PLoS ONE: Den Potente Cdc7-Dbf4 (DDK)-hæmmer XL413 Har Begrænset aktivitet i mange kræftceller og Discovery eventuelle nye DDK Inhibitor Stilladser

Abstrakt

Cdc7-Dbf4 kinase eller DDK (Dbf4-afhængig kinase) er forpligtet til at initiere DNA-replikation ved phosphorylering og aktivering af replikative Mcm2-7 DNA helicase. DDK overudtrykkes i mange tumorceller og er en ny kemoterapeutisk mål siden DDK inhibering forårsager apoptose af forskellige cancer celletyper, men ikke af normale celler. PHA-767.491 og XL413 er blandt en række potente DDK hæmmere med lav nanomolære IC

50 værdier mod den rensede kinase. Selvom XL413 er stærkt selektiv for DDK, dens aktivitet er ikke blevet grundigt karakteriseret på cellelinier. Vi målte anti-proliferative og apoptotiske virkninger af XL413 på et panel af tumorcellelinier sammenlignet med PHA-767.491, hvis aktivitet er godt karakteriseret. Begge forbindelser var effektive biokemiske DDK hæmmere men overraskende, deres aktiviteter i cellelinjer var stærkt divergerende. I modsætning PHA-767.491, XL413 havde signifikant anti-proliferativ aktivitet mod et af de ti testede cellelinjer. Da XL413 ikke effektivt at hæmme DDK i multiple cellelinier Denne forbindelse sandsynligvis har begrænset biotilgængelighed. For at identificere potentielle kundeemner for yderligere DDK hæmmere, vi også testet den krydsreaktivitet af ~400 kendte kinase inhibitorer mod DDK bruger en DDK termisk stabilitet shift assay (TSA). Vi identificerede 11 forbindelser, der i væsentlig grad stabiliseret DDK. Adskillige hæmmede DDK med samme effekt som PHA-767.491, herunder Chk1 og PKR kinase hæmmere, men havde forskellige kemiske stilladser fra kendte DDK hæmmere. Tilsammen disse data viser, at flere kendte kinase inhibitorer krydsreagerer med DDK og også fremhæve mulighed for at designe yderligere specifikke, biologisk aktive DDK hæmmere til brug som kemoterapeutika

Henvisning:. Sasi NK, Tiwari K, Snart FF, Bonte D, Wang T, Melcher K, et al. (2014) den potente Cdc7-Dbf4 (DDK)-hæmmer XL413 Har Begrænset aktivitet i mange kræftceller og Discovery eventuelle nye DDK Inhibitor Stilladser. PLoS ONE 9 (11): e113300. doi: 10,1371 /journal.pone.0113300

Redaktør: Irina V. Lebedeva, Columbia University, USA

Modtaget: Juni 30, 2014, Accepteret: 23. oktober 2014 Udgivet: 20. november 2014

Copyright: © 2014 Sasi et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Van Andel Institute (KM HEX MW) og National Institutes of Health (R01-DK071662 HEX). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Ingen af ​​forfatterne har nogen sammenhæng med Dr. Tong Wang eller virksomheden Translationel Drug Udvikling, Inc. anden måde end gennem Dr. Wang hjælp udtænkt og koordinere syntesen af ​​de to forbindelser forfatterne anvendt i undersøgelsen, som han er en medforfatter på dette manuskript. Der er heller ingen begrænsninger for datadeling eller materialer.

Introduktion

initiering af DNA-replikation er tidsmæssigt opdelt i to faser under cellecyklus. Først en inaktiv form af den replikative MCM (mini-kromosom vedligeholdelse) helicase læsset på oprindelsen DNA i G1 fasen og derefter aktiveres ved indrejse i og under S-fasen ved to sæt kinaser: cyclinafhængige kinase og Dbf4-afhængig kinase ( DDK) [1]. DDK er en to-subunit Ser /Thr-kinase består af Cdc7 kinase og Dbf4 regulatoriske underenheder. DDK medieret phosphorylering af seks-underenheden Mcm2-7 (MCM) helicase menes at fremkalde en konformationel ændring i dets struktur fører til helicase aktivering [2], [3]. MCM aktivering efterfølges af lokaliseret DNA afvikling, rekruttering af replisome maskiner og indledningen af ​​tovejs DNA-syntese [1]. Andre funktioner af DDK omfatter facilitering af kromosomal segregering i mitose og meiose [4], [5] om indledning af meiotisk rekombination [6], [7], og aktivering af DNA reparation veje, herunder trans-læsion DNA-reparation [8], [9].

