PLoS ONE: Ascites Øger Expression /funktion af multiresistens Proteiner i ovariecancerceller

Abstrakt

Kemoterapi modstand er den vigtigste årsag til den manglende af kræft i æggestokkene behandling. En mekanisme bag kemo-modstand involverer opregulering af multiresistens (MDR) gener (ABC transportører), der effektivt transporterer (efflux) stoffer ud af tumorcellerne. Som et almindeligt symptom i trin III /IV ovariecancer patienter, ascites er associeret med cancer progression. Men uanset om ascites drev multiresistens i æggestokkene cancerceller venter udredning,. Her viser vi, at når de dyrkes med ascites afledt af ovariecancer-bærende mus, en murin ovariecancer cellelinje blev mindre følsom over for paclitaxel, en første linie kemoterapeutisk middel til patienter med ovariecancer. Endvidere inkubation af murine ovariecancerceller

in vitro

med ascites driver efflux funktion i disse celler. Funktionelle undersøgelser viser ascites-drevne udstrømning er undertrykkes ved specifikke inhibitorer af en af ​​to ABC transportører [Multidrug relateret protein (MRP1); Breast Cancer relateret protein (BCRP)]. For at demonstrere relevansen af ​​vores resultater til patienter med ovariecancer, vi studerede relativ udstrømning i humane ovariecancerceller opnået fra enten patient ascites eller fra primær tumor. Immortaliserede cellelinjer der er udviklet fra humane ascites viser øget modtagelighed for udstrømning inhibitorer (MRP1, BCRP) sammenlignet med en cellelinie afledt fra en primær ovariecancer, hvilket antyder en sammenhæng mellem ascites og efflux funktion i human ovariecancer. Udstrømningen i ascites-afledte humane ovariecancerceller er forbundet med forøget ekspression af ABC transportører sammenlignet med den i primære tumorafledte humane ovariecancerceller. Tilsammen vores resultater identificerer en hidtil ukendt aktivitet for ascites i fremme ovariecancer multilægemiddelresistens

Henvisning:. Mo L, Pospichalova V, Huang Z, Murphy SK, Payne S, Wang F, et al. (2015) Ascites Øger Expression /funktion af multiresistens Proteiner i æggestokkene cancerceller. PLoS ONE 10 (7): e0131579. doi: 10,1371 /journal.pone.0131579

Redaktør: Irina V. Lebedeva, Columbia University, UNITED STATES

Modtaget: December 5, 2014 Accepteret: 3 juni 2015; Udgivet: Juli 6, 2015

Copyright: © 2015 Mo et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle data er indeholdt i papiret

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af CZ.1.07 /2.3.00 /30,0009, den Europæiske Socialfond (VP) (https://ec.europa.eu/esf/home.jsp ), W81XWH-11-1-0469, Department of Defense æggestokkene Cancer Research Program Award (SKM) (https://cdmrp.army.mil/ocrp/), Gail Parkins æggestokkene Cancer Research Fund (SKM) (http: //www.ovarianawareness.org), fonden for Intern Reserve for Patologisk Institut, Duke University Medical center (SVP). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

operative tumor debulking er hovedsageligt udføres på scenen i /II æggestokkene kræftpatienter. Denne kirurgiske procedure for fremskredent stadium sygdom (III til IV) er ikke altid muligt, især hos kvinder, hvis sygdom er omfattende [1]. Derfor kemoterapi er det primære værktøj til at blokere spredning af kræftceller, når klinikere behandler patienter på fremskredne kræft stadier. I forhold til normale celler, aktivt prolifererende cancerceller er mere modtagelige for en række cytotoksiske lægemidler rettet mod forskellige cellulære processer, herunder DNA-alkylerende midler, antimetabolitter, interkalerende midler og mitose inhibitorer [2].

Den første linje kemoterapi for ovariecancer er forblevet uændret i det seneste årti, med den terapeutiske rygrad bestående af en platin agent (generelt carboplatin) og en taxan (generelt paclitaxel) [3]. Anden-line kemoterapi betragtes når patienter reagerer ikke på første linje narkotika. Et antal antineoplastiske midler har udvist tilstrækkelig biologisk aktivitet skal betragtes rationelle second-line valg, såsom doxorubicin, etoposid, gemcitabin, ifosfamid, eller cyclophosphamid [4].

