PLoS ONE: Forskelle i Nemosis Reaktion af normal og kræft-associerede fibroblaster fra patienter med Oral pladecellecarcinom

Abstrakt

Baggrund

Tumor-stroma reaktion er forbundet med aktivering af fibroblaster. Nemosis er en hidtil ukendt type af fibroblast-aktivering. Det fører til en øget produktion af vækstfaktorer og proinflammatoriske og proteolytiske proteiner, mens de på samme tid cytoskeletproteiner nedbrydes. Her brugte vi parret normal hud fibroblaster og cancer-associerede fibroblaster (CAF) og primær og tilbagevendende oral pladecellekræft (SCC) celler til at studere nemosis respons.

vigtigste resultater

fibroblast nemosis var analyseret af protein og genekspression og parakrin regulering med kolonidannelse assay. En af de normale fibroblast stammer, FB-43, opreguleret COX-2 i nemosis, men FB-74-celler ikke gjorde. I modsætning hertil CAF-74 sfæroider udtrykte COX-2, men CAF-43-celler ikke gjorde. Alpha-SMA-protein blev udtrykt i både CAF-stammer og i FB-74-celler, men ikke i FB-43 fibroblaster. Dets mRNA niveauer blev nedreguleret i nemosis, men CAFS begyndte at genvinde udtrykket. FSP1 mRNA blev nedreguleret i normale fibroblaster og CAF-74-celler, men ikke i CAF-43 fibroblaster. Serinprotease FAP blev opreguleret i alle fibroblaster, mere så i nemotic CAF. VEGF, HGF /SF og FGF7 mRNA niveauer blev opreguleret til variabel grad i nemosis. CAF forøgede kolonidannelse af primære tumorcellelinier UT-SCC-43A og UT-SCC-74A, men normale fibroblaster hæmmede forankringsuafhængig vækst af recidiverende UT-SCC-43B og UT-SCC-74B celler.

konklusioner

Nemosis respons, som observeret af COX-2 og vækstfaktor induktion, og ekspressionen af ​​CAF markører a-SMA, FSP1 og FAP, varierer mellem fibroblast befolkninger. Udtrykket af CAF markører er forskellig mellem normale fibroblaster og CAF i nemosis. Disse resultater understreger heterogenitet af fibroblaster og de skiftende tumorfremmende egenskaber af CAF

Henvisning:. Räsänen K, Virtanen I, Salmenperä P, Grenman R, Vaheri A (2009) Forskelle i Nemosis Reaktion af normal og Kræft-associeret fibroblaster fra patienter med Oral pladecellecarcinom. PLoS ONE 4 (9): e6879. doi: 10,1371 /journal.pone.0006879

Redaktør: Immo A. Hansen, New Mexico State University, USA

Modtaget: 9. juni 2009; Accepteret: August 6, 2009; Udgivet 1. september, 2009

Copyright: © 2009 Räsänen et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra finsk Kulturfond, Magnus Ehrnrooth Foundation, den finske Diabetes Research Foundation, EVO Research Grant, finsk Cancer Organisationer og Finlands Akademi. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

tumor mikromiljø spiller en stor rolle i cancer progression og fibroblaster er kendt for at være centrale elementer i tumoren stroma. Det er for nylig blevet foreslået, at stromale fibroblaster oprindeligt inhibere tidlige stadier af carcinogenese og senere under parakrine indflydelse af den transformerede epitel bliver aktiveret fører til fremme af vækst cancer. Afhængigheden af ​​carcinomer af stromale fibroblaster falder som kræft skrider frem, dels gennem en switch i epitelceller fra parakrin til autokrine regulering [1], [2]. Blandt de aktiverede fibroblaster er cancerassocierede fibroblaster (CAF), der er kendetegnet ved øget mitotisk indeks, mutationer i tumorsuppressorgener, såsom p53 og efter forøget sekretion af vækstfaktorer, kemokiner og komponenter i ekstracellulær matrix (ECM) [2], [3], ændringer som alle er involveret i invasion og tumorvækst [4] .Widely brugte CAF markører indbefatter α-glatmuskelactin (α-SMA), fibroblast specifikt protein 1 (FSP1, også kendt som S100A4) og fibroblast aktiverede protein (FAP, også kendt som seprase) [5]. a-SMA, en komponent af cytoskelettet, er den oftest anvendte markør for aktiverede fibroblaster. Det bliver inkorporeret i stress fibre derved forøgende den kontraktile aktivitet af fibroblaster [6]. FSP1 tilhører S100 super-familien af ​​calcium-bindende proteiner. Det fremmer tumorvækst ved at regulere cellecyklusprogression og cytoskelet integritet [7]. FAP er en serinprotease, der ikke udtrykkes i normale voksne væv, men dets ekspression induceres i aktiverede fibroblaster reagerer på sårheling og tumor-stroma reaktion [8]. Det er imidlertid velkendt, at fibroblaster er heterogene [9], [10], og at CAF forskelligt udtrykke disse markører [11], [12].

