PLoS ONE: Celastrol inducerer Autophagy ved målretning AR /miR-101 i Prostata Cancer Cells

Abstrakt

Autophagy er en evolutionært bevaret proces er ansvarlig for nedbrydning og genanvendelse af cytoplasmatiske komponenter gennem autolysosomes. Målretning AR aksen er en standard strategi for prostatakræft behandling; Men rolle AR i autophagic processer er stadig ikke fuldt forstået. I den foreliggende undersøgelse fandt vi, at AR spillede en negativ rolle i AR Degrader celastrol-induceret autofagi. Knockdown af AR i AR-positive prostatacancerceller resulterede i forøget autofagi. Ektopisk ekspression af AR i AR-negative prostatacancerceller eller forstærkning af funktion af AR signalering i AR-positive celler, førte til suppression af autofagi. Da MIR-101 er en inhibitor af autofagi og dets ekspression blev reduceret sammen med AR i processen med celastrol-induceret autophagy, vi hypotesen, at AR inhiberer autofagi gennem transaktivering af

MIR-101

. AR bindingssted blev defineret i opstrøms af

miR-101

gen ved luciferase reporter og chip assays. MIR-101-ekspression korrelerede med AR status i prostata cancercellelinier. Hæmningen af ​​celastrol-induceret autophagy ved AR blev kompromitteret ved at blokere miR-101; mens transfektion af MIR-101 førte til inhibering af celastrol-induceret autofagi trods AR udtynding. Desuden mutagenese af AR bindingssted i

miR-101

gen medførte nedsat undertrykkelse af autophagy ved AR. Endelig blev autophagy hæmning af MIR-101 mimic sig at forøge den cytotoksiske virkning af celastrol i prostatacancerceller. Vores resultater viser, at AR hæmmer autofagi

via

transaktiveringsfunktion af

miR-101

, således kombination af MIR-101 efterligner med celastrol kan repræsentere en lovende terapeutisk tilgang til behandling af prostatacancer.

Henvisning: Guo J, Huang X, Wang H, Yang H (2015) Celastrol inducerer Autophagy ved målretning AR /miR-101 i Prostata Cancer Cells. PLoS ONE 10 (10): e0140745. doi: 10,1371 /journal.pone.0140745

Redaktør: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, ØSTRIG

Modtaget: Juni 13, 2015; Accepteret: September 30, 2015; Udgivet: 16 Oktober 2015

Copyright: © 2015 Guo et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. Dette arbejde blev delvist støttet af Natural Science Foundation of Heilongjiang provinsen, Kina (C201432), Innovation Research Project of Harbin, Kina (2012RFLXS011) og videnskabelig forskning Institut til Returnerede Overseas Chinese Scholars, Statens Uddannelsesstøtte Ministeriet

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Autophagy er en konserveret proces er ansvarlig for omsætningen af ​​lang. levede proteiner eller fjernelse af beskadigede organeller i eukaryote celler. Det er reguleret af serie af autophagy gener (ATGs), der er involveret i initiering, autophagosome dannelse og modning [1]. Autophagy sker normalt ved lave basalniveauer, men induceres som reaktion på stress stimulationer, herunder sult, hypoxi eller hormon deprivation [2]. Øget autophagy kan give en fordel for kræftceller til at beskæftige sig med de betingelser, der ikke er gunstige for at overleve.

Celastrol, en triterpenoid isoleret fra den traditionelle kinesiske medicin ‘Thunder Guds Vine “har vist effektivitet mod menneskelig prostatakræft