Chemo-resistens, kendetegnet ved en reduceret evne af kemoterapi til at hæmme tumorvækst over tid, er den mest almindelige grund til at afbryde behandling med kemoterapi. Kræft i æggestokkene tilbagefald er et direkte resultat af kemo-modstand, der forekommer i mere end 80% af high-grade serøse ovariecancerpatienter [3, 5]. Mekanismerne bag kemo-resistens, omfatter: 1) opregulering af multiresistens (MDR) gener der effektivt transporterer stoffer ud af cellen; 2) ændring af lægemiddel-metaboliserende enzymer, såsom de i glutathion S-transferase familie (GST); 3) flugt fra apoptose og øget DNA-reparation som følge af muterede tumorsuppressorgener [p53, brystkræft 1/2 (BRCA1 /2), ataksi telangiectasia muteret (ATM) gener] [2]; og 4) nedsat mitosespindelen checkpoint fører til resistens over for mikrotubuli inhibitorer [6].

En stor familie af 50 forskellige ATP-bindende kassette (ABC) proteiner (ABC transportører) er blevet dokumenteret at udstrømning cytotoksiske molekyler, reducere den intracellulære lægemiddelkoncentration [7, 8]. Blandt de ABC transportører forbundet med kemo-modstand af ovariecancer

MDR1

gen, der koder for P-glycoprotein (P-gp, MDR1, ABCB1), er den hyppigst undersøgte mekanismen. Andre almindelige ABC transportører omfatter: MDR-associerede protein 1 (MRP1, ABCC1) og brystkræft resistens protein (BCRP, ABCG2) [2]. Kort sigt inkubation af kræft i æggestokkene celler med kemoterapeutiske regimer (fx doxorubicin, cisplatin og paclitaxel) på deres kliniske koncentrationer [9] øger MDR1 ekspressionsniveauerne. Især udviser tilbagevendende ovariecancer signifikant forøget MDR1 forhold til primære ovariecancer, med de tilbagevendende patienter, der fik platinbaseret taxan terapi som en standard for pleje efter diagnosticering af deres primære kræft [10]. Svarende til MDR1 er MRP1 påvist i ubehandlede primære ovarietumorer på forskellige niveauer [11] og fundet opreguleret efter en trinvis induktion af cisplatin modstand i æggestokkene kræftceller

in vitro

[12]. BCRP er inducerbar i æggestokkene cancer cellelinjer ved langvarig inkubation med topotecan og giver resistens over for topotecan og mitoxanthron [13, 14].

Ascites er et almindeligt symptom i trin III /IV ovariecancer patienter og korrelerer med en dårlig prognose [15]. Malign ascites er kendt for at beskytte humane ovariecancerceller fra TRAIL-induceret apoptose fører til en kortere sygdomsfri overlevelse for patienter [16, 17]. Imidlertid vides der kun lidt om forholdet mellem forekomst af ascites og kemo-resistens i ovariecancer. I denne undersøgelse, vi undersøge, hvordan ascites påvirker æggestokkene cancerceller i deres svar på paclitaxel og docetaxel, førende taxanlægemidler ansat af klinikere i æggestokkene kræftbehandling [3].

Materialer og metoder

Cell line og reagenser

ID8, en mus epitelial kræft i æggestokkene cellelinje [18], var en slags gave fra Dr. Kathy Roby på Kansas University Medical center. Mycoplasma forurening screening ved hjælp af Gen-Probe nucleinsyrehybridisering blev udført af hertugen Cancer Institute Cell Culture Facility i april 2010. ID8 celler blev holdt i DMEM (høj glucose, Gibco-Life Technologies [Gibco] Carlsbad, CA), der indeholder 4% føtalt bovint serum, penicillin (100 enheder /ml) + streptomycin (100 pg /ml) (Invitrogen-Life Technologies [Invitrogen]; Carlsbad, Californien). HA1 og HA2 blev udviklet med SV40 T-antigen-immortalisering af humane ovariecancerceller opnået fra ascites [HA1 linje afledt af ascites (6116) fra primær kirurgi serøs carcinom, dårligt differentieret; HA2 linje afledt af ascites (OV 186) fra primær kirurgi serøs papillære cystadenocarinoma]. TD-celler blev udviklet af SV40 immortalisering af humane ovariecancerceller fra primær kirurgi høj kvalitet serøs adenokarcinom væv (primær peritoneal karcinom) (6114)]. Disse cellelinier blev opretholdt i DMEM (høj glucose, Gibco) indeholdende 10% føtalt bovint serum og 1X penicillin streptomycin. De-identificerede tumor og ascites prøver bruges til at oprette de immortaliserede cellelinjer blev indsamlet, efter donors levering af skriftligt informeret samtykke, af Hertugen Gynækologisk onkologi Tumor Bank (Pro00013710) og anvendt til denne undersøgelse under Duke IRB-protokol Pro00027325. Paclitaxel (T7191) og docetaxel (01885) blev indkøbt fra Sigma-Aldrich, St. Louis, MO. Humane æggestokkene cancer cellelinjer blev opretholdt i maksimalt to passager før analyse.

