PLoS ONE: Mulig rolle WDR3 Gene på Genome Stabilitet i kræft i skjoldbruskkirtlen Patients

Abstrakt

rolle

WDR3

gen i genom-ustabilitet er blevet evalueret i en gruppe på 115 differentieret thyroid cancer (DTC) patienter. Genomisk ustabilitet er blevet målt i henhold til svar af perifere blod-lymfocytter for ioniserende stråling (0,5 Gy). Svaret er blevet målt med mikronucleus (MN) test vurdere frekvensen af ​​binucleated celler med MN (BNMN), både før og efter bestråling. Ingen forskelle mellem genotyper, for BNMN frekvenser tidligere bestrålingen, blev observeret. Ikke desto mindre signifikante fald i DNA-skader efter bestråling blev observeret i individer bærer variant alleler for hver af de tre genotypede SNP’er: rs3754127 [-8,85 (-15,01

til

-2,70), P 0,01]; rs3765501 [-8,98 (-15,61

til

-2,36), P 0,01]; rs4658973 [-8,70 (-14,94

til

-2,46), P 0,01]. Disse værdier svarer til de, der opnås under antagelse af en dominerende model. Denne undersøgelse viser for første gang, at

WDR3

kan modulere genom stabilitet

Henvisning:. García-Quispes WA, Pastor S, Galofré P, Biarnés J, Castell J, Velázquez A, et al . (2012) Mulig rolle

WDR3

Gene på Genome Stabilitet i skjoldbruskkirtlen kræftpatienter. PLoS ONE 7 (9): e44288. doi: 10,1371 /journal.pone.0044288

Redaktør: Javier S. Castresana, Navarra Universitet, Spanien

Modtaget: 17. april, 2012; Accepteret: August 1, 2012; Udgivet: 26 september, 2012 |

Copyright: © García-Quispes et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Spanske for uddannelse og videnskab (SAF2007-6338) og Generalitat de Catalunya (CIRIT; 2009SGR-725). W. A. ​​García-Quispes blev understøttet af en predoctoral fællesskab fra Universitat Autónoma de Barcelona (PIF). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kromosom region 1p12 er blevet associeret til forskellige typer af kræft, herunder differentieret skjoldbruskkirtlen carcinom (DTC) [1], [2]. Tidligere undersøgelser foretaget af vores gruppe i denne region har fundet, at den

WDR3

gen, kortlagt i denne region, viser en signifikant sammenhæng med DTC, tyder på implikation i ætiologien af ​​kræft i skjoldbruskkirtlen [3].

der findes kun få oplysninger om den rolle,

WDR3

, men det er kendt, at den tilhører en familie af eukaryote gener bærer WD gentager [4]. WD gentagelser minimalt konserverede regioner på ca. 40 aminosyrer, typisk efterfølges af Gly-His og Trp-Asp, som kan lette dannelse af heterotrimere eller multiprotein komplekser. Siden WD-repeat proteiner ikke findes i prokaryote genomer, antages det, at nok de opstod i de umiddelbare forstadier til eukaryoter [5]. Proteiner tilhørende WD repeat familien er involveret i en række cellulære processer; herunder cellecyklusprogression, signaltransduktion, apoptose, og genregulering [6]. Med hensyn til

WDR3

gen, bør det nævnes, at det koder en nuklear protein på 943 aminosyrer indeholdende 10 WD gentager [4]. Dette gen er involveret i cellecyklus progression og signaltransduktion [7], og selv om den specifikke funktion af

WDR3

er ukendt, en rolle i ribosom biogenese er for nylig blevet rapporteret [8].

da ingen af ​​de funktioner tilskrives WDR3 kan specifikt forbundet med kræft i skjoldbruskkirtlen, vi hypotese, at det måske er involveret i mere generelle mekanismer opretholde genomisk stabilitet. Derfor variationer i

WDR3

funktion i forbindelse med eksistensen af ​​genetiske polymorfier kan generere genom ustabilitet, der kan resultere i en øget risiko kræft. I denne sammenhæng skal det angives, at ribosomale proteiner er blevet rapporteret at være også involveret i at opretholde genom integritet [9].