Nemosis, et fænomen af ​​fibroblast aktivering (for review se Vaheri et al. 2009 [13]), er tidligere blevet undersøgt ved hjælp af normale dermale fibroblaster [14] – [19]. Dannelse af en fibroblast sfæroid forårsager utal af gener, der skal udtrykkes forskelligt i disse aktiverede fibroblaster. To forskellige mønstre kan findes i udtrykket: i) ekspression af vækstfaktorer og proteolytiske og proinflammatoriske proteiner stigninger og ii) ekspression af cytoskeletale komponenter reduceres. Baseret på tidligere offentliggjorte resultater, cyclooxygenase-2 (COX-2), er der vides at være associeret med inflammation og tidlige stadier af carcinogenese, og hepatocytvækstfaktor /spredningsfaktor (HGF /SF), som har vist sig at fremme tumorcelle invasiv, er blevet anset kendetegnende proteiner af nemosis. Spontan gruppering af fibroblaster i spheroids kan også fremkaldes af tumorceller medium [14], [15]. Vi har tidligere vist, at dyrkning fibroblast sfæroider under indflydelse af godartede HaCaT keratinocyter inhiberer nemosis, som set af undertrykt ekspression af COX-2, hvorimod maligne HaCaT celler har en nemosis-fremmende virkning på normale fibroblaster, manifesteret som forbedret opregulering på COX-2 HGF /SF og VEGF (vaskulær endotel vækstfaktor) [17].

Hoved og hals pladecellecarcinom (HNSCC) er den sjette mest almindelige malignitet verdensplan og den gennemsnitlige patientoverlevelse er dårlig. Dette skyldes primært høje cancertilbagefald og lokal invasion, delvist forårsaget af p53 genmutationer, som kan findes i mere end 70% af HNSCCs [20], [21]. Kirurgi og strålebehandling er de mest almindeligt anvendte linjer af behandling og i øjeblikket den eneste godkendte molekylære målrettet terapi for hoved og halscancer er cetuximab (Erbitux, ImClone Systems Inc., New York, NY), et monoklonalt antistof inhibitor af epidermal vækstfaktor receptor ( EGFR). Men ikke alle HNSCC patienter gavn af EGFR-målrettet terapier, eftersom overekspression, men ikke mutation synes at bestemme behandlingsrespons. Fase 3 forsøg for HNSCC er i øjeblikket i gang for at målrette VEGF (Bevacizumab, monoklonalt antistof-hæmmer) og for p53 (INGN 201, genterapi) [22], [23]. Et andet potentielt mål er COX-2, der har vist sig at være forhøjet i oral pladecellecarcinom (OSCC) og har vist sig at nedsætte tumor radiosensitivitet [24]. Undersøgelser med matchede patient cellestammer har vist, at der er en sammenhæng i radiosensitivities mellem OSCC celler, dermale fibroblaster og kræft-associerede fibroblaster indsamlet fra det samme individ, og at disse individuelle forskelle i radiosensitivitet kan forudsige udfaldet af strålebehandling [25], [ ,,,0],26].