Murine ascites forberedelse

Denne undersøgelse blev udført i nøje overensstemmelse med anbefalingerne i vejledningen for den pleje og anvendelse af forsøgsdyr af National Institutes of Health. Protokollen blev godkendt af Institutional Animal Care Brug Udvalg på Duke University (protokol nummer: A295-12-11). blev gjort alle bestræbelser på at minimere lidelse. Kvinde 6-8 uger gamle C57BL /6-mus (Charles River, Raleigh, NC) blev anvendt. ID8 celler (1-10×10

6) blev injiceret i mus peritoneum. Efter ascites akkumulering blev musene aflivet. Peritonealvæske blev opsamlet og centrifugeret to gange ved 500 x g i 5 min for at adskille de cellulære og acellulære fraktioner. Acellulære fraktioner fra flere mus blev samlet og filtreret gennem 0,22 um sterile filtre. De ascites behandling vilkår 50% blev normaliseret til normale dyrkningsbetingelser med hensyn til FBS, glucose og antibiotiske koncentrationer.

Flowcytometrisk analyse med Green efflux ID Dye

Funktionen af ​​de multiresistens proteiner MDR1 , MRP og BCRP blev analyseret ved eFluxx-ID Green multiresistens Assay Kit (ENZ-51.029-K100, Enzo Lifesciences, Farmingdale, NY) ifølge fabrikantens instruktioner. Kort fortalt blev enkeltcellesuspensioner høstet med trypsin optalt, lige mange celler (500.000 /condition) blev resuspenderet i komplette medier indeholdende specificinhibitors eller deres kombinationer (eller DMSO som fortyndingsmiddelkontrol) andincubated i 10 minutter ved 37 ° C. Kilder /Slutkoncentrationer af inhibitorer er som følger: Verapamil (MDR1-inhibitor; Sigma V4629; 40 pM); MK-571 (MRP1-inhibitor; Sigma M7571, 100 uM); Novobiocin (BCRP inhibitor; Sigma N1628; 200 um). Grønt farvestof blev derefter tilsat og inkuberet ved 37 ° C i 40 min. Celler blev vasket en gang i PBS inden FACS dataopsamling ved anvendelse af en Guava Easycyte Plus instrument (Millipore, Billerica, MA), blev 7-AAD anvendes til at udelukke døde celler fra analysen. Data blev analyseret ved hjælp FlowJo_V10 software (Ashland, OR)

Beregning af multiresistens aktivitet faktor

multiresistens aktivitet faktor (MAF) for hver transportør, beregnet ved hjælp af følgende formler:. Hvor F er den geometriske middelværdi af fluorescens-intensiteten (GMFI), F

0 – uden inhibitor, F

MDR1 – med MDR1-inhibitor, F

MRP – med MRP-inhibitor, F

BCRP – med BCRP inhibitor

rhodamin 123 fastholdelse assay

Drug efflux funktion blev bestemt i ubehandlede og ascites-behandlede ID8 celler ved rhodamin 123 fastholdelse analyser [18]. ID8 celler opnået fra normale kultur, fra 7 dage ascites forbehandling kultur eller fra ascites

in vivo

blev podet ved 40.000 celler per brønd i plader med 6 brønde og lodes binde natten over. Disse celler blev derefter inkuberet med rhodamin 123 i 30 min. Celler fra hver betingelse blev derefter vasket med PBS og inkuberet med regelmæssig medium i 2,5 timer. Fluorescerende billeder blev taget på en excitation λ = 485 nm og emission λ = 530 nm ved hjælp BioTek Cytation3 Imager (Winooski, VT) ved 0 min (efter fjernelse farvestof og PBS vask) og 2.5 timer Pakken timer efter Rhodamin 123 fjernelse. Eksperimenter blev uafhængigt gentaget tre gange

