PLoS ONE: Amplikon-Dependent CCNE1 Expression er kritisk for Klonogen Overlevelse efter cisplatin behandling og er korreleret med 20q11 Gain i kræft i æggestokkene

Abstrakte

Genomisk forstærkning af 19q12 optræder i flere kræfttyper, herunder kræft i æggestokkene, hvor det er forbundet med primær behandlingssvigt. Vi systematisk svækket ekspression af gener i den minimalt defineret 19q12 region i æggestokkene cellelinier med korte interfererende RNA’er (siRNA) for at identificere driver onkogen (e) inden amplikonet. Knockdown af

CCNE1

resulterede i G1 /S fasen, reduceret cellelevedygtighed og apoptose kun i amplifikation-bærende celler. Selvom

CCNE1

knockdown øget cisplatin modstand i kortsigtede analyser, klonogen overlevelse blev hæmmet efter behandling. Gain af 20q11 var stærkt korreleret med 19q12 forstærkning og kalibreres en 2,5 Mb regionen, herunder

TPX2

, en centromerisk protein kræves for mitosespindelen funktion. Angivelse af

TPX2

var stærkt korreleret med genamplifikation og med

CCNE1

ekspression i primære tumorer. siRNA hæmning af

TPX2

reduceret cellelevedygtighed men denne effekt blev ikke amplikon-afhængig. Disse resultater viser, at

CCNE1

er en vigtig drivkraft i 19q12 amplikon kræves for overlevelse og clonogenicity i celler med locus forstærkning. Co-forstærkning på 19q12 og 20q11 indebærer tilstedeværelsen af ​​en kooperativ mutations netværk. Disse observationer har betydning for anvendelsen af ​​målrettede behandlinger i

CCNE1

afhængige ovariecancer

Henvisning:. Etemadmoghadam D, George J, Cowin PA, Cullinane C, Kansara M, Australian Kræft i æggestokkene Study Group et al. (2010) Amplikon-afhængig

CCNE1

Expression er kritisk for Klonogen Overlevelse efter cisplatin behandling og er korreleret med 20q11 Gain i kræft i æggestokkene. PLoS ONE 5 (11): e15498. doi: 10,1371 /journal.pone.0015498

Redaktør: Nathalie Wong, kinesiske University of Hong Kong, Kina

Modtaget: August 31, 2010; Accepteret: 17 Oktober 2010; Udgivet: November 12, 2010

Copyright: © 2010 Etemadmoghadam et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev finansieret af en National Health og Medical Research Council (NHMRC) projekttilskud 628.779 (www.nhmrc.gov.au). Den australske Kræft i æggestokkene Study er støttet af den amerikanske hær Medical Research og Materiel Kommando under DAMD17-01-1-0729, The Cancer Råd Victoria, Queensland Cancer Fund, The Cancer Råd New South Wales, The Cancer Råd South Australia, The Cancer Foundation af Western Australia, The Cancer Råd Tasmanien og NHMRC. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Avanceret etape serøse tumorer tegner sig for størstedelen af ​​invasive æggestokkene kræftformer og på trods af en generelt god første reaktion på cytoreduktive kirurgi og platinbaseret kemoterapi, de fleste kvinder står over for en høj risiko for tilbagefald og dårlig langsigtede overlevelse [1 ]. Platinbaserede midler, såsom cisplatin og carboplatin, er toksiske for delende celler som følge af dannelsen af ​​DNA-addukter, der resulterer i dobbelte strengbrud, aktiverende DNA beskadigelse-medierede apoptotiske signaler [2]. Reaktion på kemoterapi imidlertid vanskeligt at forudsige, og der er i øjeblikket ingen prædiktive biomarkører for serøse æggestokkene kræftformer i klinisk anvendelse. Vi har tidligere afbildet en region af 19q12 amplifikation forbundet med behandlingsresistente serøse ovarietumorer ved udførelse af en genom-dækkende undersøgelse af kopiantal forandringer [3]. Disse resultater var i overensstemmelse med tidligere rapporter om forstærkning blive associeret med dårlig samlet overlevelse [4], [5]. Ligeledes har tilbagevendende amplifikation af 19q12 blevet rapporteret i mange forskellige cancere, herunder esophageal [6], gastrisk [7], lunge [8] og endometriale tumorer [9].