Selvom genomisk ustabilitet er en kompleks parameter, en generel karakteristik af personer, der viser sygdomme som Fanconis anæmi eller ataksi telangiectasia er en dårlig respons mod midler, der påvirker integriteten af ​​genomet, som det er tilfældet med ioniserende stråling (IR). Således er radiosensitivitet betragtes som en biomarkør for genomisk ustabilitet [10]. At afgøre, om en kandidat-gen er involveret i genomisk stabilitet det skal påvises, at celler, der bærer forskellige genetiske polymorfier er særligt følsomme foran IR handling.

Her vurderede vi forholdet mellem tre ikke-kodende enkelt nukleotid polymorfier af

WDR3

gen og hyppigheden af ​​mikronucleus, både spontan og efter IR eksponering. Undersøgelsen er gennemført i perifere blod-lymfocytter fra en gruppe af 115 DTC patienter, og niveauet af DNA-skader er blevet vurderet ved hjælp af cytokinese-blokken mikronukleusanalysen (CBMN), fordi det er en veletableret cytogenetisk teknik med mange fordele frem for andre cytogenetiske metoder. I den forbindelse skal det understreges, at det er blevet godt dokumenteret, at CBMN analysen er meget nyttigt som en markør for spontan og induceret DNA-skader [11] – [13].

Materialer og metoder

Etik erklæring

undersøgelsen blev godkendt af etik udvalg fra hospitalet Universitari Vall d’Hebron i Barcelona, ​​og Sygehus Universitari Doctor Josep Trueta i Girona (Spanien).

Befolkning studerede

undersøgelsen blev gennemført i alt 115 skjoldbruskkirtlen kræftpatienter, 93 (81%) kvinder og 22 (19%) mænd, rekrutteret fra både Hospital Universitari Vall d’Hebron i Barcelona, ​​og Sygehus Universitari Doctor Josep Trueta i Girona (Spanien). Den gennemsnitlige alder ved diagnose var 43,30 ± 15,07 (gennemsnit ± SD) år og 49,76 ± 16,49 når prøven blev opnået. Ifølge tumor-type, 99 (86%) af patienterne blev klassificeret som papillær og 16 (14%) som follikulært.

Blodprøver blev indsamlet før iod behandling (

131I), efter at have indhentet et skriftligt informeret samtykke fra alle patienter. Alle deltagere udfyldt et spørgeskema, der dækker standard demografiske spørgsmål, samt en kort erhvervsmæssig, medicinsk, og familiens historie. Den histologiske klassifikation af tumoren blev opnået fra de medicinske journaler. Alle deltagere underskrev en skriftlig tilladelse.

Cell kultur og behandling med IR

cytokinese-block mikronukleusanalysen (CBMN) blev udført ved hjælp af cytochalasin B teknik og efter en standardprocedure [14]. Blodprøver blev taget ved venepunktur og 0,5 ml hepariniseret blod blev fortyndet med 4,5 mL komplet dyrkningsmedium bestående af RPMI 1640, suppleret med 15% føtalt bovint serum, 1% antibiotika (penicillin og streptomycin) og 1% L-glutamin; alle kemiske blev opnået fra PAA Laboratories GmbH, Pasching, Østrig. Lymfocytter blev stimuleret til at dele med 1% phytohaemagglutinin (PHA) (Gibco San Diego, USA) umiddelbart efter behandlingen med IR.

Fire kulturer blev etableret for hver donor. To blev bestrålet med 0,5 Gy 137Cs y-stråler, mens de to andre forbliver ubehandlede. Bestråling blev udført på Unitat Tecnica de Protecció Radiologica (UTPR-UAB) i Universitat Autónoma de Barcelona. Dosis sats var 6.00 Gy min

-1. Lymfocytter (bestrålede og ikke-bestrålede) blev dyrket ved 37 ° C i 72 timer. Ved 44 timer efter PHA-stimulering, blev 10 pi (3 mg /ml) af cytochalasin B (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) tilsat til opnåelse af en slutkoncentration i kultur på 6 ug /ml. Kulturer blev holdt ved 37 ° C og 5% CO

2.