Real-Time kvantitativ RT-PCR

Totalt RNA fra celler blev ekstraheret under anvendelse af Qiagen RNeasy Micro kit ifølge producentens protokol. (Qiagen, Valencia, CA) og behandlet med RNase-fri DNase at fjerne eventuelle genomisk DNA. Enkeltstrengede cDNA’er blev syntetiseret ved at inkubere total RNA (1 ug) med RNase H-revers transkriptase (500 U), oligo- (dT) 12-18-primer (100 nM), dNTP’er (1 mM), og RNase-inhibitor ( 40 U) ved 42 ° C i 1 time i et endeligt volumen på 20 pi. Transcript First Strand cDNA Synthesis Kit blev indkøbt fra Roche Applied Science (Indianapolis, IN). Q-PCR-primere til mus

Abcc1

,

Abcb1a

,

Abcb1b

beta-Actin

blev købt fra Origene (Rockville, MD). Kvantitativ realtids-PCR blev udført for at sammenligne ekspressionsniveauerne af hver total RNA-prøve. Real-time PCR på den Mx3005P QPCR System (Stratagene, La Jolla, CA) blev udført i nærvær af 12,5 pi VeriQuest Fast SYBR Green qPCR Master Mix (2x) (USB, Cleveland, OH) og 2 pi cDNA og H

2O blev tilsat til et endeligt volumen på 25 pi. Real-time PCR blev udført med et indledende denatureringstrin på 5 minutter ved 95 ° C, efterfulgt af 40 cykler af 3 s ved 95 ° C, 30 s ved en annealingstemperatur på 60 ° C. PCR-produkter blev monitoreret i realtid ved at måle stigningen i fluorescens forårsaget af bindingen af ​​SYBR Green I Dye. Betydning blev analyseret ved hjælp af softwarepakken MxPro QPCR Software (Stratagene, La Jolla, CA).

Western blots

Celler blev høstet ved anvendelse af trypsin-EDTA og vaskes med PBS. Høstede celler blev inkuberet i samlede lysepuffer (50 mM Tris pH 7,5, 1% SDS) plus protease og phosphatase inhibitor cocktail (Halt, Thermo Scientific). Proteinkoncentrationer blev bestemt ved BCA-assay. Ækvivalente mængder af protein blev underkastet SDS-polyacrylamidgelelektroforese (PAGE) og immunblottet. Blots blev inkuberet med de følgende primære antistoffer, efterfulgt af de relevante arter IRDye-konjugeret sekundært antistof (Life Technologies, Carlsbad, CA): MDR1 (BIOSs; Cat # 1468R); MRP1 (Biorbyt Cat # ORB76148); BCRP (Biorbyt Cat # ORB10178); beta actin (Sigma Cat # SAB5500001). MDR1, MRP1, BCRP proteiner blev påvist under anvendelse Odyssey infrarød billeddannende system (LI-COR, Lincoln, NE). Proteinbånd blev kvantificeret under anvendelse Billede J software (NIH, Bethesda, MD), og det relative forhold af proteinet af interesse for beta actin loading bekæmpelse blev beregnet.

Proliferationsassay

Celler blev podet ved 2.5×10

3 celler per brønd i plader med 96 brønde og lodes vokse natten over. Celler blev vasket en gang med serumfrit DMEM. Cellerne blev derefter inkuberet med forskellige koncentrationer af paclitaxel eller docetaxel fortyndet i 200 pi DMEM i 24 timer. Ascites behandlede ID8 celler eller ID8 celler høstet fra ascites modtaget behandlingerne fortyndet i 200 pi 50% ascites supernatant. Efter 18 timer, 0,5 uCi [

3H] -thymidin (Perkin-Elmer, Waltham, MA) blev tilsat til hver brønd. Efter 8 timer blev mediet fjernet, og cellerne blev dissocieret i 10X trypsin-EDTA og høstet med en 12-kanals microharvester (Skatron Instruments, Norge). Prøverne blev talt i en væskescintillationstæller spektrofotometer. Alle betingelser var i fire eksemplarer, og hvert eksperiment gentages mindst to gange.