19q12 amplifikation er en høj-niveau omdrejningspunkt forstærkning retter sig mod en klynge af kun flere gener på kromosom 19.

CCNE1

(cyclin E) er tidligere blevet foreslået som mål for forstærkning i ovariecancer [4], [10], [11], men en systematisk analyse af kendte gener i amplikon er ikke udført. Endvidere medens

CCNE1

amplifikation sandsynligvis tilvejebringer et onkogent stimulus gennem aktivering af cellecyklussen, er det ikke indlysende, hvordan den kan bidrage til primær kemoterapi modstand. For eksempel overekspression af

CCNE1 in vitro

gør ovariecancerceller mere følsomme over for platin agenter, formodentlig på grund af forøget proliferation [12]. Det er muligt, at den biologiske konsekvens af 19q12 amplifikationen ikke begrænset til overekspression af

CCNE1

, og at andre gener i amplikonet bidrager til tumorvækst eller progression. Desuden andre co-eksisterende mutationsbegivenheder andre steder i kræft genomet kan samarbejde eller forbedre den onkogene effekt af

CCNE1

overekspression.

Vi udførte et siRNA knockdown skærmen for alle kommenterede gener inden for og umiddelbart flankerer 19q12 amplikon i æggestokkene kræft cellelinjer med eller uden regional forstærkning. Vi fandt

CCNE1

at være den eneste gen målet inden amplicon, som reducerede cellelevedygtigheden i amplikon-holdige OVCAR-3 cellelinien efter siRNA knockdown.

CCNE1

knockdown induceret cellecyklusstop og apoptose, samtidig svække klonogen overlevelse efter cisplatin behandling, trods stigende

in vitro

lægemiddelresistens i en kortsigtet cytotoksicitet assay. I en sygdom indstilling, tyder disse resultater, at behandling svigt i

CCNE1

amplificerede tumorer kan vedrøre hurtig repopulation af tumoren efter kemoterapi og ikke cellulær resistens specifikt. Vi fandt også

TPX2

forstærkning og overekspression at være signifikant korreleret med

CCNE1

kopi nummer status indebærer tilstedeværelsen af ​​en kooperativ mutations netværk mellem disse gener.

Resultater

Focal forstærkning af 19q12 er fælles for forskellige tumortyper

Vi først forsøgte at sammenligne den minimale region kromosomal forstærkning ved 19q12 tværs af flere tumortyper. Vi opnåede data fra SNP-baserede høj opløsning kopi nummer undersøgelser, herunder 15 tumortyper [9], [13] for en sammenligning med vores resultater [3] (figur 1A). Minimale målrettede områder af forstærkning blev defineret af transportcenter, et analyseværktøj, der vurderer den statistiske signifikans af kopital begivenheder baseret på frekvens og amplitude [14]. Betydelig forstærkning af 19q12 var til stede i en tredjedel af de kræftformer analyserede. De tumortyper med 19q12 amplifikation, ca. 25% af individuelle prøver viste kopiantal gain, bortset endometriske tumorer, hvor en højere frekvens blev observeret (~45%) [9]. Minimal amplicon grænser viste sig at målrette en region mindre end 2 Mb i størrelse, centreret ved omtrent 35,0 Mb på kromosom 19. I begge æggestokkene tumor datasæt analyserede [3], [13] den minimale kortlagt region gevinst indarbejdet samme fem gener (

POP4

,

PLEKHF1

,

C19orf12, CCNE1 og C19orf2

), med lignende overlappende områder påvist i endometrie og brysttumorer. I modsætning hertil minimal region kortlagt i ikke-småcellede tumorer inkorporeret kun

CCNE1

mens et bredt område blev kortlagt i esophageal tumorer (~9.5 Mb), der spænder over 110 kommenterede gener. Kopi nummer ændring af 19q12 locus viste en grad af tumor specificitet, idet forstærkningen ikke blev set i 10 andre tumortyper for som var tilgængelige betydelige data, herunder småcellet, hepatocellulær, tyktarms og prostatakræft (data ikke vist). Vi bemærker også, at forstærkning af 19q12 er blevet identificeret af cDNA-array-CGH-analyse af gastriske tumorer [15], [16], men denne tumortype blev ikke medtaget, da vores analyse var begrænset til høj opløsning SNP kopi nummer data.