in vitro

in vivo

[3, 4]. Det fremmer destabilisering af androgen receptor (AR) gennem inhibering af Hsp90 eller aktivering af calpain [5, 6]. AR er medlem af steroidet superfamilie af ligand- aktiverede transkriptionsfaktorer. Det spiller en vigtig rolle i udviklingen og progressionen af ​​prostatacancer, således androgen deprivation terapi gennem medicinsk eller kirurgisk kastration er en standard strategi til behandling af prostatacancer [7]. Blokering AR signalvej er blevet vist at udløse autofagi i AR positive prostatacancer-cellelinier, som er gunstigt for celleoverlevelse eller celledød Afhængigt af det foreliggende specifikke inhibitorer og cellen sammenhænge [8-11]. Induktion af autophagy viste sig at forbedre cellernes levedygtighed ved androgen deprivation og hypoxi eller under sult vej [8, 9, 11]. AR Degrader blev vist at inducere celledød via induktion af autofagi [10]. Adskillige molekyler, såsom Grp78 og AMPK har vist sig at være involveret i reguleringen af ​​androgen deprivation induceret autophagy [8, 9]. Men som en transskriptionsfaktor, den mekanisme, hvormed AR regulerer autofagi er ikke fuldt ud forstået. Vores microarray data viste, at MIR-101-ekspression blev nedreguleret, når autofagi blev induceret ved celastrol. MIR-101 er blevet rapporteret som en hæmmer af autophagy, der undertrykker både induktion og modning af autophagy ved at målrette

ATG4D

,

RAB5A

STMN1

[12]. Desuden blev en AR-bindingssted forudsagt i regionen opstrøms for den

MIR-101

genet [13]. Disse resultater bedt vores hypotese, at celastrol inducerer autophagy ved at målrette AR /miR-101 i prostata kræftceller. I den foreliggende undersøgelse, vi bekræftet AR bindingssted i opstrøms region af

miR-101

gen ved luciferase reporter og chip assays. Ekspressionen af ​​MIR-101 viste sig at korrelere med AR status i prostata cancercellelinier. Trods AR tømt af celastrol, transfektion af miR-101 efterligne i LNCaP celler førte til hæmning af autofagi. Når miR-101 blev blokeret, blev AR hæmning på autofagi lettet. Desuden mutagenese af AR bindingssted i opstrøms region af

miR-101

gen førte til nedsat hæmning af AR-medieret autophagy.

Materialer og metoder

Kemisk og oligonukleotider

Celastrol blev købt fra Cayman Chemical Company (Ann Arbor, MI, USA). Alle oligonukleotider blev syntetiseret ved Ribio (Guangzhou, Kina) med de følgende sekvenser: MIR-101 mimic, 5′-UACAGUACUGUGAUAACUGAA-3 ‘; miRNA efterligner Negativ kontrol (Ncontrol) # 22: 5’-UUUGUACUACACAAAAGU ACUG-3 ‘, MIR-101 inhibitor: 5′-UUCAGUUAUCACAGUACUGUA-3′; miRNA-hæmmer Ncontrol # 22: 5’-UCACAACCUCCUAGAAAGAGUAGA-3 ‘. siRNA til AR: 5’-GGTGATCACAGGATAGGTATT-3 ‘, siRNA til kontrol: 5′-GGGCCATGGCA CGTACGGCAAG-3’.

Cell kultur og celle transfektion

menneskelige prostata cancer cellelinjer LNCaP, 22Rv1 , DU145 og PC-3 blev opnået fra Shanghai Institute of Biochemistry and Cell Biology (Shanghai, Kina), og dyrket i RPMI 1640 (Gibco BRL Co. Ltd., USA) suppleret med 10% kalvefosterserum (Biological industrier, Israel) og 1% penicillin /streptomycin i et 37 ° C fugtig atmosfære indeholdende 5% CO

2/95% luft.

i androgen sult, LNCaP-celler blev dyrket i phenolrødt-frit RPMI 1640-medier (Gibco BRL Co. Ltd., USA) indeholdende 1% trækul-strippet FBS (Invitrogen, Eugene, OR, USA) i 24 timer før forsøg.

Transfektion blev udført ved anvendelse af Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Eugene, OR, USA). Transient transfektion af pEGFP-C1-AR eller tom vektor (Addgene) blev udført i LNCaP eller PC-3-celler. Efter transfektion blev mediet erstattet med frisk medium indeholdende 1 nM R1881. Stabil transfektion af pEGFP-C1-AR eller tom vektor blev udført i DU145-celler. Celler blev forbehandlet med R1881 (1 nM) i 24 timer før eksperimentet. LNCaP-celler blev transficeret med pEGFP-LC3 (Addgene) og selekteret med 0,8 mg /ml G418 (Calbiochem, Merck KGaA, Darmstadt, Tyskland) for at opnå stabile transfektanter.