7-AAD-farvning

ID8 celler fra forskellige forbehandlinger blev podet ved 4×10

4 celler per brønd og tilladt at vokse natten over i 6-brønds plader. De blev vasket en gang med serumfrit DMEM. Cellerne blev derefter inkuberet med forskellige koncentrationer af paclitaxel eller docetaxel fortyndet i 2 ml DMEM i 4 dage. Ascites behandlet ID8 celler eller ID8 celler høstet fra ascites modtaget behandlingerne fortyndet i 2 ml 50% ascites supernatant. Ved udgangen af ​​behandlinger blev celler høstet ved trypsinisering og farvet med 7-AAD (BD Biosciences) ifølge producentens protokol efterfulgt af analyse på en Guava Easycyte Plus instrument (Millipore) og analyseret ved FlowJo_V10 software.

statistisk analyse

Graph visualisering, data transformation og statistiske analyser (to-halet uparret t-test eller to måde – ANOVA) blev udført ved hjælp af Prism (version 5.0, GraphPad Software) og Microsoft Office Excel (version 2010, Microsoft ).

Resultater

ascites øger ID8 celle kemoterapi modstand

Vi testede effekten af ​​ascites på æggestokkene kræftcelle modstand mod paclitaxel, en første linje kemoterapeutisk middel. Sammenligningen blev udført mellem 1) ID8 celler dyrket i normalt dyrkningsmedium, 2) ID8 celler frisk isoleret fra ascitesvæske i en syngen model, og 3) ID8 celler behandlet i 7 dage

in vitro Salg med ascites supernatant afledt af ID8-bærende mus. Kemoterapi dosering blev optimeret til et interval for at opnå 0 til 95% cellevækstinhibering, som målt ved [

3H] -thymidin inkorporering. Både ID8 celler behandlet i 7 dage med ascites supernatant og ID8 celler frisk isolerede fra ascitesvæske var mere resistente over for paclitaxel end ID8 celler dyrket i normalt medium, som målt ved [

3H] -thymidin inkorporering assay (Fig 1A). For at validere den hypotese, at ascites drev ovariecancercelle kemo-resistens, vi næste undersøgt responset af ovariecancerceller (+/- ascites behandling) til et andet kemoterapeutisk reagens i Taxanfamilien (docetaxel). Især ID8 celler behandlet i 7 dage med ascites supernatant, samt ID8 celler frisk isolerede fra ascitesvæske var signifikant mere resistente over for docetaxel end ID8 celler fra normal kultur (Fig 1B). Salg

Murine ovariecancerceller ( ID8) fra tre forskellige kilder blev undersøgt: 1) ID8 celler fra normal dyrkningsmedium (medium), 2) ID8 celler frisk isoleret fra ascitesvæske i en syngen model (

In vivo

celler), og 3) ID8 celler behandlet i 7 dage

in vitro

med ascites supernatant (ascites behandlet 7 dage). Hver af disse cellepopulationer blev udsat for paclitaxel (A) eller docetaxel (B) ved den angivne koncentration i 24 timer og [

3H] -thymidin-inkorporering blev bestemt. Tre uafhængige forsøg blev udført, og et repræsentativt resultat er vist. Fejl bar repræsenterer SD af firdobbelte i hver tilstand. * Angiver p 0,05, *** p 0,001, To-vejs ANOVA. A. ID8 celler forbehandlet med acellulære ascites i 7 dage (Ascites behandlet 7 dage) eller isoleret fra ascites (

in vivo Salg celler) har forøget resistens over for paclitaxel sammenlignet med ID8 celler fra normalt medium. B. ID8 celler forbehandlet med acellulære ascites i 7 dage (Ascites behandlet 7 dage) har forøget resistens over for docetaxel ved 2 og 4 nM sammenlignet med ID8 celler fra normal kultur. ID8 celler isoleret fra ascites (

in vivo

celler) har øget resistens over for docetaxel sammenlignet med ID8 celler fra normal medium (Medium). C-D. 7-AAD optagelse blev målt ved flowcytometrisk analyse. Procenten 7-AAD positive celler fra tre uafhængige forsøg er vist for paclitaxel (C) og docetaxel (D) -behandlede celler. Fejl- søjler repræsenterer SD. * Angiver p 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001, To-vejs ANOVA. ID8 celler forbehandlet med acellulære ascites i 7 dage (Ascites behandlet 7 dage) er mere modstandsdygtige over for kemoterapi-induceret celledød (

i

.

e

., Udviser færre 7-AAD + celler ) end ID8 celler fra normal kultur.

ovennævnte data indikerer, at ascites øger ovariecancercelle kemo-resistens som vurderet ved anvendelse af et [

3H] -thymidin inkorporering assay som er et mål af celleproliferation. Dernæst har forsøgt at bestemme, om ascites beskytter ovariecancerceller fra kemoterapi-induceret celledød ved at udføre 7-AAD-farvning. Som vist i fig 1C og 1D, ID8 celler behandlet i 7 dage med cellefrie ascites blev beskyttet mod både paclitaxel- og docetaxel- induceret celledød, hvilket giver yderligere bevis for, at ascites supernatant fremmer ovariecancer kemo-resistens.