Cdc7 kinase aktivitet afhænger af association med sin regulatoriske subunit, Dbf4 [10], [11]. Dbf4 er en cellecyklus reguleret protein, hvis overflod toppe under S-fasen og derefter nedbrydes ved slutningen af ​​mitose [12] – [14]. Interaktion med Dbf4 er nødvendig for Cdc7 ATP-binding og substrat anerkendelse [15]. Som alle proteinkinaser, at DDK krystalstrukturen afslører et aktivt sted i en dyb kløft mellem N- og C-terminale lapper [16], [17]. Den Dbf4 Zn-finger ( “motiv C”) binder til den N-terminale lap af DDK og er nødvendig for human DDK aktivitet, men er ikke afgørende for spirende eller fission gær DDK kinaseaktivitet [18] – [20]. Dbf4 motiv M øger sin associering med Cdc7 subunit og er nødvendig for den fulde aktivitet kinase i gær og mennesker [16], [18], [19], [21]. DDK phosphorylerer flere underenheder af MCM helicase [22] -. [24], og en nylig undersøgelse i spirende gær indikerer, at Cdc7 og Dbf4 fysisk interagere med adskilte underenheder af Mcm2-7 komplekse [25]

DDK er overudtrykt i en række af primære tumorer og tumorcellelinier [26] – [32]. DDK overekspression har også været forbundet med dårlig prognose i brystkræft [33], avanceret klinisk stadie i ovariecancer [34], og med aggressive fænotype i papillære skjoldbruskkirtlen karcinomer [35]. Niveauregulering af DDK i tumorceller er en attraktiv tumor terapeutisk strategi. Brug af neutraliserende antistoffer, Hunter og kolleger var den første til at vise, at DDK udtømning fører til alvorlig forstyrrelse af DNA-replikation i HeLa-celler [10]. Brug små interfererende RNA, Santocanale og kolleger viste yderligere, at DDK udtømning førte til p53-uafhængig apoptose i HeLa-celler mens et normalt menneske dermal fibroblast cellelinje undergik en reversibel celle-cyklus anholdelse [36]. HeLa-celler var ude af stand til at standse ved G1-S-faseovergang, forløber gennem en letal S-fase resulterer i celledød via apoptose. Denne opdagelse er blevet bekræftet i en række forskellige cellelinjer [37] – [39]. Vigtigt er tumorcelledød induceret ved depletering af DDK ikke ledsaget af induktionen af ​​kendte checkpoint markører. Lignende cellulære responser ses ved udtømning af andre komponenter i replikation indledning maskiner, herunder Cdc6-, Cdc45 og MCM2 underenheder [40], [41]. Tumorcellen specifikt drab observeret af udtømningen af ​​DDK har vakt interesse som et farmaceutisk mål for cancerterapi. Indsats fra flere medicinalfirmaer har ført til en række små molekyler DDK hæmmere (figur 1).

Den første velkarakteriseret DDK hæmmer var en pyrrolopyridinon molekyle (PHA-767.491, figur 1) [42 ], [43]. Det er en potent DDK hæmmer med en IC

50 af 10 nm med renset kinase. PHA-767.491 er også en effektiv cellevækst inhibitor, med en gennemsnitlig IC50 = 3,14 uM blandt 61 tumorcellelinier [43]. PHA-767.491 hæmmer også renset CDK9 med en IC

50 af 34 nm, men er en meget mindre potent inhibitor af mange andre kinaser testet [43]. Derfor PHA-767.491 er en dobbelt DDK /CDK9 inhibitor. Nylige undersøgelser har antydet, at inhibering af CDK9, en kinase, der er målrettet RNA-polymerase II, kan forbedre den apoptotiske respons induceret af PHA-767.491 i nogle cellelinjer [43] – [45]. Modifikationer af denne forbindelse førte til identifikation af adskillige andre potente inhibitorer af DDK med nogle udviser overlegen selektivitet og følsomhed [46] – [48]. XL413, et strukturelt forskellige DDK inhibitor, er en benzofuropyrimidinone baseret stof med en rapporteret IC

50 på 3,4 nM mod renset DDK og hæmmer celle-spredning af Colo-205 celler med en IC

50 af 2,69 pM [49] . Det var også meget selektive for DDK når testet mod et panel af 100 kinaser [49].