Plasmider

pGL3-Basic var en generøs gave fra Dr. Li Yu (Harbin Institute of Technology, Kina). For at generere reporterkonstruktioner, pGL3-B-MIR-101-L og pGL3-B-MIR-101-S, et 1793 bp DNA-fragment i opstrøms for

MIR-101

gen, som indeholder det forudsagte AR bindende site og dets kortere fragment med deletion af det forudsagte AR-bindingssted blev amplificeret under anvendelse af primere 5′-CGCACGCGTAATGGATTTATTTCCTACCCT ACAT-3 ‘; 5’-CCGCTCGAGTATTCCCTGCCACCCAGCTCACC-3 ‘, og 5′-CGCAC GCGTAATGGATTTATTTCCTACCCTACAT-3′; 5’-CCGCTCGAGTATTCCCTGCC ACCCAGCTCACC-3 ‘, henholdsvis og klonet ind pGL3-Basic vektor. Reporterkonstruktet der indeholder et 300 bp fragment med den forudsagte vildtype AR bindingssted, pGL3-B-MIR-101-WBS, blev amplificeret med PCR under anvendelse af primerne 5’-CGCACGCGTAATGGATTTATTTCCTACCCTACAT-3 ‘, og 5’-CCGCTCGAG CTTTCTTCTTTTGTTTTTCATTTTC- 3 ‘. At mutagenisere det forudsagte AR bindingssted i pGL3-B-miR-101-WBS (betegnet pGL3-B-miR-101-MBS), to-trins PCR blev udført. For det første trin PCR, følgende primere (muterede nukleotider blev angivet med små bogstaver): 5’-CGCACGCGTAATGGATTTATTTCCTACCC TACAT-3 ‘; 5’-TAACTTTAtAgaATATTtaAgATAG-3 ‘, 5′-CTATcTtaAATATtcTaTAA AGTTA-3′; og 5’-CCGCTCGAGCTTTCTTCTTTTGTTTTTCATTTTC-3 ‘blev anvendt. PCR-produkterne blev anvendt som template for det andet trin PCR ved anvendelse af ydre primerpar.

pGL3-B-MIR-101W konstruktion blev dannet ved PCR-amplifikation af et 2166 bp DNA-fragment indeholdende både AR bindingssted og mIR-101-gensekvens under anvendelse af primere 5′-CGCACGCGTGCCTTGGTCAGACTGGAT-3 ‘, 5′-CCGCTCGAGAT GTTACCACGCCATTTA-3′, og kloning i pGL3-Basic-vektoren. Dens mutant form af konstruktionen, pGL3-MIR-101m, blev genereret med totrins PCR som beskrevet ovenfor under anvendelse af to par primere indeholdende et mutant AR bindingssted 5’-CGCACGCGTGCCTTGGTCAGACTGGAT-3 ‘; 5’-TAACTTTAtAgaATATTtaAgATAG-3 ‘, og 5′-CTATcTtaAATATtcTaTAAAGTTA-3′; 5’-CCGCTCGAGATGTT ACCACGCCATTTA-3 ‘. Små bogstaver indikerer de muterede nukleotider.

Kvantitativ realtids-PCR

Totalt RNA blev ekstraheret fra celler under anvendelse af TRIzol-reagens (Invitrogen, Eugene, OR, USA). I alt 1,0 ug totalt RNA blev anvendt til at syntetisere komplementært DNA under anvendelse EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix (transgen, Beijing, Kina). qPCR blev udført for at bestemme ekspressionsniveauerne af hvert gen under anvendelse af følgende primere: ATG5: 5′-GCAAGCCAGACAGGAAAAAG-3 ‘, 5′-GACCTTC AGTTGGTCCGGTAA-3′; ATG7: 5’-CAGGAGATTCAACCAGAGAC-3 ‘, 5′-AGAT ACCATCAATTCCACG G-3′; AR: 5’-CAGCAACAGCAGCAGGAAGC-3 ‘; 5’-CTTT TGCATTCGGCCAATGG-3 ‘; GAPDH: 5’-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3 ‘; 5’-G GCATGGACTGTGGTCATGAG-3 ‘. Pri-MIR-101: 5’-GTATTTCGTAGGACAGG-3 ‘; 5’-TCTACAGGAAGCGAGT-3 ‘. Data blev normaliseret til GAPDH ekspressionsniveauer.