Cell høst og MN scoring

Celler blev opsamlet ved centrifugering (10 minutter ved 120 g). Supernatanten blev kasseret efter hver centrifugering. Den hypotonisk behandling udførtes tilsætning af 5 ml KCI 0,075 M ved 4 ° C i 10 minutter. Derefter blev cellerne centrifugeret, og en methanol /eddikesyre-blanding (03:01 v /v) blev forsigtigt tilsat. Denne fiksering trin blev gentaget to gange, og de resulterende celler blev resuspenderet i et lille volumen af ​​fikseringsopløsning. Lufttørrede præparater blev foretaget og objektglassene blev farvet med 10% Giemsa (Merck KGaA, Darmstadt, Tyskland) i phosphatbuffer (pH 6,8) i 7 min. Slides blev kodet af en person ikke er involveret i scoring.

For at detektere niveauet af genetiske skader, blev frekvensen af ​​binucleated celler med mikrokerner (BNMN) evalueret. En blindet scoring på 1000 binucleated celler pr prøve (bestrålet og ikke bestrålet) blev analyseret for at bestemme tilstedeværelsen af ​​mikrokerner, ifølge standard kriterier [14].

SNP valg

De polymorfier brugt i denne undersøgelse blev udvalgt efter vores tidligere analyser [3]. Således valgte vi tre tag SNPs viser haplotype association med kræft i skjoldbruskkirtlen, rs3754127 (C /T, 5 ‘nær gen), rs3765501 (G /A, intron) og rs4658973 (T /G, intron).

DNA-ekstraktion og SNP genotyping

DNA blev isoleret fra perifert blod ved hjælp af standard phenol-chloroform-metoden. Den SNP genotypning blev udført på Centro Nacional de Genotipado (CeGen) ved hjælp af IPLEX (Sequenom) teknik, og det blev genotype held ifølge kriterierne kvalitetskontrol af CeGen (https://www.cegen.org). For at sikre den genotype pålidelighed, blev 10% af prøverne tilfældigt udvalgt og dobbelt genotypebestemmes af replikater i flere plader med 96 brønde. Desuden blev to HapMap reference- trioer indarbejdet i plader og genotypen konkordans og korrekt Mendelsk nedarvning blev kontrolleret.

Statistisk analyse

Analysen af ​​forskelle, koblingsuligevægt og haplotype frekvens estimering blev udført ved hjælp af web værktøj til SNP analyse SNPStats [15]. Lineær regression model for dominant og co-dominant nedarvning blev udført. Alle analyser blev justeret for alder, køn og histologisk diagnose. Haplotype analyser blev udført ved hjælp af den samme web-værktøj. Haploview software [16] blev anvendt til at undersøge LD mellem SNP’er. Andre statistisk analyse blev udført ved hjælp af R-version 2.12.1 [17].

Resultater

Generelle karakteristika for de valgte DTC patienter er opsummeret i Materiale og metoder sektion. Som anført, at andelen af ​​kvinder var højere end for mænd, hvilket afspejler den højeste forekomst af DTC i kvinder. Derudover forhøjede forekomst af papillære thyreoideacancer indikerer overvægten af ​​denne histologiske subtype.

Tabel 1 viser, at middelværdien af ​​spontan BNMN frekvens i de 115 patienter var 6,87 ± 0,55 (gennemsnit ± SE). De BNMN værdier viste en stigning 4,6 fold (31.35 ± 1.5) efter udsættelse for 0,5 Gy ioniserende stråling med hensyn til de spontane niveauer. Disse forskelle mellem spontane og efter bestråling BNMN frekvens var, som forventet, statistisk signifikant (P 0,001). Selv middelværdien af ​​spontan BNMN var højere hos kvinder (7,19 ± 0,65) end hos mænd (5,51 ± 0,94) denne forskel ikke nå statistisk signifikans (P = 0,339). På den anden side, blev der ikke observeret nogen forskel mellem kvinder og mænd efter bestråling (31,19 ± 1,70 og 31,01 ± 3,11, henholdsvis P = 0,833).

De spontane BNMN værdier i undertype af patienter med papillær kræft i skjoldbruskkirtlen viste en lille, men ikke signifikant fald i sammenligning med den follikulære subtype (6,64 ± 0,57 og 8,31 ± 1,82, henholdsvis P = 0,559). Værdierne af BNMN efter bestråling hverken vist signifikante forskelle mellem de to undertyper (31,71 ± 1,50 og 29,13 ± 5,53; henholdsvis P = 0,553).