Den øgede aktivitet og selektivitet XL413 løbet PHA-767.491 blev rationaliseret af krystalstrukturen af ​​DDK i kompleks med to DDK inhibitorer [16]. En årsag XL413 kunne være en mere specifik inhibitor er, at det gjorde kontakt med tre af de mest variant rester i kinase aktive sted i forhold til PHA-767.491, som interagerede med to af disse rester. Det var derfor uventet at finde, at XL413 ikke var en særlig potent cellevækst inhibitor i de fleste af cellelinierne vi testede, da Cdc7 er afgørende for cellecyklusprogression. XL413 inhiberede proliferation og apoptose i Colo-205-celler som vist tidligere [49], men havde begrænset aktivitet i 9 andre tumor testede cellelinjer. Selv om begge forbindelser er sammenlignelige biokemiske DDK hæmmere, PHA-767.491 udviste overlegen aktivitet til XL413 i cellelinjer. Analyse af DDK-specifikke MCM2 phosphoryleringsniveauerne tyder på, at XL413 kan have ringe biotilgængelighed i disse og andre cancer cellelinjer. For at hjælpe til udvikling af yderligere DDK inhibitorer, testede vi, om kendt proteinkinaseinhibitorer (dvs. dem, der ikke har til formål at hæmme DDK) udviste krydsreaktion med DDK. Vi screenede ~400 forbindelser ved anvendelse af en termisk stabilitet shift assay (TSA) og identificeret 12 molekyler, skiftede den termiske stabilitet af DDK, flere med divergerende kemiske stilladser og med næsten tilsvarende styrke som PHA-767.491. Disse forbindelser er derfor usandsynligt at være særdeles specifik for et enkelt mål. Vores data fremhæve mulighed for at designe yderligere specifikke, biologisk aktive DDK hæmmere til brug som kemoterapeutiske midler.

Materialer og metoder

Syntese af PHA-767.491 og XL413

DDK inhibitorer, PHA-767.491 og XL413, blev syntetiseret som tidligere beskrevet [42], [49]. HPLC-analyse og massespektrometri blev udført på begge forbindelser, som bekræftede den korrekte molekylære masse og et højt renhedsniveau ( 99%) for både

Cellelinjer

HeLa-celler (ATCC. ) blev dyrket i MEM suppleret med Earles salte, 2 mM glutamin, 10% varmeinaktiveret føtalt bovint serum (HI FBS), 1,5 g /l natriumbicarbonat, 0,1 mM ikke-essentielle aminosyrer, 1 mM natriumpyruvat, 50 enheder /ml penicillin og 50 ug /ml streptomycin. MDA-MB-453 (ATCC) celler blev dyrket i DMEM suppleret med 4,5 g /L D-glucose, 4 mM L-glutamin, 110 mg /L natriumpyruvat, 10% HI FBS, 50 enheder /ml penicillin og 50 ug /ml streptomycin. HCC1954 (ATCC), HCC1187 (ATCC), BT-549 (NCI-60), MCF-7 (NCI-60), og Colo-205 (NCI-60) -celler blev alle dyrket i RPMI 1640 medium suppleret med 10% HI FBS, 50 enheder /ml penicillin og 50 ug /ml streptomycin. HCT-116 p53

+ /+ og p53

– /- cellelinjer blev dyrket i McCoys 5A-medium suppleret med 10% HI FBS, 50 enheder /ml penicillin og 50 ug /ml streptomycin. Alle celler blev holdt ved 37 ° C med 5% CO

2 i en fugtig inkubator.

DDK protein induktion

pKT37 er en pETDuet-1 (Novagen) -vector at sam- udtrykker His6-Smt3-HsCdc7 (codon optimeret, Genescript) og Dbf4 resterne 341-674, som indeholder motiver M og C kræves for at binde og aktivere Cdc7.

E. coli

BL21-RIPL blev transformeret med pKT37 og en frisk koloni blev dyrket natten over i LB indeholdende 150 pg /ml ampicillin, 50 ug /ml chloramphenicol og 1% glucose. To liter LB indeholdende 150 ug /ml ampicillin og 50 ug /ml chloramphenicol blev inokuleret med -60 ml overnatskultur at give en OD

600 på 0,1. Kulturen blev dyrket til en OD

600 på 0,8 og derefter induceret i 6 timer med 0,5 mM IPTG ved 25 ° C. Cellepelleten blev suspenderet i 20 ml Ni-NTA buffer A (20 mM HEPES-NaOH (pH 7,4), 250 mM NaCl, 10% glycerol) med 1X proteaseinhibitorcocktail (Roche) og 1 mM β-mercaptoethanol. En mikro fluidizer blev anvendt til at lysere cellerne, efterfulgt af en 30 minutters centrifugering (12.000 rpm, F13 rotor) ved 4 ° C.