Ascites driver efflux i ID8 celler

Derefter undersøgte vi efflux funktion i ascites-behandlede ovariecancerceller anvendelse af to drug efflux assays (efflux ID grønt farvestof og rhodamin 123) [18]. Udstrømningen ID grønne assay måler fluorescensintensitet efter inkubation af celler med fluorescerende farvestof. Fig 2A viser reduceret fluorescens intensitet i begge ascites forbehandlede ID8 celler og ID8 celler isoleret fra ascites (syngenisk musemodel) sammenlignet med fluorescens intensitet i ubehandlede celler. Disse resultater antyder, at ascites fremmer efflux funktion i ovariecancerceller. Vi næste målte retention af rhodamin 123 farvestof i ID8 celler (+/- ascites behandling). Som vist i fig 2B og 2C, 2,5 timer efter rhodamin fjernelse, havde ubehandlede ID8 celler bibeholdt farvestof. I modsætning hertil var signifikant reducerede niveauer af farvestof detekteres i ascites præinkuberede ID8 celler, hvilket støtter den konklusion, at ascites-behandlede tumorceller udviser forøget efflux. Tilsammen antyder disse resultater, at ascites driver ovariecancer effluksmekanismer.

(A). Efflux funktion blev målt ved udstrømning ID grønt farvestof-assay. ID8 celler isoleret fra normal kultur, opnået efter 7 dage ascites behandling, eller isoleret fra ascites (

in vivo Salg celler) blev inkuberet med udstrømningen ID grønt farvestof i 40 min, hvilket tillader cellerne at optagelse og udstrømning dette farvestof. ID8 celler forbehandlet med ascites bibeholdt mindre farvestof sammenlignet med ID8 celler fra normal kultur, hvilket indikerer en øget efflux funktion. (B). Efflux funktion blev målt ved Rhodamin 123 assay. ID8 celler opnået fra normale kultur, fra 7 dage ascites forbehandling kultur eller fra ascites

in vivo

blev inkuberet med rhodamin 123 i 30 min. Derefter celler fra hver betingelse blev vasket med PBS og inkuberet med regelmæssig medium i 2,5 timer. Fluorescerende billeder blev taget ved 0 min (efter fjernelse farvestof og PBS vask) og 2.5 timer Pakken timer efter Rhodamin 123 fjernelse. Kvantificering af fluorescensintensiteten (minus baggrund) i hver gruppe er vist i (C). Tre uafhængige forsøg blev udført, og et repræsentativt resultat er vist. Fejl bar repræsenterer SD af fluorescerende intensitet måling hver celle i hvert billede. * Angiver p. 0,05, t-test

Ascites behandling øger ekspressionen af ​​multiresistens-relaterede transportører

Vi studerede udtryk for tre ABC transportør gener (MDR1, MRP1 og BCRP), der almindeligvis er involveret i kræft kemo-modstand. Vi udførte kvantitativ real-time PCR (q-PCR) på RNA høstet fra ID8 celler og ID8 celler forbehandlede med ascites. Ubehandlede ID8 celler udtrykte både MRP1 og BCRP mRNA (Fig 3A). Efter behandling med ascites

in vitro

i 7 dage, ID8 celler udviste signifikant forøget ekspression af MDR1a (118- fold), MDR1b (75 gange), og BCRP (17 gange) (Fig 3A og 3B) .