Baseret på de tidligere resultater, som under indflydelse af maligne celler normale nemotic fibroblaster begynder at ligne CAF, formålet med dette arbejde var at undersøge nemosis respons af autologt hud og cancerassocierede fibroblaster, til sammenligne ekspressionen af ​​CAF markører mellem disse fibroblaster stammer og deres skæbne i nemosis og at undersøge, hvordan disse forskellige fibroblast befolkningsgrupper påvirke patient-matchede orale SCC celler. Vores undersøgelse viser, at både normale og cancer-associerede fibroblaster viser variation mellem individer, set som varierende basale CAF ekspressionsniveauer og forskellige vækstfaktorresponser i nemosis, og har en differentiel effekt på SCC-celler. Opførslen af ​​de undersøgte CAF markører i nemosis fulgte den generelle nemosis svar: cytoskeletal α-SMA og FSP1 blev nedreguleret og proteolytisk FAP blev opreguleret. Den eneste undtagelse var en af ​​de CAF stammer, opreguleres FSP1 i nemosis. Større systematiske forskelle mellem normale og cancer-associerede fibroblaster blev den nedsat basale niveauer af vækstfaktorer i CAF og evnen til nemotic CAF til at begynde at genvinde α-SMA udtryk og den øgede FAP udtryk i nemosis forhold til deres normale kolleger.

Resultater

Forskellige fibroblast befolkninger vise forskelle i respons på nemosis

først ønskede vi at undersøge ekspressionen af ​​den tidligere anvendte nemosis markør COX-2 i de fire fibroblast befolkninger. Der var ingen basal ekspression af COX-2 i et af de fibroblast-stammer, og det ikke blev induceret i monolagskultur. Men når de dyrkes som sfæroider de normale fibroblaster FB-43 begyndte at udtrykke COX-2 efter 48 timer (figur 1A), men dette blev ikke set i de andre normale fibroblaster stamme FB-74 (figur 1C). Modsatte resultater blev set med kræft-associerede fibroblaster, hvor ingen COX-2 blev udtrykt i CAF-43 fibroblast sfæroider (Figur 1B), men de CAF-74 celler begyndte at udtrykke COX-2 efter 24 timer (Figur 1D). Disse resultater afviger fra tidligere offentliggjort, og indikerer, at COX-2 ikke kun bør anvendes til at måle nemosis respons.

Fibroblaster blev dyrket som sfæroider eller monolag til det angivne tidspunkt. (A) FB-43 sfæroider begyndte at producere COX-2 efter 48 timer og ingen α-SMA blev produceret, hvorimod CAF-43-celler (B) ikke inducerede COX-2, men udtrykte α-SMA. Både FB-74 (C) og CAF-74 (D) fremstillet α-SMA, men COX-2 blev først induceret i CAF-74 sfæroider. Alle fibroblaster typer udtrykte lige store mængder af vimentin. (E) Alle UT-SCC celler udtrykte COX-2, men kun 74A og 74B viste induceret p53 niveauer.

Vi så også på protein niveauer af vimentin og α-SMA i disse celler. Alle fire fibroblast populationer udtrykt vimentin i lige store mængder, som forventet, eftersom fibroblaster

in vitro

anses for at være i en tilstand der ligner den sårheling. Begge CAF-stammer udtrykte α-SMA, CAF-74 lidt mere end CAF-43. Interessant, også de normale FB-74 celler udtrykte α-SMA, men intet protein-ekspression blev detekteret i andre normale fibroblast celle stamme FB-43. Tidsafhængig nedregulering af α-SMA blev set i sfæroider men ikke i monolagskulturer, forårsaget af nedbrydningen af ​​cytoskeleton i disse fibroblaster gennemgår nemosis. Dette er i overensstemmelse med tidligere resultater ved Bizik et al. [14], hvor faldende actinniveauer blev anvendt som en markør for sfæroide nedbrydning. GAPDH blev anvendt som en loading kontrol.

Figur 1E er et immunoblot af de fire UT-SCC carcinoma cellelinier. Alle af dem udtrykte COX-2, men interessant kun UT-SCC 74A og 74B havde en induceret p53-protein-niveau, hvilket antyder en p53 mutation. Vi kunne ikke finde p53 i nogen af ​​fibroblast befolkninger, en forestilling om, at tilslutter rapporten fra Qiu et al. [27], hvor de ikke kunne opdage somatiske genetiske ændringer i CAF.