DDK oprensning

DDK blev oprenset trinvis under anvendelse Nikkel -NTA, SP Fast Flow, og S-200 søjler. Cellelysatet indeholdende 35 mM imidazol blev påført en 25 ml Ni-NTA-søjle, vasket med 20 søjlevolumener, og derefter elueret med en 250 ml 35 mM-150 mM imidazol-gradient. DDK proteinfraktioner (~115 mM imidazol) blev samlet og dialyseret natten over ved 4 ° C mod 20 mM HEPES-NaOH, pH 7,4, 1 mM EDTA, 10% glycerol uden imidazol. Dialysatet blev derefter ledt over tre 5 ml SP Fast Flow-søjler (forbundet i tandem), vasket og elueret med en 100 ml 100 mM-0,5 M NaCl-gradient. DDK proteinfraktioner (-0,2 M) blev samlet, MgCl blev tilsat

2 til den poolede protein til at chelatere EDTA og inkuberet med PP2C (6His-GST-hab1) phosphatase anvendelse af en ækvivalent milligram beløb til det totale protein i puljen og 1/100 ækvivalent milligram mængde Ulp1 protease til spaltning af His6-Smt3 (Sumo) tag ved 16 ° C natten over. DDK blev analyseret på 15% SDS-gel til at kontrollere omfanget af dephosphorylering og Sumo spaltning (som var sædvanligvis større end 95%). Proteinet pulje blev sat på en anden Ni-NTA-søjle (uden imidazol) og strømme gennem fraktioner indeholdende DDK blev samlet, blev 1 mM EDTA tilsat til chelat fri Ni

++, og dialyseres natten over ved 4 ° C mod 20 mM HEPES (pH 7,4), 100 mM NaCl, 1 mM EDTA. Proteinet blev koncentreret under anvendelse af 30.000 MWCO spindekoncentrator (Amicon Ultra, Millipore) ved 4 ° C til et endeligt volumen på 10 ml. Koncentreret protein blev sat på en 300 ml S-200 gel eksklusion søjle (Amersham-Pharmacia). HsCdc7-Dbf4 eluerede ved -150 kDa, tæt på dimer værdi på 110 kDa. Samlet udbytte var typisk 6 til 8 mg.

In vitro Salg kinaseaktivering assays

20 ng oprenset humant DDK blev præ-inkuberet med stigende koncentrationer af hver DDK inhibitor for 5 min. Derefter 10 uCi (γ) –

32P ATP og 1,5 uM kold ATP blev tilsat i en puffer indeholdende 50 mM Tris-HCI (pH 7,5), 10 mM MgCl

2, og 1 mM DTT og inkuberet i 30 minutter ved 30 ° C. Proteinerne blev denatureret i 1X Laemmli-puffer ved 100 ° C efterfulgt af SDS-PAGE og autoradiografi på HyBlot CL film (Denville Scientific, Inc.). Auto-phosphorylering af DDK blev anvendt som en indikator for dets kinaseaktivitet.

32P-mærkede bånd blev kvantificeret ved anvendelse ImageJ og IC

50 værdier blev beregnet ved anvendelse af GraphPad (Prism 6).

Analyse af cellelevedygtighed

For assays i plader med 96 brønde 2500 celler blev udpladet pr brønd. Efter 24 timer blev cellerne behandlet med småmolekylære inhibitorer og inkuberet i 72 timer ved 37 ° C. Efterfølgende blev cellerne lyseret, og ATP indhold blev målt som en indikator for metabolisk aktive celler ved anvendelse af CellTiter-Glo assay (Promega). IC

50 værdier blev beregnet under anvendelse af GraphPad software. For analyser i seks brønde blev 100.000 celler forgyldt per brønd. Efter 24 timer blev cellerne behandlet med småmolekylære inhibitorer og inkuberet i varierende tidspunkter. Celler blev trypsinbehandlet og en suspension fremstilledes i 5 ml phosphatbufret saltvand. 30 pi af denne suspension blev blandet med 30 pi CellTiter-Glo-reagens efterfulgt af en 10 minutters inkubation ved stuetemperatur. Luminescens blev målt ved anvendelse EnVision 2104 Multilabel Reader (PerkinElmer) og BioTek Synergy Neo Microplate Reader.