(A) Peak regioner af forstærkning mellem 30-46 Mb på kromosom 19 i

1non-småcellet [8], [13], [40], [41], [42];

2ovarian [3],

3 [13];

4endometrial [9];

5breast [13], [43], [44]; og

6esophageal tumorer [42]. Hyppighed og gener til stede i peak grænser angivet. (B) Affymetrix SNP 6.0 kortlægning microarray kopital af kromosom 19 i ovariale tumorcellelinier og (C) mellem 34-36 Mb for OVCAR-3 og SK-OV-3 cellelinier. Kopiér nummer vist er den gennemsnitlige bevægelige vindue på 20 markører kortlagt til humant marts 2006 (hg18) genom samling (kilde: Sanger Cancer Genome Project Arkiv). (D) Genekspression bestemmes af qPCR i OVCAR-3 celler i forhold til SK-OV-3.

For at identificere cellelinjer, der var repræsentative for primære tumorer for funktionelle undersøgelser, vi analyserede høj opløsning kopi SNP nummer data for 22 æggestokkene kræft cellelinjer på kromosom 19q12 (Sanger cancer Genome Project Arkiv) og identificeret syv cellelinier (OVCAR-3, OVCAR-4, Kuramochi, RMG-I, Caov-4, EFO-21, OVCAR-8) der havde overlappende amplifikation ved 19q12 (Figur 1B og Figur S1). Af de syv cellelinier, OVCAR-3 indeholdt et samlingspunkt, højt niveau forstærkning som bedst sammenfattet data fra primære ovarietumorer (figur 1C). Kvantitativ-PCR (qPCR) viste, at de fem gener i regionen på højt niveau forstærkning i OVCAR-3 (

POP4

,

PLEKHF1

,

C19orf12

,

CCNE1 og C19orf2

), men ikke flankerende gener (

UQCRFS1

ZNF536

), var over-udtrykkes i forhold til SK-OV-3 kontrol cellelinje mangler 19q12 forstærkning ( Figur 1D). Af de fem gener,

PLEKHF1

og

CCNE1

viste det højeste udtryk. Den 19q12-amplikon kan derfor kortlægges til en region der spænder over 34,4-35,4 af kromosom 19 og involverer 5 kommenterede gener, som hver især er overudtrykt i OVCAR-3.

Cellelinjer med amplifikation ved 19q12 er specifikt følsomme til

CCNE1

knockdown

Kort interfererende RNA (siRNA) blev anvendt til knockdown ekspression af de syv gener i og støder op til højt niveau 19q12 amplikon i OVCAR-3 og SK-OV 3 plus

GAPDH

og ikke-dæmpning (NS) kontrol. En skematisk af det eksperimentelle design, der anvendes til den kombinerede siRNA knockdown strategi og efterfølgende lægemiddelbehandling protokol er vist i figur 2A. Transcript niveauer for alle målrettede gener blev effektivt og specifikt reduceres op til 96 timer efter siRNA transfektion, med undtagelse af

ZNF536

, som flankeres regionen amplifikation (figur 2B). Ved at afhøre data fra en tidligere undersøgelse [17] fandt vi

ZNF536

udtryk for at være lav eller fraværende i primære serøse tumorer i æggestokkene, hvilket kan forklare en ikke-observerbar reduktion i genekspression (data ikke vist). Genekspression blev også overvåget i nærvær af cisplatin, som forberedelse til funktionelle eksperimenter.

PLEKHF1

,

CCNE1

,

C19orf2

og

ZNF536

var lidt opreguleret af cisplatin behandling i en eller begge cellelinier dog siRNA knockdown var stadig effektiv (figur 2B).

(A) Eksperimentel skematisk til kombineret siRNA transfektion og medicinsk behandling. (B) qPCR Heatmap viser log

2 genekspression forhold til utransficerede OVCAR-3 (øverst) og SK-OV-3 (nederst) celler for hver siRNA (kolonner) ved genmål (rækker) med eller uden cisplatin behandling 72 timer efter transfektion. (C) Cellelevedygtighed normaliseret til ingen siRNA kontrolceller efter transfektion med hver siRNA. Statistisk signifikans (t-test) beregnes ved sammenligning med ikke-silencing (NS) siRNA i den samme cellelinje ved hjælp af data fra tre uafhængige MTS assays udført med tredobbelte brønde pr tilstand. Gennemsnitlig normaliseret absorbans ved 490 nm og SEM plottet (n = 3), ** p-værdi 0,01. (D) Andel af apoptotiske celler vurderet af TUNEL farvning i ingen siRNA kontrol celler eller efter transfektion med NS eller