I figur 1 er det observeret god korrelation, der eksisterer mellem den spontane BNMN værdier og dem, der observeres efter bestråling (R

2 = 0,28, P 0,001). Dette ville indikere en underliggende genetisk årsag.

Vi har også evalueret celleproliferation kurs ved hjælp af cytokinese-blokerede proliferation indeks (CBPI). Den CBPI værdi angiver det gennemsnitlige antal cellecykler per celle [18]. Resultaterne (data ikke vist) indikerer et signifikant fald i CBPI i kulturer udsat for ioniserende stråling (P 0,001).

De forskelle og deres konfidensintervaller 95% blev beregnet ved lineær regression analyser bruge som reference homozygot genotype for den hyppigste allel, med justering for alder, køn og diagnoser. Tabel 2 viser de observerede på spontane BNMN værdier forskelle, afhængigt af de forskellige polymorfier, under hensyntagen til co-dominant model af arv. For den spontane BNMN frekvens blev fundet små forskelle mellem genotyper for alle de evaluerede polymorfier. Interessant nok i alle tilfælde BNMN værdierne var højere i reference- genotyper (homozygote for den fælles allel), men disse forskelle ikke opnå statistiske betydninger.

Haplotype analyse blev udført for de tre SNP’er i WDR3 og resultaterne er angivet i tabel 3. Tre haplotyper blev forudsagt til at have en frekvens 0,01. De øvrige haplotyper blev forudsagt at være for ulige for meningsfuld statistisk analyse. Der blev ikke observeret nogen signifikante forskelle for nogen af ​​de hyppigste haplotyper med de spontane BNMN værdier.

Midlerne til de BNMN frekvenserne var signifikant forskellige ved genotype blandt de tre

WDR3

polymorfier (tabel 4) . Vi observerede signifikant lavere gennemsnitlige BNMN frekvenser i overværelse af den mindre allel efter ioniserende stråling eksponering tyder en dominerende model af arv. For eksempel rs3754127 C /T-T /T genotyper viste en reduceret BNMN frekvens sammenlignet med CC individer (se tabel 4). Ligeledes har vi også fundet et fald i strålingsinduceret skade ved haplotype, når man kombinerer den mindre allel af hver af de tre genotypede SNP’er [-4,9 (-9,16

til

-0,63), P = 0,026] (se . tabel 5)

Når analysen blev udført stratificering befolkningen af ​​den type tumor på diagnosetidspunktet (follikulær eller papillær), viste den papillære undergruppe værdier efter bestråling, der svarer til den samlede befolkning: rs3754127 [-8.39 (-14,45 til -2,33), P 0,01]; rs3765501 [-8,83 (-15,37 til -2,29), P 0,01]; rs4658973 [-8,36 (-14,46 til -2,27), P 0,01], alle for den dominerende model. På den anden side, den observeret for den follikulære subtype efter bestråling virkning var højere end i papillær og i de samlede DTC patienter; men forskellene var ikke statistisk signifikante, sandsynligvis på grund af et lavt antal individer: rs3754127 [-27,78 (-55,54 til -0,02), P = 0,074]; rs3765501 [-28,67 (-62,46 til 5,12), P = 0,12]; rs4658973 [-29,10 (-60,26 til 2,06), P = 0,094], alle for dominerende model.

Diskussion

I denne undersøgelse har vi vist en signifikant sammenhæng mellem de tre udvalgte polymorfier af

WDR3

genet og niveauet af DNA-skader efter en behandling med IR. Dette tyder på en rolle WDR3 i opretholdelsen af ​​genomisk stabilitet.

WDR3

genet koder en nuklear protein indeholdende 10 WD gentager med ukendt funktion [4] og medlemmerne af denne store familie er strukturelt beslægtede, men funktionelt forskellige. Nogle af de cellulære funktioner eller veje, der reguleres af medlemmerne af denne familie omfatter genregulering, signaltransduktion, RNA behandling og splejsning, lymfocyt homing, regulering af cellecyklusprogression, celledeling /kromatin adskillelse, og celle /væv differentiering, blandt andet, som revideret [5], [6]. Men indtil nu er der ikke oplysninger om, en mulig involvering med reparationsmekanismer eller indflydelse, i vedligeholdelse af genomisk stabilitet for

WDR3

, eller til et medlem af sin familie.

