celler behandlet med 50 ng /ml IL-6. For RKIP ekspression, vore resultater indikerer en 0,8 fold incerase af pRKIP (gennemsnitlig intensitet 0,69 vs 0,563) i celler behandlet med 25 ng /ml IL-6 og en 1,05 ganges forøgelse (gennemsnit intensitet 0,69 vs 0,745) i celler behandlet med 50 ng /ml IL-6, når normaliseret til actin på hvert tidspunkt. (B) Western blot-analyse af AGS samdyrket med

H. pylori

undersøgt for pY705 STAT3 for de angivne tidspunkter; (C) STAT3 luciferase reporter transkriptionel assay af AGS-celler co-dyrket med

H. pylori på

den angivne MOI; (D) STAT3 luciferase reporter assay af AGS-celler transient transficeret med STAT3 i 24 timer og co-dyrket med

H. pylori

og /eller behandlet med IL-6 i 6 timer. En parret t-test blev udført for at analysere stigningen eller faldet i STAT3 transkription af eksperimentelle prøver sammenlignet med tom vektor (EV): * IL-6, s 0,0003; ** STAT3, p 0,009; ***

H. pylori

p 0,0005; **** STAT3 og

H. pylori

p. 0.0000023

makrofager release cytokiner, herunder IL-6 under

H. pylori

infektion [34] fører til STAT3-aktivering [17]. For at undersøge effekten af ​​

H. pylori

infektion på aktiveringen af ​​STAT3 blev AGS celler transient transficeret med en IRF-1 reporterkonstruktion [18] og co-dyrket med

H. pylori

ved den angivne række infektionsmultiplicitet (MOI) i 24 timer. Vores resultater viste, at ved en MOI mellem 10-200:1,

H. pylori

var i stand til at inducere STAT3 transkription (fig. 2C) og STAT3 pY705 phosphorylering (fig. 2B) inden 6 timer for infektion. Derefter bestemte vi, om IL-6 også kunne stimulere STAT3 transskription i AGS-celler. AGS-celler blev transient transficeret med IRF-1 og med EV og eller c-myc-tagget STAT3 og derefter efter 24 timer celler behandlet med enten IL-6 (50 ng /ml) eller co-dyrket med

H. pylori på

MOI på 100:1. Resultaterne, vist i fig. 2D, viser, at IL-6 (p 0,0003) og

H. pylori

(p 0,0005) blev hver i stand til signifikant at stimulere STAT3 transkription, en effekt, der blev forstærket, da AGS-celler blev transficeret med STAT3 og inficeret med

H. pylori

(p 0,0000023). Styrkelsen af ​​STAT3-aktivering blev øget betydeligt, når AGS celler co-behandlet med IL-6 og

H. pylori

sammenlignet med behandling med IL-6 (p 0,000028) eller

H. pylori

(p 0,0003). alene

Phosphoryleret RKIP inducerer sin egen Transskription

Vi brugte en RKIP luciferase reporter assay for at undersøge virkningerne af

H. pylori

infektion på RKIP transkriptionel aktivitet.

H. pylori

markant øget RKIP transskription (p 0,002) med en større end 10-dobling forekommer med RKIP overekspression og en mere end 16-dobling med kombinationen af ​​

H. pylori

og RKIP (p 0,0003) (fig 3A.) sammenlignet med ubehandlede AGS celler transficeret med tom vektor. Der var en signifikant stigning (p 0,0001) i RKIP transskription med

H. pylori

infektion og RKIP overekspression sammenlignet med celler transficeret med RKIP uden infektion (fig. 3A). Vi gentog disse eksperimenter i nærvær af bis til at inhibere PKC-aktivitet til bestemmelse af forøgelsen i RKIP transkription skyldtes phosphorylering. I nærvær af PKC-inhibitoren,

H. pylori

øget RKIP transskription og RKIP overekspression resulterede også i forøgelsen af ​​RKIP promotor-aktivitet. Bis formindsket RKIP transkription induceret af RKIP overekspression og

H. pylori

infektion større end 4 gange, sammenlignet med celler i med RKIP overekspression og foreslår, at disse virkninger var afhængige RKIP phosphorylering (fig. 3A). Vi undersøgte lokalisering af RKIP efter

H. pylori

infektion. Immunoblotting subcellulære AGS celler fraktioner viste, at pRKIP er lokaliseret til kernen, mens RKIP forbliver hovedsagelig i cytosolen efter infektion, (fig. 3B). Tilsammen udgør disse data indebærer, at

H. pylori

kan fremme translokationen af ​​pRKIP ind i kernen, hvor den kan aktivere RKIP transkription.