CCNE1

målrettet siRNA. De viste data fra tre uafhængige forsøg med dobbelte brønde analyseret pr tilstand. Gennemsnitlig procentdel af apoptotiske celler og SEM plottet (n = 3). *** P-værdi 0,0001 (Chi kvadreret) beregnet ved sammenligning af totale celletal mellem OVCAR-3 celler behandlet med en

CCNE1

siRNA og alle andre forhold. (E) CCNE1 proteinekspression ved Western blot for at bekræfte siRNA-medieret

CCNE1

knockdown på eksperimentel endpoint. (F) Cell levedygtighed i yderligere cellelinier efter transfektion med

CCNE1

eller ikke-tavshed siRNA’er normaliseret til hver cellelinje uden siRNA tilføjet. Statistisk signifikans (t-test) beregnes ved sammenligning med NS siRNA i den samme cellelinje. Gennemsnitlige normaliserede absorbans fra MTS-assay og SEM plottet (n = 3); * P-værdi 0,05, ** p-værdi. 0,01

Af de testede gener, kun

CCNE1

knockdown viste en signifikant reduktion i cellernes levedygtighed i OVCAR- 3 (til ca. 60% af NS kontrolceller; p 0,01, figur 2C).

CCNE1

knockdown havde ingen effekt på SK-OV-3 celler. I betragtning af dets rolle i G1 /S overgang, forventede vi, at udtømning af cyclin E1-protein ville inducere G1 arrest (se nedenfor) og resultere i en stigning af apoptotiske celler. TUNEL-farvning af ubehandlede celler var sammenlignelig (SK-OV-3, 0,1%; OVCAR-3, 0,2%) (figur 2D), mens

CCNE1

knockdown resulterede i en signifikant stigning i apoptose kun i OVCAR-3 (p 0,0001). Reduktion på protein overflod blev også valideret i begge cellelinier efter gen knockdown (Figur 2E).

have identificeret specifikke følsomhed OVCAR-3 til

CCNE1

knockdown, vi havde til formål at validere dette fund i uafhængige cellelinjer og afgøre, om den observerede effekt var amplikon afhængig. Vi udvidede derfor analysen til at omfatte yderligere tre cellelinjer med forstærkning på 19q12 (OVCAR-4, Kuramochi og OVCAR-8) og en yderligere uforstærkede linje (IGROV-1). En statistisk signifikant sammenhæng mellem antal kopier og genekspression af

CCNE1

blev fundet på tværs af alle linjer. Men OVCAR-8 viste ikke forøget

CCNE1

udtryk i forhold til genamplifikation (figur S2 A).

CCNE1

ekspression og cyclin E1 proteinniveauer blev effektivt reduceret i hver linje i forhold til basislinie-ekspression med siRNA-medieret knockdown (Fig S2 B og C). Som observeret i OVCAR-3,

CCNE1

knockdown specifikt nedsat levedygtighed i de ekstra linjer med 19q12 forstærkning, og kun marginalt i uforstærkede IGROV-1 (figur 2F). Således æggestokkene tumorceller med forstærkning på 19q12 er specielt følsomme over for nedbrydning af cyclin E1, sammenlignet med uforstærket linjer.

CCNE1

knockdown reducerer akut følsomhed over for cisplatin

I betragtning af den forening af 19q12 forstærkning med primær behandlingssvigt [3] og dårligt resultat [4], [5] vi søgt at undersøge effekten af ​​gen knockdown på narkotika følsomhed. Selvom vores analyse havde identificeret en specifik afhængighed af

CCNE1

i forstærkede linjer, vi først revurderes alle syv amplicon-associerede gener for indvirkning på kemoterapi respons i OVCAR-3 og SK-OV-3 ved hjælp af en 72- time cytotoksicitet assay. Cellerne blev behandlet med lige over en forudbestemt IC50 (se Methods S1) og levedygtighed målt. Knockdown af gener i amplikonet ikke signifikant indflydelse på cisplatin følsomhed enten cellelinie. Uventet blev cisplatin-induceret cytotoksicitet i OVCAR-3-behandlede celler dæmpes ved

CCNE1

inhibering (figur 3A). Vi udførte en dosis-respons analyse til at karakterisere yderligere effekten af ​​cisplatin behandling efter