Forskellige udtryk for CAF markører i fibroblast stammer

Da protein niveauer af α-SMA varierede mellem forskellige fibroblast befolkninger, vi besluttede også at undersøge ekspressionen af ​​andre udbredte CAF markører FSP1 og FAP. Genekspressionsmønster af disse tre gener i fibroblaster dyrkes som sfæroider i 0, 24, 48 og 72 timer blev analyseret ved anvendelse af kvantitativ realtids-PCR. Q-PCR blev valgt som metode frem immunoblotting grund af den højere følsomhed. GAPDH blev anvendt som en reference gen, ekspressionen af ​​målgener blev normaliseret til, hvorefter relative fold ekspression forhold blev beregnet. Det basale ekspressionsniveau af α-SMA, FSP1 og FAP var signifikant lavere (P 0,01) i CAF-43 celler end i normale FB-43 fibroblaster (figur 2A). Men som det ses i figur 2B, dette var ikke tilfældet med CAF-74 fibroblaster, hvor sammenlignet med FB-74 celler α-SMA-ekspression forholdet var lig, FSP1 1.4 gange højere og FAP ekspression forholdet overraskende 10 gange højere (P 0,01)

Gen-ekspression af CAF markører blev undersøgt ved hjælp af Q-PCR.. (A) α-SMA, FSP1 og FAP ekspressions-forhold var signifikant lavere (P 0,01) i CAF-43 celler sammenlignet med FB-43-celler, men lig med eller højere i CAF-74 fibroblaster. (B) Når dyrkes som sfæroider alle fibroblaster nedreguleret α-SMA udtryk, men CAF begyndte at genvinde udtrykket på 72 timer (P 0,05 i FB-43 vs. CAF-43 og i FB-74 vs. CAF-74) ( C) FSP1 blev nedreguleret i normale fibroblaster og i CAF-74 celler, men ikke i CAF-43-celler, (D) og FAP blev opreguleret i alle cellelinier går gennem nemosis, mest i CAF (P 0,05 i 72 timer CAF -43 sammenlignet med 72 h FB-43). Kolonner: middelværdi; fejlsøjler; SEM.

Nemosis respons af CAF markører mellem disse fibroblast populationer viste også variation. Den α-SMA-niveauet blev drastisk nedreguleret i sfæroider, afspejler de proteinniveauer og indikerer nedbrydningen af ​​cytoskeleton i disse sfæroider. Dette var også tilfældet for FB-43 celler, som vi ikke kunne opdage proteinekspression. Afviger fra de normale fibroblaster, CAFS begyndte at genvinde α-SMA-ekspression efter 72 timer; sammenlignet med normale fibroblaster stigningen var statistisk signifikant (P 0,05) (Figur 2C). FSP1 mRNA faldt som forventet i både normale fibroblast cellestammer og i CAF-74-celler, men overraskende steg i CAF-43 sfæroider (Figur 2D). Den tredje CAF markør FAP blev induceret i nemosis i alle fibroblast populationer, følge den generelle nemosis fingeraftryk. Denne induktion var højere i CAF spheroids end i normale fibroblast sfæroider (P 0,05 i CAF-43 vs. FB-43, ikke statistisk signifikant i 73 celler på grund af høj variation mellem prøver) (Figur 2E)

. differentiel ekspression af vækstfaktorer i normale og cancer-associerede fibroblaster

den anden kendetegnende for nemosis er den øgede produktion af flere vækstfaktorer, herunder VEGF, HGF /SF og FGF7 (KGF). Derfor har vi brugt Q-PCR for at studere ekspressionsniveauerne af disse gener i de fire fibroblast populationer. Begge CAF-stammer havde lavere basale ekspressionsniveauer af VEGF, HGF /SF (P 0,05) og FGF7 (P 0,01) mRNA sammenlignet med de parrede normale fibroblaster (figur 3A og 3B). Når der dyrkes som sfæroider alle fire fibroblast populationer viste opreguleret VEGF, HGF /SF og FGF7 mRNA-ekspression. VEGF-induktion var højest i CAF-74-celler (over 15 gange) (figur 3C), hvorimod højeste HGF /SF-induktion blev set i CAF-43-celler (over 30 gange) (figur 3D). FGF7 niveauer blev reguleret lidt anderledes; løbet blev observeret seks gange induktion i FB-43 celler, andre celler havde et gennemsnit på 5-fold induktion, og interessant i CAF-74 celler ved 72 timer tidspunkt denne induktion var kommet ned til 2,5 gange (figur 3E) .

vækst faktor genekspression blev undersøgt under anvendelse af Q-PCR. (A og B) Både CAF cellelinier havde reduceret ekspression af HGF /SF (P 0,05) og FGF7 (P 0,01) og alle tre vækstfaktorer blev opreguleret i varierende grad i nemosis (C – VEGF, D – HGF /SF og E – FGF7). Kolonner: middelværdi; fejlsøjler; SEM.