Analyse af Caspase 3/7 aktivitet

5000 celler per brønd blev udpladet i en plade med 96 brønde. Efter 24 timer blev cellerne behandlet med småmolekylære inhibitorer og inkuberet i 24 timer ved 37 ° C. Caspase 3/7 aktivitet og levedygtige celler blev derefter målt under anvendelse af caspase-Glo 3/7 assay (Promega) og CellTiter-Glo assay (Promega), hhv. Den “Caspase aktivitet pr celle” blev opnået ved at normalisere total Caspase aktivitet til celle nummer.

immunoblotanalyse

Hele celleekstrakter fremstilles ved re-suspension af pellets i RIPA buffer (150 mM NaCl , 1% NP-40, 0,5% natriumdeoxycholat, 0,1% SDS, 50 mM Tris HCI, pH 8) indeholdende proteaseinhibitorer (100 uM PMSF, 1 mM benzamid, 2,5 ug /ml pepstatin A, 10 ug /ml leupeptin, og 10 pg /ml Aprotinin) og phosphatase inhibitorer (1 mM hver NaF, Na

3VO

4 og Na

4P

2O

7). Proteinkoncentration blev målt under anvendelse af BCA proteinassaykit (Pierce) ifølge producentens protokol. Lige store mængder protein blev underkastet SDS-PAGE og overført til en nitrocellulosemembran (Millipore). Transfer effektivitet og lige belastning blev bekræftet af Ponceau S farvning. Efter primære og sekundære antistof behandlinger, blev proteiner visualiseret ved hjælp SuperSignal West Pico løsninger (Thermo Scientific). Anti-MCM2 og anti-S53-phospho-MCM2 antistoffer blev købt fra Bethyl Laboratories; anti-β-actin var fra Sigma; anti-mus og anti-kanin HRP antistoffer var fra GE Healthcare; og anti-Cdc7 og anti-Dbf4 antistoffer blev beskrevet tidligere [26].

termisk stabilitet Shift Assay (TSA)

Alle reaktioner blev inkuberet i en 10 pi slutvolumen og analyseret i 96- brønd plader under anvendelse 20 x SYPRO Orange (Invitrogen) og 200 ug /ml oprenset DDK [50]. Reaktioner blev inkuberet med inhibitorforbindelser på is i 30 minutter. Forbindelser fra fire kinaseinhibitor biblioteker (Calbiochem I, II, III, Tocriscreen Inhibitor Toolbox) blev screenet ved 20 uM for T

m stiger med en total DMSO-koncentration på 2% eller derunder. Termiske smeltepunkter eksperimenter blev udført under anvendelse af StepOnePlus Real-Time PCR System (Applied Biosystems) smelte kurve program med en stigningsgrad på 1 ° C og temperaturer fra 15 ° C til 85 ° C. Efterfølgende TSAs på de 12 Hit blev udført som ovenfor, men i tre eksemplarer og under anvendelse af en 200 ganges område af inhibitorkoncentrationer. Dataanalyse blev udført som beskrevet [50]. Smeltetemperaturer (T

m) blev beregnet ved montering af S-formet smelte kurve til Boltzmann ligning ved hjælp af GraphPad Prism, med R

2 værdier af 0,99. Forskellen i T

m beregnede værdier for reaktioner med og uden forbindelser er AT

m.

Resultater

DDK hæmmere udviser meget forskellige cellulære kræfter

Vi screenede et panel af 15 brystcancercellelinier for Cdc7 og Dbf4 ekspression anvendelse af monoklonale antistoffer mod hver underenhed [26]. De fleste af disse udtrykker DDK underenheder svarende til eller højere end MCF10A, en udødeliggjort, men ikke-tumorigene brystepitel- cellelinie, der tjente som en ikke-tumor kontrol (figur 2). Vi anvendte PHA-767.491 og XL413 at inhibere DDK i et panel af seks brystcancercellelinier, der overudtrykker DDK på forskellige niveauer (markeret med stjerner i figur 2). Begge forbindelser er blevet rapporteret at have anti-proliferative aktiviteter i det lave mikromolære område [43], [49]. Som kontroller, sammenlignede vi disse resultater til PHA-767.491 behandling af HeLa-celler og XL413 behandling af Colo-205-celler, som inhiberer DDK og inducerer celledød. Da Cdc7 kinase er et vigtigt protein, hæmme dets aktivitet bør betydeligt langsom eller anholdelse celleproliferation. PHA-767.491 signifikant inhiberede proliferation i alle testede cellelinier (figur 3A værdier er plottet i forhold til kontroller bærestof). PHA-767.491 var mest effektive på HeLa og HCC1187 cellelinjer og havde den mindste effekt på MCF-7 [43] og MDA-MB-453 cellelinjer: 2 gange og 2,5 gange hæmmes henholdsvis. I modsætning hertil XL413 var antiproliferativ kun i Colo-205-celler (figur 3A).