miRNA ekspression blev analyseret som beskrevet af Shi

et al

[14]. Kort beskrevet blev totalt RNA (1 ug) polyadenyleret anvendelse af poly (A) hale Kit (Ambion Inc., Foster, CA) ifølge producentens instruktion. Efter phenol-chloroform-ekstraktion og ethanolfældning blev RNA’et revers-transkriberet med EasyScript revers transkriptase (transgen, Beijing, Kina) og 0,5 ug af poly (T) adapter 5′-GCTGTCA ACGATACGCTACGTAACGGCATGACAGTGT (24) N (A /C /G ) -3 ‘ifølge producentens protokoller (Invitrogen, Eugene, OR, USA). MIR-101-ekspression blev bestemt ved anvendelse af primere 5’-GCTGTCAACGATACGCTA-3 ‘og 5′-CAGTACTGTG ATAACTGAA-3’. Dataene blev præsenteret som et gennemsnit af tre forsøg og normaliseret til ekspressionen af ​​endogent U6 RNA ved anvendelse ΔΔCT metode.

Western blot-analyse

Helcellelysater blev fremstillet ved anvendelse RIPA-buffer indeholdende 10 mM Tris -HCI (pH 8,0), 150 mM NaCl, 0,1% natriumdodecylsulfat, 0,8% Triton X-100 og protease inhibitor cocktail (Roche, Mannheim, Tyskland). Western blotting blev udført som beskrevet i [15]. Kort beskrevet blev 40 til 100 ug proteiner pr brønd adskilt ved polyacrylamidgel og derefter elektro-overført til PVDF-membraner. Efter 2 timers blokering, blev membranerne vasket og undersøgt med de følgende primære antistoffer: kanin anti-LC3, muse-anti-P62 og anti-PARP (Cell Signaling Technology, USA), muse-anti-GAPDH (KC-5G4) (KANGCHEN , Shanghai, Kina), mus AR (sc-816) og mus PSA (sc-7316) (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA). Proteinekspression blev opdaget af ECL (PPLYGEN, Beijing, Kina) og visualiseret ved hjælp af LI-COR Odyssey 2800 (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE, USA).

luciferasereporteren analyser

DU145 prostatacancerceller blev udpladet i plader med 24 brønde (1 x 10

5 per brønd) i 24 timer og co-transficeret med 300 ng reporterkonstruktioner (pGL3-B-MIR-101-L, pGL3-B-mir -101-S, pGL3-B-mIR-101-WBS, pGL3-B-mIR-101-MBS eller pGL3-Basic), 300 ng af pEGFP-C1-Ar eller pEGFP-C1 plasmider og 10 ng pRLSV40 (Promega , San Luis Obispo, CA, USA) under anvendelse af Lipofectamine 2000. Efter transfektion blev mediet erstattet med frisk medium indeholdende R1881 (1 nM) og høstet 24 timer senere. Luciferaseaktiviteter blev analyseret under anvendelse af dual-luciferase reporter assaysystem (Promega, San Luis Obispo, CA, USA) i et Turner TD20 /20 luminometer og normaliseret til Renilla luciferaseaktivitet.

chip assays

chippen blev udført som tidligere beskrevet [16]. Kort fortalt blev DU145 eller LNCaP-celler transficeret med pEGFP-C1-AR eller pEGFP-C1. Efter 24 timer transfektion blev mediet erstattet med frisk medium indeholdende 1 nM R1881 natten over. Celler blev høstet og tværbundet med 1% formaldehyd i 10 minutter ved 37 ° C. Fikserede celler blev vasket med iskold phosphatbufret saltvand og resuspenderet i iskold hypotonisk puffer (10 mM HEPES, 1,5 mM MgCl