Total RNA blev høstet fra ID8 celler i normal kultur samt fra ID8 celler forbehandlet med ascites i 7 dage. Ekspressionsniveauer af de angivne gener (i forhold til beta actin) blev bestemt ved real-time PCR (A). Fold stigninger i genekspression (ascites behandlet ID8 celler frem normale ID8 celler) er vist i B. Tre uafhængige forsøg blev udført, og fejl søjle repræsenterer SD. * Angiver p 0,05 og *** p. 0,001, t-test

Hæmmere af multiresistens-relaterede transportører reducerer efflux effektivitet i ascites-associerede ovariecancer celler

efter at have vist opreguleres MDR-relaterede ABC transportører i ascites behandlede ovariecancerceller, vi næste søgt at fastslå, om specifikke inhibitorer af disse transportere forhindre udstrømning i disse celler. Vi studerede tre MDR transporter hæmmere: verapamil (MDR1-inhibitor), MK-571 (MRP1 /2-hæmmer), og Novobiocin (BCRP inhibitor). Først inhibitor virkninger på efflux funktion i ID8 celler dyrket i normalt medium blev vurderet. Inhibitorer blev tilsat til cellerne i 10 minutter før tilsætning af efflux ID grønt farvestof. Som vist i fig 4A og 4B, inhibitor kun MRP1 forøget fluorescensintensitet af efflux ID driv- mærkede ID8 celler. Disse resultater viser, at ubehandlede ID8 ovariecancer celler understøtter MRP1-afhængige efflux, men ikke MDR1 eller BCRP-afhængig efflux. Næste vi studerede virkningerne af disse inhibitorer på efflux funktion i begge ascites behandlede ID8 celler og i ID8 celler isoleret direkte fra ascites (

in vivo

celler). MDR1-inhibitor steg ikke fluorescens i ID8 celler præ-inkuberes med ascites i 7 dage

in vitro

. Men MDR1-inhibitor gjorde stigning fluorescens i ID8 celler isoleret fra ascites

in vivo

(Fig 4A og 4B). Tilsætning af enten MRP1 inhibitor eller BCRP inhibitor signifikant forøget fluorescens (MAF) i begge ascites-behandlede ID8 celler og i ascites celler (

in vivo

) (Fig 4B). Vi viste også, at kombinationer af disse inhibitorer ikke øgede fluorescens intensiteten af ​​efflux ID grøn-mærkede ID8 celler eller ascites-behandlede celler over fluorescensintensiteten opnået med enkelt-hæmmere, tyder på, at aktiviteten af ​​disse individuelle transportører ikke blev opvejet af andre transportører ( data ikke vist). Kollektivt antyder disse data, at ascites fremmer MRP1 og BCRP-afhængig efflux i ID8 ovariecancerceller.

(A). ID8 celler fra normal kultur, ascites forbehandling kultur, eller ascites (

in vivo Salg celler) blev behandlet med eller uden inhibitorer er målrettet MDR1, MRP1 eller BCRP i 10 minutter og derefter inkuberet med udstrømningen ID grønt farvestof i 30 min. fluorescensintensitet af hver betingelse blev målt ved flowcytometri. Multilægemiddelresistens aktivitet faktor (MAF) blev beregnet for hver prøve, og betyde MAF (+/- SD fra tredobbelte prøver) er vist for hver betingelse i B. MAF værdier, der ligger under baggrund er angivet med grå ramme. Statistisk signifikante stigninger i MAF mellem ascites-behandlede og

in vivo

ascites celler (sammenlignet med ubehandlede celler) er angivet. Fejl- søjler repræsenterer SD’er fra tre uafhængige forsøg. * Angiver p. 0,05, t-test

Humane ovariecancerceller opnået fra ascites, men ikke tumor-afledte ovariecancerceller, udviser efflux funktion

Dernæst søgte vi at udvide vores resultater til humane æggestokkene cancerceller. Vi studerede udødeliggjort humane ovariecancer celler fra patientens ascites (HA1, HA2 celler) eller fra den primære tumor websted (TD-celler). Brug af udstrømningen ID grønne assay, viste vi, at HA1 og HA2 celler udviste højere udstrømning end TD-celler (Fig 5A og 5B), udlån support til vores konstatering af, at ascites driver efflux funktion æggestokkene cancerceller. Western blotting blev udført for at undersøge efflux proteinekspression i disse tumor-afledt og ascites-afledte humane ovariecancerceller. Som vist i fig 5C, ekspression af MDR1, MRP1 og BCRP var signifikant højere i ascites-afledte tumorcellelinier (HA1, HA2) end i en primær tumor-afledt cellelinje (TD). For at bestemme hvilken efflux proteiner var funktionelle i disse celler, vi næste undersøgt virkningerne af MDR-inhibitorer på udstrømningen i tumorafledte og ascites-afledte humane ovariecancerceller. MRP1 og BCRP inhibitorer, men ikke en MDR1-inhibitor, undertrykt farvestof udstrømning i HA1 og HA2 celler betydeligt. I modsætning hertil inhibitorer af MDR1, MRP1 og BCRP ikke påvirke retention farvestof i TD-celler (Fig 5D og 5E). Vi viste, at kombinationer af disse inhibitorer ikke øgede fluorescens intensitet TD-celler (data ikke vist), hvilket antyder, at aktiviteten af ​​de enkelte transportører ikke opvejes af andre transportører. Disse resultater indikerer ascites-afledte humane ovariecancerceller, men ikke primære tumorafledte celler, understøtter ABC transportør-afhængig efflux.