Immunoblots viser ekspressionsniveauerne af Cdc7 og Dbf4 i tumorcellelinier. β-actin-niveauer indikerer ens belastning af proteiner.

(A) Eight tumorcellelinjer blev behandlet med 5 pM af hver DDK inhibitor og cellelevedygtighed blev målt 72 timer efter tilsætning af lægemidler. For at bestemme IC

50 værdier blev HCC1954 celler behandlet med stigende koncentrationer af PHA-767.491 eller XL413 (B) og cellelevedygtigheden blev målt 72 timer efter tilsætning af lægemidler. Colo-205 celler blev behandlet med stigende koncentrationer af PHA-767.491 eller XL413 (D) og cellelevedygtigheden blev målt 72 timer efter tilsætning af lægemidler. Omfanget af apoptose induceret af forbindelserne i hver cellelinje i forhold til vehikelkontrol blev målt ved caspase 3/7 aktivitet og er angivet i (C, E). Alle data repræsenterer gennemsnittet af mindst tre separate målinger +/- SD og var meget reproducerbar på separate dage.

Vi undersøgte derefter styrken profiler af begge forbindelser mere detaljeret ved hjælp af XL413-sensitive ( colo-205) og XL413-resistente (HCC1954) cellelinier. Celler blev inkuberet i nærvær af stigende koncentrationer af inhibitorerne i 72 timer ved 37 ° C efterfulgt af cellelevedygtighed målinger. PHA-767.491 inhiberede proliferation i begge cellelinier med en IC

50 på 0,64 uM i HCC1954 celler og 1,3 uM i Colo-205-celler (figur 3, B og D), i overensstemmelse med den gennemsnitlige 3.17 uM IC

50 værdi beregnet ved anvendelse af et panel af 61 tumorcellelinjer [43]. I modsætning hertil XL413 havde en IC

50 på 22,9 uM i HCC1954 celler og 1,1 uM i Colo-205-celler (figur 3, B og D). I korrespondance med levedygtighed data, PHA-767.491 induceret apoptose i både HCC1954 og Colo-205-celler, men XL413 induceret apoptose kun i Colo-205-celler (figur 2, C og E). XL413 var ikke en specifik hæmmer af kolorektale tumor linjer, fordi det havde begrænset effekt på yderligere to kolorektal tumorcellelinier: XL413 havde 40- til 60 gange højere IC

50 værdier end PHA-767491 på disse strækninger (Figur S1 i File S1).

PHA-767.491 og Xl413 er potente DDK hæmmere

in vitro

den dårlige potens af XL413 på de fleste tumorcellelinjer kunne være fordi den syntetiserede forbindelsen er ikke en effektiv kinase inhibitor. For at teste denne mulighed, vi renset rekombinant DDK og derefter målte IC

50 værdier af både XL413 og PHA-767.491 på renset kinase. Vi co-udtrykkes His6-SUMO-Cdc7 og Dbf4 i bakterieceller og derefter oprenset komplekset som beskrevet i Materialer og Metoder. Kort fortalt blev DDK bundet til en Ni-NTA-søjle efterfulgt af eluering og fjernelse af His6-SUMO tag. Ukodet DDK blev derefter fraktioneret over en SP Fast Flow kolonne efterfulgt af adskillelse på en S-200-gelfiltreringssøjle. Kinase assays blev udført med oprenset DDK (figur 4A) i nærvær af stigende koncentrationer af hver inhibitor (figur 4, B og C). Både PHA-767.491 og XL413 var effektive DDK hæmmere

in vitro

som vist tidligere [16], [42], [49] med IC

50 værdier på 18,6 nM og 22,7 nM. Da begge forbindelser er effektive DDK hæmmere, de relative levedygtighed celle profiler viser, at XL413 er mangelfuld i handler på sit mål inde i cellen.

(A) Coommassie-farvet gel viser 1 pg renset DDK fra bakterieceller. (Γ) –

32P ATP DDK kinaseassays i nærvær af stigende koncentrationer af PHA-767.491 (B) eller XL413 (C). Kinase aktiviteter repræsenterer gennemsnit af fire uafhængige målinger +/- SD på separate dage.