2 og 10 mM KCI), efterfulgt af homogenisering. Samlede kerner blev resuspenderet i hypotonisk buffer og sonikeret til et gennemsnitligt DNA længde på 200 til 1000 bp. Prøver (1%) af forskydningspåvirket DNA blev fjernet som input, og resten blev anvendt til enkelte chip reaktion ligeligt. Kromatin opløsninger blev klaret ved tilsætning af protein A-sepharose (GE Healthcare, Fairfield, USA) i 2 timer og inkuberet med 10 ug AR antistof eller IgG som en negativ kontrol natten over ved 4 ° C. Protein /DNA immunkomplekser blev opsamlet ved centrifugering ved 4 ° C, vasket med fortyndingspuffer (20 mM Tris, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA og protein-cocktail), og elueringspuffer (0,1 M NaHCO

3 og 1% SDS). Protein /DNA-tværbindinger blev tilbageført ved tilsætning af NaCI til en slutkoncentration på 200 mM efterfulgt af inkubation ved 65 ° C i 4 timer. Efter DNA oprensning blev PCR udført for at detektere MIR-101-ekspression ved anvendelse af følgende primere: 5′-CGCACGCGTAATGGATTTATTTCCTACCCTA CAT-3 ‘, og 5′-CCGCTCGAGCTTTCTTCTTTTGTTTTTCATTTTC-3’. PCR-produkterne blev analyseret på agarosegeler (2%) med ethidiumbromid.

Konfokal mikroskopi

LNCaP-celler med GFP-LC3 ekspression blev podet i plader med 6 brønde. Efter celastrol behandling blev cellerne fikseret i 4% paraformaldehyd i 15 minutter og vasket med PBS tre gange. Celler blev derefter permeabiliseret med 0,05% (v /v) Triton X-100, farvet med DAPI (Invitrogen, Eugene, OR, USA) og analyseret under anvendelse konfokalt mikroskop (Zeiss, LSM510). Antallet af GFP-LC3 punktformet blev kvantificeret. Positive celler, som indeholdt fem eller flere puncta blev udvalgt. Halvtreds celler pr betingelse per eksperiment blev analyseret.

MTT-assays

LNCaP-celler blev udpladet i en 96-brønds plade (5000 /brønd). Efter behandlingerne blev MTT (5 mg /ml) tilsat og inkuberet ved 37 ° C i 4 timer for at tillade fuldstændig spaltning af tetrazolium-salt ved metabolisk aktive celler. Cellelyse-buffer (20% SDS, 20 mM HCI) blev tilsat til hver brønd, efterfulgt af kolorimetrisk analyse ved anvendelse af en iMark Microplate Absorbans Reader (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) ved 595 nm.

Colony dannelse assays

LNCaP-celler blev behandlet med celastrol i nærvær eller fravær af mIR-101 mimic eller negativ kontrol eller bafilomycin A1 (Sangon biotech, Shanghai, Kina) i 24 timer. Efter behandlingerne blev LNCaP-celler (500 /brønd) udsået i seks-brønds plade og dyrket i 15 dage uden forstyrrelse. Celler blev derefter fikseret med 4% formaldehyd i PBS og farvet med krystalviolet. Kolonier med over 50 celler blev talt.

Statistik analyse

Statistisk analyse blev udført ved hjælp af SPSS statistisk software. Alle værdier blev udtrykt som middelværdi ± SD blev to gruppesammenligninger udført ved anvendelse parret t-test. Data fra flere grupper blev analyseret ved envejs ANOVA efterfulgt af Dunnetts test. For alle testene blev signifikansniveau defineret som * eller #,

P

0,05; **,

P

. 0,01

Resultater

Celastrol inducerer autophagy i humane prostata kræftceller

Målretning AR med celastrol for prostatakræft behandling har blevet vist af adskillige grupper [3, 5]. Da AR inhibering er forbundet med autophagy induktion, også celastrol kunne inducere autofagi i human prostatacancer-celler blev bestemt. Som vist i figur 1, induktion af autophagy gener

ATG5

ATG7

blev observeret ved tidlige tidspunkter efter celastrol behandling i LNCaP-prostatacancerceller (figur 1A). ATG7 fungerer som ubiquitin E1-lignende enzym mens ATG5 fungerer som ubiquitinering substrat eller en E3-lignende enzym i to trin ubiquitinering proces [1]. I overensstemmelse med deres funktioner i autophagy induktion,