(A) RKIP transskription reporter assay af AGS-celler transient transficeret med RKIP luciferase-konstruktion og HA-RKIP i 24 timer, derefter co-dyrket med

H. pylori

i 12 timer i nærvær eller fravær af PKC-inhibitoren. I sammenligning med tomme vektor kontrol, blev relative transkriptionsaktivitet steget betydeligt for *

H. pylori

, s 0,002; og **

H. pylori

+ RKIP, P 0,0003. Sammenligning af tab af relativ luciferaseaktivitet af

H. pylori

RKIP sammenlignet med

H. pylori

, RKIP og Bis, s 0,0004. Data repræsenterer middelværdien +/- standardafvigelse (SD) af folden stigning i forhold til tom vektor kontrol i 2 uafhængige eksperimenter blev udført to gange. (B) Western blot-analyse af kerner og cytosol fraktioner af AGS-celler co-dyrket med

H. pylori

i 4 timer til ekspression af pRKIP og total RKIP. Actin og lamina giver verifikation af succesfulde cytoplasmatisk og nuklear fraktion adskillelse.

H. pylori

induceret RKIP Phosphorylering Afhænger

H. pylori s cag

Patogenicitet Island og RKIP Serine 153

For at vurdere betydningen af ​​specifikke

H. pylori

faktorer i fosforylering af RKIP, vildtype

H. pylori

isogene mutanter mangler hele cag

PAI eller

oipA

gen blev co-dyrket med AGS celler i 6 timer.

H. pylori

mutant mangler KAG

PAI

ikke var i stand til at fremkalde RKIP fosforylering, mens vildtype pletten og

oipA

mutant stærkt induceret RKIP fosforylering (fig. 4A). Den samme tendens blev observeret på STAT3 pY705. Disse resultater antyder, at gener i

H. pylori s Salg cagPAI er nødvendige for induktionen af ​​RKIP og STAT3 phosphorylering.

Western blot-analyse af (A) AGS celler co-dyrket med

H. pylori

stammer til 6 timer og undersøgt for de angivne proteiner. C = kontrol (uinficeret), WT = AGS celler inficeret med vildtype

H. pylori

i 6 timer,

PAI Y – og

oipA

– repræsenterer isogene mutanter mangler disse gener. (B) AGS celler forbigående transficeret i 24 timer med RKIP S153 cDNA eller 24 timer og co-dyrket med

H. pylori

i 6 timer. (C) RKIP luciferase reporter assay af AGS-celler transient transficeret med S153V RKIP i nærvær eller fravær af

H. pylori

infektion. I sammenligning med tom vektor kontrol, blev den relative aktivitet af RKIP transkription øges ved: *

H. pylori

, s 0,002; ** RKIP, p 0,002; *** S153V, s 0,03, ****

H. pylori

RKIP, s 0,0005; *****

H. pylori

S153V, s 0,003. **, RKIP transkriptionsaktivitet blev signifikant reduceret af S153V sammenlignet med vildtype RKIP konstruere som reaktion på

H. pylori, #

, s 0,0003. Dataene repræsenterer middelværdien +/- SD af 2 uafhængige forsøg udført i to eksemplarer.

For at undersøge om mutation af serin 153 påvirker

H. pylori

medieret RKIP phosphorylering og transkriptionel aktivering, AGS celler blev transient transficeret med en RKIP konstruere hvori serin blev substitueret med valin i stilling 153 (S153V) og derefter co-dyrket med

H. pylori

. Endnu engang observerede vi en større derefter 16 gange stigning i RKIP promotor-aktivitet i celler med RKIP overekspression og

H. pylori

infektion (p 0,0005). Men i celler transficeret med RKIP S153V før

H. pylori

infektion var der en 2,5 gange reduktion i transkriptionel aktivitet (p 0,0003) sammenlignet med

H. pylori

infektion i vildtype RKIP overekspression celler (fig. 4C). Desuden overekspression af S153V RKIP inhiberet

H. pylori

-medieret RKIP fosforylering (fig. 4B). Taget sammen indikerer disse resultater, at phosphorylering og transkriptionel aktivering af RKIP afhænger

H. pylori s

cagPAI og også af fosforylering af RKIP på S153.