CCNE1

knockdown. En statistisk signifikant ændring i dosis-respons-kurve blev observeret i OVCAR-3 (p 0,05, figur 3B), men ikke SK-OV-3 yderligere understreger modstand OVCAR-3 til cisplatin på

CCNE1

inhibering. I overensstemmelse med dette resultat, cisplatin havde nogen differentieret effekt på cellelevedygtighed i

CCNE1

Knockdown celler i forhold til siRNA kontroller i to af de tre ekstra 19q12 forstærkede linjer (Kuramochi og OVCAR-4) (figur 3C). I modsætning hertil gen knockdown forbedret virkningen af ​​cisplatin på cellelevedygtighed i begge cellelinier med lav basislinje

CCNE1

ekspression (OVCAR-8 og 19q12 uforstærkede kontrol IGROV-1).

( A) Cellelevedygtighed efter transfektion med individuelle siRNAs og cisplatin behandling normaliseret til cisplatin-behandlede kontrolceller uden siRNA. Cisplatin dosis på 3 pM eller 6 pM blev anvendt til OVCAR-3 og SK-OV-3-celler henholdsvis. Gennemsnitlig normaliseret absorbans (490 nm) fra tre uafhængige MTS assays (tre brønde pr betingelse) og SEM plottet (n = 3). (B) Cisplatin dosis-respons efter transfektion med

CCNE1

eller ikke-tavshed siRNA i OVCAR-3 og SK-OV-3 cellelinier. Pil angiver narkotikabehandling dosis anvendt i første skærmbillede; p-værdi indikerer betydningen af ​​forskellen mellem indbyggede kurver. Gennemsnitlige normaliserede MTS assay absorbans til celler uden cisplatin behandling, SEM og fire parametre monteret Hill slope plottet (n = 3 for hver medikamentkoncentration). (D) Cell levedygtighed efter transfektion med

CCNE1

eller NS siRNAs og cisplatin behandling normaliseret til cisplatin-behandlede ingen siRNA kontrol celler for hver cellelinie. Statistisk signifikans beregnet ved sammenligning med NS siRNA, cisplatin-behandlede celler i den samme cellelinje. Gennemsnitlige normaliserede absorbans fra MTS-assay og SEM plottet (n = 3). Se tabel S4 for cisplatin behandling doser.

For at undersøge resistente fænotype cisplatin observeret i OVCAR-3 celler med

CCNE1

knockdown, brugte vi flowcytometri til at analysere cellecyklusfordeling efter cisplatin behandling. Cisplatin behandling af OVCAR-3 resulterede i en forlænget S-fase (Figur 4a) SK-OV-3 celler standset overvejende i G2-fasen af ​​cellens cyklus (figur 4B). I overensstemmelse med kravet om cyclin E1 i G1 /S overgang [18],

CCNE1

siRNA knockdown induceret G1 anholdelse i OVCAR-3, tydeligst i overværelse af cisplatin (figur 4A). Derimod cellecyklus distribution af SK-OV-3 var uændret ved inhibering af

CCNE1

ekspression med eller uden cisplatin (figur 4B). Disse observationer var konsekvent i

CCNE1

forstærket Kuramochi og OVCAR-4-celler (Figur S3). Delvis G1 anholdelse blev også observeret i 19q12 uforstærkede IGROV-1 celler efter

CCNE1

knockdown dog kun som reaktion på cisplatin behandling. Som observeret i levedygtighed assay,

CCNE1 forstærket men lav-udtrykkende OVCAR-8 celler opførte sig på samme måde til at kontrollere linjer. Vi konkluderede derfor, at afhængigheden af ​​OVCAR-3, Kuramochi, og OVCAR-4 på høj

CCNE1

udtryk resulterede i en cellecyklusstop efter gen knockdown, herunder tilstedeværelse af cisplatin, sandsynligvis tegner sig for den tilsyneladende cisplatin modstand observeret i kortfristede rentabilitet analyser.

(A) OVCAR-3 celler og (B) SK-OV-3 cellecyklus profil (venstre) og andelen af ​​celler i G1, S eller G2 fase ( højre) for PI farvede celler analyseret ved flowcytometri 72 timer efter transfektion med

CCNE1

eller NS siRNA med eller uden cisplatin behandling (3 pM eller 6 pM for OVCAR-3 og SK-OV-3-celler henholdsvis).

for at forstå den langsigtede effekt af

CCNE1

udtynding på celle overlevelse efter cisplatin behandling vi analyseret den clonogenicity af linjer med og uden forstærkning af 19q12 locus (se skematisk figur 5A ).