parakrin regulering mellem fibroblaster og SCC celler

Anchorage-uafhængig vækst af UT-SCC carcinom cellelinjer blev testet ved hjælp af soft-agarose assay. Under den tre uger observationsperiode dannede alle fire carcinomcellelinjer kolonier, men klar forskel mellem primære og tilbagevendende tumorcellelinier blev set (figur 4). Når dyrket alene, både tilbagevendende tumorcellelinier UT-SCC-43B og UT-SCC-74B dannet dobbelte mængde af kolonier i forhold til primære tumorcellelinier UT-SCC-43A og UT-SCC-74A; forskellen var statistisk signifikant i begge tilfælde (P 0,05). Den underliggende monolag af normale fibroblaster FB-43 og FB-74 steg svagt antallet af 43A og 74A carcinom cellekolonier hhv. Stigning i kolonidannende numre steg yderligere da 43A og 74A SCC-celler blev dyrket under indflydelse af CAF-43 og CAF-74 (P 0,05), hhv. Interessant, når dyrkning af de mere invasive 43B og 74B SCC-celler med FB-43 og FB-74 fibroblaster, var et fald i antallet af kolonier set; denne effekt var mere udtalt med 74B celler (P 0,05 i FB-74 i forhold til kontrol). CAF-43 og CAF-74 fibroblaster restaureret antallet af kolonier til samme niveau som kontrol, men ikke yderligere at styrke kolonien dannelsen af ​​tilbagevendende SCC celler.

UT-SCC kolonidannelse blev undersøgt med soft-agarose assay . Alle UT-SCC celler dannede kolonier i blød agarose, tilbagevendende SCC (B og D) dobbelt så mange som primære SCC celler (A og C) (P 0,05). Normale fibroblaster øget antallet af kolonier af primære carcinomaer celler, og dette blev yderligere udvidet med CAF-celler (P 0,05) (A og C). Tilbagevendende SCC celle kolonidannelse blev inhibere med normale fibroblaster (P 0,05 i FB-74 sammenlignet med kontrol) og gendannet til at styre niveauet af CAF (B og C). Kolonner: middelværdi; fejlsøjler; SEM

UT-SCC kolonidannelse resultaterne var i overensstemmelse mellem celler opnået fra de to individer.; der var imidlertid variation mellem individer Ved observation af underliggende monolag fibroblastkulturer nøje. Spontan sfæroid dannelse blev set i den underliggende monolagskultur af FB-43 og CAF-43 fibroblaster når samdyrket med både 43A og 43B SCC-celler (figur 5A-D). FB-74 og CAF-74 ikke spontant danner sphæroider under nogen af ​​de ovennævnte betingelser, men de vokser hurtigere, når co-dyrket med flere maligne 74B celler (figur 5G-H). Fig 5I-J viser den spontane sfæroid dannelse af 43 fibroblaster med 43A og 43B SCC-celler. Med begge UT-SCC cellelinier, CAF-43-celler dannede signifikant flere sfæroider end FB-43 fibroblaster (P 0,05). De to forskellige SCC cellelinier ikke signifikant indflydelse på fibroblast klumpformet formation; selv om en lille stigning sås i CAF-43 sphæroider med tilbagevendende 43B SCC celler. Ingen af ​​fibroblast typer (FB-43, CAF-43, FB-74 og CAF-74) dannede kolonier i blød agarose.

Repræsentative billeder af underliggende fibroblast monolagskulturer. Spontan clustering (pile) ses i FB-43 og CAF-43-celler under indflydelse af parrede SCC-celler 43A (A og B) og 43B (C og D). I modsætning hertil FB-74 (E og G) og CAF-74 (F og H) dannede ikke sfæroider. Scale bar 60 pm. Antallet af dannede sfæroider blev beregnet ud fra monolag fibroblastkulturer (I og J). CAF-43-celler dannede signifikant flere sfæroider end FB-43-celler (P 0,05). Kolonner: middelværdi; fejlsøjler; SEM.