A og B. immortaliserede humane ovariecancerceller afledt af patientens ascites (HA1 og HA2 celler ) eller primær tumor (TD celler) blev inkuberet med udstrømningen ID grønt farvestof i 40 min. Fluorescensintensitet for hver betingelse blev målt ved flowcytometri. Histogram af hver cancercellelinie afledt af patientens ascites (HA1 eller HA2, blå) er overlejret med histogram af den primære tumor-afledte linie (TD; rød)). B. gennemsnitlige fluorescensintensitet (MFI) blev beregnet for hver linje fra tre uafhængige forsøg. Fold fald i geometriske gennemsnitlige fluorescensintensitet (GMFI) (i forhold til tumor-afledt linje) blev beregnet for hver cellelinie i tre uafhængige forsøg. Resultater er rapporteret som den gennemsnitlige gange fald fra tre uafhængige undersøgelser, behandlet (+/- SD). C. Total celleekstrakter blev opnået fra en primær tumor-afledt human ovariecancer cellelinje (TD), og fra hver af to ascites-afledte humane ovarie cancercellelinier (HA1, HA2). Ækvivalente mængder af ekstraherede proteiner blev underkastet SDS-PAGE og immunblotted med antistoffer specifikke for MDR1, MRP1, BCRP, eller beta actin, efterfulgt af en passende art IRdye-konjugeret sekundært antistof. Proteinbånd blev påvist ved Odyssey infrarød billeddannelse. Proteinbånd blev kvantificeret under anvendelse Billede J software (NIH). Forhold mellem den indikerede protein til beta actin er vist. D og E. Ascites-afledte og tumorafledte humane cellelinier blev inkuberet med eller uden inhibitorer er målrettet MDR1, MRP eller BCRP i 10 minutter og derefter inkuberet med udstrømningen ID grønt farvestof i 30 min. Prøver blev analyseret ved flowcytometri. Histogrammer (+ inhibitor vs – inhibitor) blev overlejret for hver linje (D). E. multiresistens aktivitet faktor (MAF) blev beregnet for hver prøve, og betyde MAF (+/- SD) fra tre uafhængige forsøg er vist for hver tilstand i E. MAF værdier, der ligger under baggrund, er angivet med gråt. Statistisk signifikante stigninger i MAF mellem ascites-behandlede og

in vivo

ascites celler (sammenlignet med ubehandlede celler) er angivet. * Angiver p 0,05. ** Angiver p. 0,01, t-test

Diskussion

æggestokkene kræftceller udvikler resistens over for kemoterapi efter kortvarig [7] eller langvarig [12, 14] behandling med kemoterapeutiske lægemidler. Begge maligne ascites [15] og kemo-resistens [19], er blevet forbundet med reduceret overlevelse af patienter med ovariecancer. I denne undersøgelse, viser vi, at murine ovariecancerceller (ID8) udviser øget taxan kemo-modstand, når de udsættes for ascites

in vitro

eller

in vivo

(sammenlignet med ID8 celler dyrket i normalt medium ). Til vores viden, vores arbejde er den første til at direkte demonstrere inducerbare kemo-resistens ved ascites supernatant.

Til dato, ingen undersøgelse har undersøgt en sammenhæng mellem tilstedeværelsen af ​​ascites [15] og MDR transport [20-22 ], selv om hver er en uafhængig risikofaktor forudsige dårlig prognose for patienter med ovariecancer. Undersøgelser har karakteriseret ekspressionsniveauet i MDR transporteren fra primære eller tilbagevendende ovariecancer væv [10] eller MDR1 polymorfi og æggestokkræft progression eller overlevelse [23]. Vores undersøgelse er ny i tyder på, at ascites er i stand til at drive ekspression og funktion af MDR transportører.