CCNE1

knockdown dybt reduceret klonogene kapacitet OVCAR-3, men ikke SK-OV-3 i fravær af lægemiddel (figur 5B og 5C). I modsætning til øget resistens over for cisplatin i korte cytotoksicitetsassays,

CCNE1

dæmpning reduceret klonogen overlevelse OVCAR-3 celler efter cisplatin behandling (figur 5B). Vi udforske ikke

in vivo

effekter af

CCNE1

knockdown i æggestokkene tumor linjer med 19q12 forstærkning, som vi ikke var i stand til at generere levedygtige linjer med stabil lentivirus integration af short hårnål RNA (shRNA) rettet til

CCNE1

(data ikke vist).

(A) Eksperimentel tid-kursus for klonogen overlevelse assay efter siRNA transfektion og cisplatin behandling. Repræsentative krystalviolet farves (B) SK-OV-3 og (C) OVCAR-3 kolonier (øverst) og gennemsnitlige andel af adskilte kolonier dannet (nederst) i sammenligning med kontrolceller uden siRNA eller 1 time cisplatin behandling (3 pm eller 6 uM for OVCAR-3 og SK-OV-3-celler henholdsvis). Fejl søjler indikerer SEM (n = 3), ** p-værdi. 0,001

CCNE1

forstærkning er prædiktiv for dårligt resultat i primære tumorer

CCNE1

kopi nummer blev målt i 43 primære ovarietumorer fra patienter med fremskreden fase, serøs invasiv sygdom. Desuden indgår vi data fra 52 tumorer fra vores tidligere genomisk analyse af platin-resistens i kræft i æggestokkene [3] og opnåede matchende genekspression data for alle prøver [17]. Alle patienter gennemgik primær operation efterfulgt af platinbaseret kemoterapi. Klinisk oplysninger, der anvendes til at korrelere

CCNE1

status med overlevelse havde over to års yderligere akkumuleret patient opfølgende data (fra juni 2010) fra vores tidligere undersøgelser.

Patienterne blev stratificeret baseret på

CCNE1

kopiantal status som vurderet ved qPCR (se Materialer og fremgangsmåder). Ingen forskel blev bemærket mellem kliniske karakteristika for hver gruppe, bortset fra alder, med yngre patienter over-repræsenteret i

CCNE1

uforstærkede gruppe (tabel 1 og figur 6A).

CCNE1

genekspression viste en stærk korrelation med kopi nummer (figur 6B), og begge blev korreleret med progressionsfri overlevelse (PFS) (Figur 6C D).

CCNE1

kopi nummer, men ikke genekspression, var også forbundet med den samlede overlevelse (OS) (Figur 6E F). Den mest markante korrelation observeret var graden af ​​

CCNE1

gevinst og PFS (figur 6C), således at alle sager med højt niveau forstærkning viste progressiv sygdom inden cirka tolv måneder fra diagnose (gennemsnitlig PFS på 10,7 måneder; Tabel 1 ).

(A) Patient aldersfordeling stratificeret af

CCNE1

forstærkning status. Kruskal-Wallis p-værdi rapporteret, streger indikerer middelværdi og SEM. (B) Sammenhæng mellem

CCNE1

kopi nummer ved qPCR og genekspression signal ved microarray. (C) Kaplan-Meier analyse af

CCNE1

uforstærkede (n = 68), tjente (n = 21) og forstærkes (n = 6) ovariecancer patienter og (D)

CCNE1

lav (n = 31), medium (n = 28) og høj (n = 36), der udtrykker prøver til progressionsfri overlevelse og (E F) samlet overlevelse. Log-rank test p-værdier rapporteret. Stratificering af

CCNE1

kopi tal eller udtryk status beskrevet i materialer og metoder.