For at belyse årsagen til den forskellige adfærd fibroblast pres på monolagskulturer, og især den langsomme vækst i CAF-74 celler, vi udførte ældning-associeret beta-galactosidase (SA- p-gal) farvning. SA-β-gal-aktivitet er den mest almindeligt anvendte markør for cellulær ældning. For tidlig stressinduceret senescens er forårsaget af oxidativ stress, DNA-skader og onkogen aktivering [28]. Som forventet viste CAF-74 celler stærke SA-β-gal-farvning. CAF-43 fibroblaster blev samt positive, men CAF-74 havde betydeligt mere (P 0,01). Aldrende celler (figur 6)

Repræsentative billeder af fibroblast monolagkulturer farvet for SA-β-gal-aktivitet. FB-43 (A) og FB-74 (C) viser ringe eller ingen farvning; CAF er positive (B og D). Scale bar 200 pm. CAF-74 havde betydeligt mere (P 0,01) SA-β-gal-celler i forhold til CAF-43 (E). Kolonner: middelværdi; fejlsøjler; SEM.

Diskussion

Primære carcinomer anses for at være uorganiserede organer, der er sammensat af forskellige celletyper, herunder kræftceller, fibroblaster og andre mesenkymale celler, og celler, i relation til immunitet og kar. Tumor-stroma mikromiljø fører til fibroblastaktiveringsprotein og parakrin signalering mellem fibroblaster og cancerceller [29]. I nemosis, aktiverede fibroblaster begynde at producere proteiner involveret i inflammation, proteolyse og cancer progression og samtidig nedregulere ekspressionen af ​​cytoskeletale proteiner [14] – [19].

Formålet med dette arbejde var at undersøge den nemosis respons patient-matchede normale og cancer-associerede fibroblaster, og at studere udtrykket mønster af CAF markører og deres adfærd i nemosis. Kun én af de normale fibroblast-stammer (FB-43) og en af ​​CAF (FB-74) induceret COX-2 i nemosis. Dette er i modsætning til tidligere offentliggjorte resultater, hvor COX-2-induktion er blevet betragtet kendetegnende træk ved nemosis. Men i disse undersøgelser fibroblaster have været fra neonatal oprindelse og her har vi brugt fibroblaster opnået fra voksne. Denne modstridende resultat indikerer derfor, at COX-2 ikke kun bør anvendes til at måle nemosis svar, men andre markører, såsom profilen af ​​udskilte proteiner, bør undersøges så godt.

Den anden centrale element i nemosis er den tidsafhængige nedbrydning af cytoskeleton. På proteinniveau tre af fibroblast-stammer udtrykte α-SMA, overraskende også de normale hudfibroblaster FB-74. Den anden normal fibroblast stamme FB-43 udtrykte ikke α-SMA på proteinniveauet. Men ved måling af mRNA-niveauer med mere følsomme Q-PCR-fremgangsmåden, viste alle fire fibroblast populationer, α-SMA-ekspression og dette blev nedreguleret i nemosis. Den tidsafhængige nedregulering af både protein og mRNA-niveau er i overensstemmelse med tidligere resultater på nemosis, hvilket indikerer nedbrydning af cytoskelettet. Interessant CAFS begyndte at genvinde α-SMA mRNA-ekspression ved 72 timer, var forskellen signifikant i forhold til deres normale modstykker. I modsætning til vores resultater, en undersøgelse af Shannon et al. [30] viste, at normal hud fibroblaster, men ikke orale fibroblaster udtrykte α-SMA. Men viste nyere resultater, i overensstemmelse med vores resultater, at normale orale fibroblaster udtrykker α-SMA og dette udtryk øges, når disse celler blev dyrket i konditioneret medium opnået fra OSCC celler [31]. Disse modstridende resultater kan komme dels fra den metode, der blev anvendt til at måle α-SMA-ekspression; i den første immunoblotting blev anvendt i den anden metode var lidt mere følsomme immunhistokemi.