Med sigte på at finde en fornuftig forklaring på sammenhængen observeret mellem

WDR3

polymorfier og DTC forekomst, har vi allerede rapporteret opregulering af

WRD3

i forskellige kræft i skjoldbruskkirtlen cellelinjer, hvilket tyder på dens mulige konsekvenser i skjoldbruskkirtlen cancer tumorigenese [3]. Dette er enig med de undersøgelser i brystet carcinom MCF-7, der viser, at undertrykkelsen af ​​

WDR3

reducere celleproliferation, formindske cellestørrelse og reducere foci dannelse, hvilket indikerer, at

WDR3

medfører en vækst og proliferativ fordel på cancerceller [8]. Den WDR3 protein omfordeles i kernen, når ribosom biogenese forstyrres. Cellular begivenheder synes at være påvirket af reguleringen af ​​ekspressionen af ​​

WDR3

ændre ribosom biogenese [8]. Nedsat kortvarige ændringer om niveauer for DNA-beskadigelse reparation proteiner (ikke-homolog endesammenbinding proteiner) er observeret hos nucleolus efter ioniserende stråling; Derfor synes det muligt, at disse ændringer afspejler en biologisk relevant respons på DNA dobbelt-strenget pause skader [19].

Vores resultater tyder på en sammenhæng mellem de mindre frekvens alleler for rs3754127, rs3765501, rs4658973 polymorfier og lavere værdier af DNA-skade efter behandling med ioniserende stråling. Selvom SNP’er der anvendes i vores undersøgelse ikke producerer ændringer af aminosyrer i proteinsekvensen, er det kendt, at ikke-kodende single-polymorfismer kan ændre genekspression [20]. Modifikationer nær promotorsekvensen (rs3754127) kan afbryde den korrekte interaktion med transkriptionsfaktorer skiftende helt genekspressionen eller påvirke niveauet af ekspression [21]; dette betyder, at transkriptionen af ​​WDR3 kunne afhænge af genetiske varians ved dets promotorregion. Selv alternativ splejsning, på grund af tilstedeværelsen af ​​SNP’er, sandsynligvis forekomme [22], [23], skal det bemærkes, at alternative transkripter også induceres af ioniserende stråling [24]. Således kan polymorfier ved rs3765501 og /eller rs4658973 også påvirke alternativ splejsning, ikke kun på grund af dets tilstedeværelse, men også af yderligere eller forskellige virkninger med ioniserende stråling effekter. Alternativt kan enhver af disse polymorfier være ansvarlig for nedgangen i DNA-skader efter IR, men de fungerer som genetiske markører for genetiske varianter af WDR3 direkte involveret i WDR3 genomisk stabilitet.

De observerede effekter, indikerer inddragelse af

WDR3

at opretholde genomisk stabilitet efter eksponering for IR, er enig med foreningen fundet med DTC og med den rolle tilskrives ribosomet biogenese. Således ville ændringer i ekspressionen af ​​

WDR3

forstyrre signalveje, der eksisterer mellem ribosom biogenese og p53-aktivering [8]. Alle disse resultater helt antyder en vigtig rolle af

WDR3

i at bevare genom stabilitet samt i carcinogenese og cellecyklus regulering. Interessant, foreløbige resultater med kolon kræftpatienter (V. Moreno, personlig kommunikation) tyder på en ændret udtryk for

WDR3

i tyktarmskræft, støtte vores opfattelse, at foreslå en rolle WDR3 i genomisk stabilitet og kræft. Vores data er interessante nok til at foretage yderligere undersøgelser i

WDR3

genekspression at bekræfte denne hypotese.

Tak

Vi takker alle fag, der deltager i denne undersøgelse, samt til medlemmerne af Nuclear Medicine service, Hospital Vall dHebron (Barcelona) og endokrinologi enhed Hospital Josep Trueta (Girona) for at give patient blodprøver.