XL413 er defekt hæmme DDK-afhængig MCM2 fosforylering i HCC1954 celler

Effektiv cellulære optagelse af de DDK inhibitor bør gå på kompromis DDK aktivitet

in vivo

. Blandt de mange mål for DDK er komponenter af den replikative Mcm2-7 helicase. Serin 53 MCM2 underenhed er en velkarakteriseret målsted for DDK medieret phosphorylering [24]. Vi kvantificeres niveauer af phosphorylering på dette websted som et mål for DDK aktivitet

in vivo

. HCC1954 celler blev inkuberet i nærvær af 1 uM PHA-767.491, 2 uM PHA-767.491 eller 5 uM XL413. Celler blev derefter høstet ved 0, 24, 48 og 72 timer efter tilsætning af lægemidler til at måle levedygtige celler og MCM2 phosphorylering ved immunoblotting.

2 uM PHA-767.491 fuldstændig ophævet MCM2 phosphorylering af 24 timer i HCC1954 celler (figur 5A), svarende til dens indvirkning på cellevækst og levedygtighed (figur 5B). I den samme cellelinie, 1 uM PHA-767.491 resulterede i meget lidt resterende MCM2 phosphorylering fra 24 til 72 timer og var også effektiv til inhibering af cellernes levedygtighed og inducere celledød. I modsætning hertil XL413 ikke inhiberer MCM2 phosphorylering på 24 timer, selv ved en højere koncentration på 5 uM (figur 5A), og der var kun en beskeden nedgang i MCM2 phosphorylering efter 72 timer. Denne effekt blev også set i celleviabilitetstest, hvor XL413 behandlede celler steg kun lidt dårligere end køretøjets behandlede celler (figur 5B).

(A) immunoblots viser MCM2 fosforylering i HCC1954 celler eller (C) Colo -205 celler i nærvær af DMSO, PHA-767.491, eller XL413. (B) Celleproliferation profil HCC1954 celler eller (D) Colo-205-celler i nærvær af DMSO, PHA-767.491, eller XL413. Dataene levedygtighed celle repræsenterer middelværdien af ​​mindst to målinger +/- SD og var meget reproducerbar på forskellige dage.

Da begge forbindelser var effektive inhibitorer i Colo-205 celler, vi undersøgte MCM2 fosforylering i disse celler efter narkotikamisbrug. Igen, 5 uM PHA-767.491 fuldstændig ophævet MCM2 phosphorylering af 24 timer og var meget effektivt inducerer celledød (figur 5, C og D). Men i modsætning til i HCC1954 celler, XL413 var en meget effektiv inhibitor af DDK aktivitet i Colo-205-celler. 5 uM XL413 helt ophævet MCM2 phosphorylering ved 24 timer og var også så effektivt som PHA-767.491 til induktion celledød (figur 5, C og D). Disse resultater viser, at de to DDK hæmmere udviser meget forskellige profiler i cellelinjer trods for, at begge forbindelser er yderst effektive kinase inhibitorer

in vitro

. Vores data tyder på, at XL413 ikke optages effektivt i mange cellelinjer eller metaboliseres hurtigt eller modificeret til en inaktiv form.

Skærm for at bestemme krydsreaktivitet af kendte kinase inhibitorer med DDK

For at identificere yderligere kemiske strukturer, der er stand til at inhibere DDK testede vi et panel af ~400 kinaseinhibitorer mod oprenset DDK i en termisk stabilitet shift assay (TSA) [50]. I dette assay blev inhibitorforbindelser inkuberet med oprenset DDK og derefter screenes med en stigende temperaturgradient at bestemme det punkt, hvor de denaturere (i forhold til DDK alene) ved at følge fluorescensændringer af farvestoffet SYPRO Orange, som binder til hydrofobe overflader på udfoldet proteiner. Inhibitorforbindelser, der binder i DDK ATP-binding lomme forventes at stabilisere kinase, og AT

M værdier (se materialer og metoder) 2 ° C eller højere anses betydelige hits. Eksperimentelle resultater af 400 Forbindelse skærmen, er anført i figur S2 i File S1. Vi identificerede 12 forbindelser, der forårsagede betydelige temperaturskift:. 11 forbindelser udbyggede T

m, og en forbindelse (Genistein) faldt T

m (Tabel S1 i File S1)