Vi undersøgte også mRNA-niveauerne af to andre CAF markører, FSP1 og FAP. I nemosis faldt FSP1 niveauer i FB-43, FB-74 og CAF-74 sfæroider, men steg i CAF-43-celler. Den tredje undersøgte CAF markør FAP blev opreguleret i nemosis, mere i CAF end i normale fibroblaster, var forskellen signifikant med de 43 fibroblast stammer. Med alle tre CAF markører den nemosis reaktion fulgte mønsteret af reduceret ekspression af cytoskeletale gener (α-SMA og FSP1) og forøgelse af proteolytisk genekspression (FAP). Klart anderledes respons blev set med CAF-43 celler, hvor, i stedet for nedregulering af FSP1, niveauerne steg i nemosis.The heterogenitet fibroblaster bliver tydeligt, når man ser på de basale niveauer af CAF markør udtryk; CAF-43 celler havde lavere niveauer af alle tre markører, CAF-74 havde mindre α-SMA, lidt mere FSP1 og over 10 gange mere FAP. Disse resultater understreger også, at α-SMA, de mest almindeligt anvendte CAF /myofibroblastdifferentiering markør, bør ikke kun bruges til at definere aktiverede fibroblaster.

En anden kendetegnende for nemosis er induktion af vækstfaktorer. Det er blevet vist, at orale fibroblaster producerer signifikant mere FGF7 og HGF /SF i forhold til hudfibroblaster [30]. Disse to vækstfaktorer, sammen med VEGF, som vides at være vigtige ved sårheling og cancer progression [32], [33]. Det basale ekspression af VEGF, HGF /SF og FGF7 mRNA var lavere i CAF end i normale fibroblaster, og dette er i modsætning til tidligere resultater [30]. Men væksten i disse celler var langsommere end deres normale modparter, som kunne afspejle deres nedsat produktion af vækstfaktorer. SA-β-gal aktivitet af CAF understøtter denne teori, indikerer, at disse celler er senescent. Behovet for disse vækstfaktorer, der skal udskilles af fibroblaster kan reduceres i CAF siden tumorcellerne selv, sammen med infiltreres makrofager og endotelceller, er i stand til at producere disse faktorer. Som forventet, VEGF, HGF /SF og FGF7 mRNA’er blev opreguleret i fibroblast nemosis, og niveauet af induktion varierede mellem fibroblast populationer. VEGF induktion var højest i CAF-74 sfæroider, HGF /SF i CAF-43 sfæroider og FGF7 i FB-43 sphæroider.

På baggrund af disse resultater ser det ud, at evnen til normale og cancer-associerede fibroblaster til at producere disse vækstfaktorer i nemosis er noget relateret til det omfang, de er nødvendige i kræft progression. Afhængigheden af ​​tumorer på stromale fibroblaster, og især for de vækstfaktorer, de producerer, aftager i løbet af tumorprogression. Epitelceller kræver FGF7 at bryde epitel polarisering. FGF7 kun udtrykkes ved stromale celler og dens receptor FGFR2IIb kun epitelceller, indikerer den rolle FGF7 i begyndelsen af ​​tumor progression [34]. Af de undersøgte fibroblast populationer de FB-43 celler, som synes at være mest normale af de undersøgte stammer (baseret på induktion af COX-2 og manglende α-SMA), havde den højeste FGF7 induktion i nemosis. HGF /SF er nødvendig for migrationen /spredning af epithelcellerne fra det oprindelige knækpunkt. Nemotic CAF-43-celler produceret mere HGF /SF end de andre tre cellestammer. Støtte denne Kankuri et al. [15] har vist, at HGF /SF produceret af fibroblast sfæroider direkte fremmer cancercelleinvasion. Også en anden undersøgelse har vist, at orale fibroblaster drive invasion af OSCC celler ved at forøge sekretion af HGF /SF [35]. VEGF er påkrævet senere i tumorudvikling når kræften cellemasse udvider det punkt, hvor det ikke længere kan vokse uden ilttilførsel. VEGF, der udskilles af fibroblaster, inducerer angiogenese ved at rekruttere endotelceller til dannelse af nye blodkar [36]. . CAF-74 celler, som er aldrende, har langt det højeste niveau af VEGF i nemosis

Det er blevet godt etableret, at CAF, men ikke normale fibroblaster, er i stand til at fremme tumor progression [37] – [ ,,,0],39]. Nyere resultater har vist, at i første omgang de normale fibroblaster hæmme væksten af ​​kræftceller [2], og vores nuværende resultater enig i denne opfattelse. Vi viser her, at normale fibroblaster faktisk inhiberer kolonidannelse af tilbagevendende SCC-celler, men mærkeligt dette ikke blev set med primære tumorceller. CAFS synes at kunne kun at påvirke de primære SCC celler og ikke de tilbagevendende celler. CAFS produceret lavere niveauer af vækstfaktorer, og det kunne være, at af denne grund de er i stand til at påvirke den mere lydhør primære VKF, men de mindre følsomme tilbagevendende celler ikke reagerer på denne lavere mængde af udskilte vækstfaktorer.