ATG7

viste højere udtryk og tidligere respons end

ATG5

på celastrol behandling (Fig 1A). Både ATG5 og ATG7 er nødvendige for rekruttering af LC3, mikrotubuli-associeret protein, som spredes i cytoplasmaet, at autophagosome membran. At visualisere LC3 rekruttering blev LNCaP-celler transficeret med et plasmid kodende for GFP-mærkede LC3. GFP-LC3 puncta blev observeret at stige markant efter 6 timer behandling med celastrol (Fig 1B og 1C). I overensstemmelse, konvertering fra LC3-I til sin lipid formular LC3-II, kendetegnende for autophagy, blev opdaget efter 3-6 h behandlinger og øget mærkbart efter 12-24 h behandling (Fig 1D). P62 er en receptor på autophagosome membran, som nedbrydes i lysosomer efter autophagosome fusion med det [17]. P62 proteinniveau blev reduceret efter 6-24 timer behandling med celastrol (Fig 1D), hvilket yderligere bekræfter, at celastrol induceret autofagi i LNCaP-celler.

Parental LNCaP-celler (A, D) eller celler transficeret med GFP-LC3 (B, C) blev behandlet med celastrol ved 2,0 uM for angivne tider. mRNA udtryk for Autophagy relaterede gener blev målt ved qPCR (A). RQ, relative mængde. GFP-LC3 transficerede celler blev farvet med DAPI efter behandlinger. GFP-LC3 puncta blev observeret under konfokalt mikroskop (B) og kvantificeres C. De celler, indeholdt over 5 puncta blev udvalgt og halvtreds celler blev analyseret for hver behandling. D, Protein ekstrakter blev immunoblottedes med antistoffer mod LC3, P62 og GAPDH (lastning kontrol). En asterisk angiver signifikans sammenlignet med kontrol (0 h). *,

P

0,05; **,

P

. 0,01

AR ekspressionsniveauerne omvendt korrelerer med celastrol-induceret autophagy

I de samme prøver fra oven, AR protein blev reduceret ved celastrol under autofagi overtalelse processer. Celastrol behandling forårsagede et betydeligt fald i AR ekspressionsniveauerne på 3-6 h tidspunkter og en næsten fuldstændig udtømning på 12-24 h tidspunkter (Fig 2A). I overensstemmelse med ovenstående konklusioner, siRNA knockdown af AR i AR positive LNCaP celler førte til ~ 2 gange forøgelse af LC3-I til LC3-II konvertering (Fig 2B). Sammenlignet med kontrolgruppen, blev P62-protein faldt med AR siRNA (Fig 2B), hvilket indikerer, at AR reguleres negativt autofagi. Syntetisk androgen R1881 blev brugt til at aktivere endogen AR signalering i LNCaP celler, som fremgik af de øgede protein niveauer af AR og sit mål PSA (fig 2C). Med AR signaleringsaktivering blev autofagi inhiberet som vist ved stigningen i P62-niveau og halv gange formindskelse af LC3-II /LC3-I-forholdet (Fig 2C), hvilket yderligere bekræfter, at AR spiller en negativ rolle i autophagy regulering. Desuden blev pEGFP-AR transficeret i LNCaP-celler. Efter celastrol behandling, nedsat omdannelse af LC3-I til LC3-II blev påvist i pEGFP-AR transficerede celler sammenlignet med mock-transfektion (Fig 2D), hvilket indikerer, at tvungen AR overekspression inhiberet autofagi udløst af celastrol. Celastrol inducerede også autofagi i AR negative DU145 celler, som kan undertrykkes ved exogen AR (Fig 2E).

A, LNCaP-celler blev behandlet med celastrol ved 2,0 uM angivne antal gange, proteinniveauet af AR blev afsløret ved Western blotting ved anvendelse GAPDH som en loading kontrol. B, blev LNCaP-celler transficeret med AR siRNA eller kontrol siRNA i 24 timer blev virkningerne på AR knockdown og autophagy induktion verificeret ved Western blotting under anvendelse af AR, LC3, P62 og GAPDH (ladningskontrol) antistoffer. C, LNCaP-celler blev udsat for androgen sult som beskrevet i “Materialer og metoder”, efterfulgt af 1 nM R1881 behandling i 24 timer. AR og dens target PSA, samt autophagic beslutningstagere LC3 og P62 blev detekteret ved Western blotting ved anvendelse af GAPDH som en loading kontrol. LNCaP (D) eller DU145 (E) -celler blev transficeret med pEGFP-C1-AR (EGFP-AR) eller tom vektor (EGFP-V). D, Efter transfektion LNCaP-celler blev dyrket i medium indeholdende R1881 (1 nM) og behandlet med eller uden celastrol (CEL) ved 2,0 uM i 24 timer (D). E, blev DU145 stabilt transficerede celler forbehandlet med R1881 (1 nM) i 24 timer før celastrol behandling som D. LC3 blev detekteret ved Western blotting ved anvendelse af GAPDH som en loading kontrol.