H. pylori

Infektion Resultater i RKIP Nedbrydning og Induktion af Snail

Fordi øget RKIP transskription induceret af

H. pylori

infektion var ikke forbundet med øget steady state total RKIP proteinekspression, vi undersøgte, om

H. pylori

kan samtidig øge hastigheden af ​​nedbrydningen af ​​RKIP protein gennem proteasom-medieret nedbrydning, som tidligere foreslået [35]. MG132 øget RKIP proteinniveauer i nærvær eller fravær af

H. pylori

infektion, i overensstemmelse med

H. pylori

stigende proteasomalaktivitet RKIP nedbrydning (fig. 5A). Salg

AGS celler (A) behandles med MG132 og undersøgt for de angivne proteiner via Western blot-analyse. V betegner vehikel (DMSO) -kontrol. (B, C) Celler blev co-dyrket med

H. pylori

til de angivne tidspunkter og undersøgt for ekspression af Snail eller (D) målt for Snail mRNA ved real-time PCR ved de angivne tidspunkter efter

H. pylori

infektion.

En anden mekanisme, der kunne forklare den manglende ændring i RKIP protein eller mRNA-ekspression ville være transkriptionel repression af RKIP efter

H. pylori

infektion. Sneglen er en transkriptionsfaktor som spiller en vigtig rolle i EMT [23] samt bliver en kendt transskriptionsrepressor af RKIP i prostatacancerceller [25]. For at undersøge effekten af ​​

H. pylori

infektion på ekspressionen af ​​Sneglen og RKIP, AGS celler blev co-dyrket med

H. pylori på

en MOI på 100. Snail mRNA-ekspression blev kraftigt induceret efter 2-4 timers infektion (fig. 5D) Western blot-analyse viste, at

H. pylori

infektion resulterede i et tidsrum og dosisafhængig forøgelse af sneglen proteinniveauer (fig. 5B /C). Dette resultat er ikke i overensstemmelse med vores data på RKIP transskription efter

H. pylori

infektion (fig. 3), og foreslår, at

H. pylori

infektion kan i induktionen af ​​protein (er), der ville ophæve virkningen af ​​sneglen på RKIP transkription. Vi undersøger i øjeblikket muligheden af ​​massespektrometri analyse ved hjælp forældrenes og RKIP knockdown celler (fig. 6).

(A) Western blot analyse af AGS kortvarigt transficeret med RKIP i 24 timer og derefter inficeret med

H . pylori

i 6 timer. Densitometrianalyse for gennemsnittet af 2 uafhængige forsøg indikerede en 1,53 ganges forøgelse af apoptose (gennemsnitlig intensitet på 0,19 vs 0,295) i

H. pylori

inficerede celler; 2.1 fold stigning (gennemsnitlig intensitet på 0,19 vs 0,403) i celler transficeret med RKIP; en 2,6 fold stigning (gennemsnitlig intensitet på 0,19 vs 0,495) i celler inficeret med

H. pylori

og forbigående transficeret med RKIP når normaliseret til actin. Parallelt apoptose blev målt ved (B) flowcytometri. C) En ELISA baseret DNA fragmentation assay blev anvendt til måling af apoptose. Sammenlignet med tom vektor kontrol i (B) apoptose blev forøget med

* H. pylori

, s 0,0008; ** RKIP, p 0,003; ***

H. pylori

RKIP, s 0,0005. I (C) i forhold til tomme vektor kontrol, blev apoptose steg betydeligt med: *

H. pylori

, s 0.000063; ** RKIP, p 0,006;

*** H. pylori

RKIP, s 0,0007. Dataene for B og C repræsenterer middelværdien +/- SD af 2 uafhængige eksperimenter udført in duplo. (D) Western blot-analyse af AGS-celler inficeret med lentivirus at vælte RKIP ekspression før 6 timer infektion med

H. pylori

. CTR = inficerede AGS celler, HP = AGS celler inficeret med

H. pylori

, KD = AGS celler inficeret med lentivirus at knockdown RKIP, KD + RKIP AGS celler inficeret med lentivirus at knockdown RKIP og inficeret med

H. pylori

i 16 timer. (E) Apoptose (ved DNA-fragmentering ELISA) blev målt efter 16 timer af

H. pylori

infektion. Apoptose var signifikant forhøjet ved

H. pylori

i AGS celler * p 0,0007; og i AGS celler med RKIP knockdown, ** p 0,003 og blev reduceret sammenligne

H. pylori

-inficerede RKIP knockdown AGS celler med

H. pylori

-inficerede forældre AGS celler, # p 0,0006. De viste data repræsenterer middelværdien +/- SD af 2 eksperimenter udført tredobbelt.

RKIP Forhøjer

H. pylori

-medieret Apoptose

H. pylori

inducerer gastrisk epitelcelle apoptose [8]. Da RKIP kan fremme apoptose [29] undersøgte vi, om induktion af pRKIP efter

H. Som vist i fig.