Forstærkning af 19q12 er korreleret med forstærkning ved 20q11

Efter at have identificeret

CCNE1

som en kritisk drivkraft i 19q12 amplikon i kræft i æggestokkene, vi ræsonnerede, at andre mutationer andre steder i genomet kan interagere med cyclin E1 eller være forbundet med resistens. For eksempel, at mutationer, der forbedrer effekten af ​​eller tillade tumorer tolerere

CCNE1

overekspression kan co-forekomme med 19q12 gevinst. Vi opnåede både SNP-baserede kopi nummer og genekspression data på 157 high-grade serøse invasive tumorer fra The Cancer Genome Atlas Project (TCGA) til analyse. For det første, vi undersøgte genekspression af gener, hvis protein produkter er nødvendige for behandling af cyclin E1 til aktive lavmolekylære former (

ELA2

CAPN2

) [19], [20] eller dens nedbrydning (

FBXW7

) [18]. Men ingen statistisk signifikant positiv sammenhæng mellem kandidat genekspression og

CCNE1

status blev observeret (data ikke vist). Vi korreleret derefter 19q12 gevinst med alle andre gevinster og tab inden for 0,1 Mb segmenter af genomet (se Metoder S1). De øverste tre korrelerede regioner kopi nummer forandring var på 20q11, 1p36 og 6q27 (figur 7A). Den mest markante tilhørende gevinst blev lokaliseret til en 2,5 MB region på kromosom 20 (figur 7B) og er blevet valideret i en separat uvildig analyse af genom-dækkende korrelationer af gevinst og tab i ovarietumorer [21].

(A) Circos plot viser regioner af kopi nummer ændring signifikant korreleret til

CCNE1

forstærkning (p-værdi 1 × 10

-5) (B) Betydningen af ​​kopi nummer korrelation til

CCNE1

amplifikation tværs kromosom 20. betydning tærskel anvendes til at definere korrelationsspidsen grænser angivet med stiplet linje. (C)

TPX2

udtryk korrelation med locus kopi nummer og

CCNE1

udtryk (kilde: TCGA). (D) Korrelation af

CCNE1

og

TPX2

genekspression i en uafhængig datasæt (Tothill et al., 2009).

For at indsnævre gen kandidater inden for de tre regioner mest sandsynlige til at interagere med

CCNE1

, vi næste korreleret udtrykket af gener inden for hver region med

CCNE1

udtryk (tabel 2). Angivelse af

TPX2

var mest signifikant associeret med

CCNE1

udtryk, og blev også korreleret til sin egen forstærkning status (Figur 7C). Forholdet mellem

CCNE1

og

TPX2

genekspression blev yderligere valideret i et andet uafhængigt datasæt (figur 7D). Den stærke sammenhæng mellem

TPX2

og

CCNE1

forstærkning og udtryk blev spændende, da TPX2 er en centromerisk protein kræves for mitosespindelen funktion under celledeling [22].

20q11 forstærkning gør celler resistente over for TPX2 knockdown

for at teste, om der var en funktionel afhængighed af

TPX2

i cellelinjer med forstærkning af 20q11 locus, og om det interagerer med

CCNE1

, vi vurderede

TPX2

status i linjer, der anvendes til vores knockdown eksperimenter.

TPX2

blev forstærket (figur 8A) og over-udtrykt (figur 8B) i ​​alle tre

CCNE1

forstærket og over-udtrykkende cellelinier (OVCAR-3, OVCAR-4 og Kuramochi) sammenlignet til styreledningen, SK-OV-3. Desuden har vi yderligere identificeret OAW-28 som havende højt niveau 20q11 amplifikation (figur 8A, data fra Sanger Cancer Genome Project Arkiv) og det højeste niveau af genekspression tværs af de testede cellelinier (figur 8B).

(A) Affymetrix SNP 6,0 kortlægning microarray kopi antal kromosom 20 i æggestokkene tumor cellelinier viser placeringen af ​​

TPX2

. (B) Sammenhæng mellem

TPX2

kopi nummer og genekspression ved qPCR i cellelinjer. (C) Cellelevedygtighed afbildet som normaliseret MTS absorbans (490 nm) fra tre uafhængige assays til celler behandlet med nogen siRNA i siRNA dobbelt Knockdown eksperimenter. Gennemsnitlige normaliserede absorbans fra MTS-assay og SEM plottet (n = 3). (E) TPX2 proteinekspression ved Western blot for at bekræfte siRNA-medieret knockdown på eksperimentel endepunkt for cellelinjer og CCNE1 i OAW-28 celler.