AR medierer suppression af miR-101-ekspression ved celastrol behandlinger

for at se miRNA involvering i processen med celastrol-induceret autophagy blev LNCaP celler behandlet med celastrol i 12 timer for at inducere autofagi. MiRNA matrix blev udført og viste, at ekspressionen af ​​MIR-101, en autophagy inhibitor, blev reduceret med celastrol (data ikke vist). Undertrykkelse af MIR-101-ekspression ved celastrol blev bekræftet ved RT-PCR, hvilket afslørede en ~ 3 gange formindskelse af PRI-MIR-101 og moden MIR-101 i LNCaP-celler skrive celastrol behandling (Fig 3A, venstre og midten). Dette var ledsaget af en næsten fuldstændig udtømning af AR (Fig 3A, højre), hvilket tyder på en positiv korrelation mellem AR og miR-101 udtryk efter celastrol behandling. AR er en transskriptionel faktor og dens bindingssted er blevet forudsagt i opstrøms region af

miR-101

gen [13]. Således er det tænkeligt, at AR er formidler af undertrykkelsen af ​​miR-101-ekspression ved celastrol. For at teste denne mulighed, vi først bestemmes, hvis AR kunne binde sig til det forudsagte AR bindingssted i opstrøms region af

miR-101

gen af ​​luciferase reporter assays. Luciferasereporteren konstruktioner blev genereret som vist i fig 3B. pGL3-B-MIR-101-S (uden den forudsagte AR bindingssted) viste omkring 5 gange mindre luciferaseaktivitet sammenlignet med pGL3-B-MIR-101-L (med fragmenter omfattende den forudsagte AR bindingssted) (fig 3C ). Desuden pGL3-B-MIR-101-MBS, hvor AR-bindingssted blev muteret viste ~ 5 gange mindre luciferaseaktivitet sammenlignet med pGL3-B-MIR-101-WBS der indeholdt vildtype bindingssted (fig 3C) , hvilket indikerer, at denne specifikke sekvens er ansvarlig for AR identifikation. Dernæst vi bruges chip assays for at bestemme om AR kunne binde til denne sekvens. DU145-celler blev transficeret med pEGFP-AR eller pEGFP-V. Kerneproteiner blev isoleret og immunpræcipiteret med enten AR-antistof eller kontrol muse IgG. Som forventet blev miR-101-fragment indeholdende bindingssted specifikt forstærket i celler transficeret med pEGFP-AR (Fig 3D øvre), hvilket viser, at AR kunne rekrutteres til dette websted. I LNCaP celler,

miR-101

fragment blev forstærket efter mock transfektion (Fig 3D nederst), der viser, at endogene AR kunne rekrutteres til ARE af

miR-101

. Endelig AR overekspression helt reddet pri-miR-101 og modne miR-101 udtryk efter celastrol behandling, viser AR medierende

miR-101

transskription reduktion på celastrol behandling (fig 3E).

A , miR-101 og AR udtryk efter celastrol (CEL) behandling. **,

P

0,01, sammenlignet med DMSO. B, Skematisk visning af luciferase reporter konstruerer så detaljeret i “Materialer og metoder”. Vild type og mutant AR bindende sites blev indikeret ved kursiv bindestreg og tværs, hhv. C, DU145-celler blev transficeret med angivne reporter-konstruktioner i nærvær af i pEGFP-C1-AR (EGFP-AR) eller pEGFP-C1 (EGFP-V) plasmid i 24 timer, og derefter blev påvist luciferaseaktivitet. pRLSV40 plasmid blev co-transficeret til normalisering. **,