Den observerede spontan klumpformet dannelsen af ​​FB-43 og CAF-43 i monolagskulturer er i tråd med resultaterne fra Kankuri et al. [15], hvor spontan gruppering af fibroblaster, dvs. nemosis, kunne opnås ved tilsætning af tumorcelle-afledt konditioneret medium til en fibroblastmonolaget. Men vi fandt ikke dette med fibroblast stammer fra den anden SCC patient. Dette kan til dels skyldes induktionen af ​​tumor suppressor p53 i 74A og 74B SCC-celler. Alligevel fibroblasterne gjorde vokse hurtigere under indflydelse af 74B SCC-celler; dette var også tilfældet med CAF-74 celler, der synes at være i en tilstand af stress-induceret ældning. Yderligere mere, vi ikke se forankringsuafhængig vækst af fibroblaster, i konflikt med de opnåede resultater med prostata- og prostata karcinom forbundet fibroblaster [40]. Mulige forklaringer på dette er individuelle variationer og oprindelsen af ​​fibroblaster. Det er værd at bemærke, at i de bløde-agarose eksperimenter SCC celler og fibroblaster ikke var i direkte kontakt, men adskilt af et fast lag af agarose, og kulturerne blev ikke genopfyldes med frisk medium. Derfor parakrin signalering mellem disse to celletyper skal medieres af opløselige faktorer.

Som konklusion Studiet viser klart, at fibroblaster opnået fra forskellige individer varierer i genekspression og adfærd, og at ekspressionen af ​​CAF markører forskellig normale fibroblaster og CAF i nemosis. Både normale og cancer-associerede fibroblaster modulere tumorceller, normale fibroblaster ved at hæmme væksten af ​​invasive SCC celler og CAF yderligere forøgelse af det væksten af ​​primære SCC celler. Nemosis, en

in vitro

model af fibroblast aktivering, kan have sin

in vivo

modstykke i cancer-associerede fibroblaster og er et værdifuldt redskab i at studere variationerne mellem fibroblaster opnået fra forskellige individer. Nemosis respons, især af CAF markører a-SMA og FAP, kunne derfor bruges som en prognostisk markør til at forudsige det stromale reaktion af tumorer.

Materialer og metoder

Cell stammer og cellekultur

Alle brugte cellestammer tidligere var blevet etableret [25], [26], [41] og blev leveret af Dr. Reidar Grenman (Turku University Central Hospital, Finland). Kort fortalt blev UT-SCC-43A (43A) celler opnået fra primær tumor af en 75-årig kvinde med gingival sårdannelse og metastase. Histologi (T4N1M0) var en veldifferentieret SCC. UT-SCC-43B (43B) celler blev etableret fra den resekterede tilbagevendende tumor. UT-SCC-74A (74A) celler blev opnået fra en 31-årig mand, der har SCC i flersprogede højre margen (T3N1M0). UT-SCC-74B (74B) cellelinie blev etableret fra en metastase findes senere i nakken. De patient-matchet FB-43 og FB-74 normale fibroblaster blev opnået fra huden og CAF-43 og CAF-74 fibroblaster blev opnået fra stroma af den respektive orale SCC. Den mesenchymal oprindelse af fibroblast-stammer blev oprindeligt bekræftet ved positiv farvning for vimentin og negativ farvning for cytokeratin hjælp immunhistokemi.

Alle cellepopulationer blev dyrket ved + 37 ° C i 5% CO

2 atmosfære i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) (Invitrogen, Carlsbad, CA) og suppleret med 5% føtalt kalveserum (FCS) (Invitrogen), 0,3 mg /ml glutamin, 100 ug /ml streptomycin og 100 U /ml penicillin. Fibroblast sfæroider blev dannet som tidligere [17] beskrevne. Kort fortalt, 150-pi prøver /brønd af enkeltcellesuspensioner (1,3 × 10

5 celler /ml) blev udpladet på agarose-coatede U-bundede plader med 96 brønde (Costar, Cambridge, MA).