I modsætning til det nære forhold mellem

CCNE1

forstærkning og cellulære følsomhed over for gen knockdown, blev der observeret et omvendt forhold mellem

TPX2

kopi nummer og virkningerne af

TPX2

siRNA (figur 8C). For eksempel SK-OV-3-celler med lav genekspression (figur 8B) og minimal detekterbar TPX2 protein (figur 8D), var meget følsomme over for gen knockdown, hvorimod OAW-28-celler var væsentlige resistente. RT-PCR (figur S4) og western blot (figur 8D) analyser påviste effektive knockdown af

TPX2

imidlertid protein var stadig påviselig i nogle cellelinjer, der oprindeligt havde høje niveauer af TPX2 protein. Vi har også observeret, at knockdown af

CCNE1

resulterede i formindsket

TPX2

genekspression i 19q12 forstærkede linjer (Figur S4 A) tankevækkende, at

er TPX2

udtryk påvirket nedstrøms for cyclin E1 .

i betragtning af sammenhængen mellem

CCNE1

og

TPX2

forstærkning, vi også undersøgt, om samtidige knockdown af begge gener yderligere vil mindske levedygtigheden i cellelinjer indeholder både amplifikationer (figur 8C ). Efter vi tilladt for en konkurrencedygtig effekt af at kombinere siRNA’er (se metoder) ingen indlysende interaktion blev observeret med samtidig knockdown af

TPX2

og

CCNE1

. Knockdown af

CCNE1

havde minimal effekt på OAW-28 cellelevedygtighed trods effektiv reduktion protein i dobbelt Knockdown eksperimenter (Figur 8d). Dette fund er i overensstemmelse med vores første resultater, som OAW-28 celler ikke har 19q12 forstærkning (se figur S1 for OAW-28 kopi nummer på dette locus).

Diskussion

Vi har udført første systematiske siRNA knockdown af alle gener i minimalt defineret 19q12 amplikon i kræft i æggestokkene viser, at

CCNE1

er nøglen onkogene target. I betragtning af kendte roller cyclin E1 i kræft, herunder de-regulering af cellecyklus og fremme genomisk ustabilitet, det var den sandsynlige føreren af ​​19q12 locus, men andre gener ikke var blevet udelukket. For eksempel,

C19orf2

, som er umiddelbart op til

CCNE1

, er for nylig blevet kommenteret at kode URI, en utraditionel prefoldin protein. Undersøgelser af

C. elegans

URI homolog antyder en involvering i kromatin remodeling, forebyggelse og /eller reparation af endogent genotoksisk DNA-skader og vedligeholdelse af genom integritet [23]. For nylig URI er blevet identificeret som en vigtig hæmmer af protein fosfatase 1γ (PP1γ) og er involveret i reguleringen af ​​mTOR /S6K1 overlevelse vej baseret på næringsstoffer og vækstfaktor tilgængelighed [24]. På trods af disse spændende biologiske foreninger, fandt vi ingen tegn på URI som drivkraft for den 19q12 locus.

Reduktion i celle levedygtighed efter

CCNE1

knockdown var specifik for cellelinjer med 19q12 forstærkning, med begrænset eller ingen effekt i ikke-forstærkede linjer, hvilket indikerer en ‘afhængighed’ [25] til

CCNE1

deregulering. Vores resultater validere en nylig rapport viser forstærkning-specifikke følsomhed over for

CCNE1

dæmpning i OVCAR-3 og IOSE-29 celler [26]. Uforstærkede linjer syntes at omgå siRNA medieret G1 /S checkpoint anholdelse og apoptose, hvilket muligvis afspejler

CCNE1

uafhængige mekanismer cellecyklus de-regulering og distinkte onkogene processer. Interessant nok har forøget ekspression af CCNE1 nylig blevet vist i serøs tubal intraepithelial carcinoma (STIC), en planlagt precursor for høj kvalitet serøs carcinom [27]. Dette fund styrker betydningen af ​​

CCNE1

de-regulering i kræft i æggestokkene og foreslår det er en tidlig krav i tumor evolution.

19q12 forstærkning er stærkt forbundet med primær behandlingssvigt i ovarietumorer [3 ], og er derfor både en potentiel prognostisk markør og terapeutisk mål. Efter at have identificeret

CCNE1

som føreren af ​​19q12 forstærkning vi søgt at forstå, hvordan det bidrager til primær behandlingssvigt. I kortvarige cytotoksicitetsassays, overekspression af cyclin E1 øger følsomheden over for cisplatin [12].