For at estimere affinitet af hver forbindelse til DDK målte vi aT

M værdier for disse 12 forbindelser på tværs af en 200 ganges område af inhibitorkoncentrationer og sammenlignet disse værdier til PHA-767.491 (bestemt DDK inhibitor), staurosporin (et bredspektret proteinkinasehæmmer ), og DMSO som en vehikelkontrol. De i figur 6 data repræsenterer et gennemsnit af tre uafhængige målinger. Stoffet genistein, som er en EGFR-inhibitor, var usædvanlig, fordi den øgede AT

m ved lavere inhibitor koncentrationer og faldt derefter AT

m ved 5, 10 og 20 uM koncentrationer. Den indledende screening blev udført med 20 uM hæmmer og forklarer, hvorfor genistein blev scoret som faldende T

m. Måske forbindelse binder til DDK ATP-binding pocket men ved højere koncentrationer afbryder Cdc7-Dbf4 binding. Hver af de andre 11 forbindelser har positive AT

ms. Undersøgelse af sammensatte titreringer afslører, at tre-hæmmere havde sammenlignelige profiler til PHA-767.491 i, at de inducerede en AT

m ~ 2 eller flere begyndelsen på en 1 uM koncentration: en Rho-kinase inhibitor (RockOut), et protein kinase R (PKR) inhibitor og en Chk1 kinase inhibitor (SB218078). Fire yderligere forbindelser, den JAK3 inhibitor VI, PI3-Ka-inhibitor VIII, UCN-01 og K-252a gav en 3 gange eller højere AT

m ved 5, 10 og 20 uM koncentrationer.

Stigende koncentrationer af 12 hit-forbindelser opdaget i en 400 sammensatte skærm (tabel S1 i File S1) blev screenet mod oprenset DDK hjælp af TSA. PHA-767.491 (DDK specifik inhibitor), staurosporin (bredspektret kinase inhibitor) og DMSO er vist som kontroller. Dataene repræsenterer middelværdien af ​​tredobbelte målinger +/- SEM.

Strukturerne af de bedste forbindelser i skærmen TSA er vist i figur 7, afslører en bred vifte af strukturelle klasser. K-252a er naturligt forekommende alkaloid relateret til staurosporin som inhiberer en bred vifte af proteinkinaser, herunder serin /threoninkinaser og tyrosinkinaser af Trk familien [51], [52]. Så inddragelse af K-252a i denne liste (ligesom staurosporin) er måske ikke overraskende. Da det er meget sandsynligt, at inhibitorerne vi inddrevet i skærmen TSA stabiliserer DDK ved deres evne til at binde i ATP-bindende lomme og inhiberer DDK, udførte vi kinaseassays hjælp af de øverste seks forbindelser. Kinaseassays afslørede, at de faktisk er DDK hæmmere (Figur S3 i File S1). Den Chk1 (SB218078) og PKR hæmmere var de bedste forbindelser

in vitro

og hæmmede DDK med IC

50’erne i 19,3 nM og 67,5 nM (figur 8A og figur S3 i File S1). Interessant, AT

m profiler af de Chk1 og PKR inhibitorer ser påfaldende ligesom PHA-767.491, øge muligheden at disse forbindelser inhiberer DDK i celler. Selvom SB218078 er afledt af staurosporin, er en potent hæmmer af Chk1 [53]. Strukturerne af de andre top hits, PKR hæmmer og RockOut, ikke hidrører fra staurosporin og også adskiller sig fra kendte DDK hæmmere (figur 1).

De strukturer de 7 øverste forbindelser fra TSA hæmmer titreringer er vist sammen med PHA-767491 og XL413 strukturer til sammenligning (se tekst og tabel S1 i File S1 for yderligere detaljer). Tre forbindelser er afledt af staurosporin (nederste række), men de resterende fire forbindelser sig i adskilte strukturelle klasser.

IC

50 værdier for PKR-inhibitor (vist i figur 7) blev bestemt mod oprenset DDK (A) og HCC1954 celler (B). (C) Caspase 3/7 undersøgelser, som viser, at apoptose var stærkt induceret ved 24 timer efter PKR-inhibitor tilsætning og dette blev fjernet ved anvendelse af pan-caspaseinhibitor z-VAD. PKR-inhibitoren forårsager lignende fald i levedygtighed på HCC1954 celler til PHA-767.491 over tid (D) og også inhiberer MCM2 phosphorylering i celler, en kendt DDK target (E). Målingerne i panelerne A-D repræsenterer gennemsnit af mindst to målinger +/- SD og var meget reproducerbar.

Vi testede, om PKR og Chk1 hæmmere ville ændre cellevækst og hæmme MCM2 fosforylering i den HCC1954 brystkræft cellelinje, hvilket ville være stærke beviser, at de hæmmer DDK i celler. Stigende mængder af PKR hæmmer blev inkuberet med HCC1954 celler end 72 timer, hvilket resulterede i et stort fald i antallet af levedygtige celler i forhold til kontrol køretøj (figur 8B, IC

50 på 1,7 uM).