P

0,01, mellem EGFP-AR og EGFP-V transfektioner. D, chip assay. Celleekstrakter fra DU145 eller LNCaP-celler transficeret med pEGFP-C1-AR (EGFP-AR) eller pEGFP-C1 (EGFP-V) blev immunfældet med AR antistof eller normalt muse-IgG. Input var 1/100 af sonikerede kromatin før immunfældning. PCR blev udført som beskrevet i “Materialer og metoder”. E, LNCaP-celler transficeret med pEGFP-C1-AR (EGFP-AR) eller tom vektor (EGFP-V) blev behandlet med celastrol (CEL, 2,0 uM) eller DMSO i 3 timer, PRI-MIR-101 og moden MIR-101 niveauer blev bestemt ved qPCR. En asterisk angiver signifikans mellem EGFP-AR og EGFP-V transfektioner. *,

P

0,05; **,

P

. 0,01

AR regulerer miR-101-ekspression i humane prostata kræftceller

AR status kan påvirke miR-101-ekspression i human prostatacancerceller. Real-Time PCR viste, at ekspressionsniveauerne af pri-miR-101 samt modent miR-101 var signifikant højere i AR-positive LNCaP- og 22Rv1 celler end i AR-negative DU145 og PC3-celler (Fig 4A). AR blev slået ned af siRNA i LNCaP (Fig 4B, venstre) eller 22Rv1 celler (Fig 4B, højre). AR knockdown resulterede i nedsat udtryk for modent miR-101, som var sammenlignelige med faldet i pri-miR-101 i både LNCaP- og 22Rv1 celler (Fig 4C). Tvungen AR udtryk forårsaget miR-101 niveauer steg i AR-negative DU145 og PC3-celler (Fig 4D). Tilsvarende eksogen AR steg også MIR-101 udtryk efter celastrol behandling (Fig 4D). I LNCaP celler, blev endogene AR genaktiveres af R1881 efter androgen deprivation. Med AR aktivering (fig 4E, øvre) blev ekspressionsniveauerne af MIR-101 opreguleret (Fig 4E). Disse resultater viser, at AR primært regulerer

miR-101

transskription, men ikke modning.

A, Udtryk for pri-miR-101 og modne miR-101 blev bestemt i AR positiv eller negativ celle linjer ved qPCR. **,

P

0,01 mellem to sammenlignede grupper. B, LNCaP eller 22Rv1 celler blev transficeret med AR siRNA eller kontrol siRNA (ctrl siRNA). AR Knockdown virkninger blev verificeret ved Western blotting. Udtryk for pri-miR-101 og modne miR-101 blev bestemt ved qPCR (C). *,

P

0,05

versus

kontrol siRNA. D, DU145 eller PC-3-celler blev transficeret med pEGFP-C1-AR (EGFP-AR) eller tom vektor (EGFP-V) og behandlet med DMSO eller celastrol (CEL, 2 uM) i 24 timer. Udtryk af moden miR-101 blev bestemt ved qPCR. *,

P

0,05 mellem EGFP-AR og EGFP-V transfektioner. E, blev LNCaP-celler behandlet med R1881 (1 nM) i 24 timer efter androgen sult, som beskrevet i fig 2C. AR proteinniveauer blev bestemt ved Western blotting under anvendelse af GAPDH som en loading kontrol. MIR-101 udtryk blev bestemt ved qPCR. **, P. 0,01

versus

DMSO

AR hæmmer celastrol-induceret autophagy via regulering af

MIR-101

i prostata kræftceller

Dernæst vi bestemt hvis AR negativt regulerer celastrol-induceret autophagy gennem hæmning af miR-101-ekspression i prostata kræftceller. MIR-101 mimic blev anvendt til at forøge MIR-101 niveauet i LNCaP-celler. Med MIR-101 opregulering ved tilsætning af MIR-101 mimic (Fig 5A, øvre), basalt niveau autofagi inhiberet (LC3-II /LC3-I-forholdet faldt til halvdelen) (Fig 5A, nederst). Selvom AR reduktion af celastrol var gunstig for autophagy induktion, tilsætning af MIR-101 mimic resulterede i autophagy hæmning som vist ved den halve gange formindskelse af LC3-II /LC3-I-forholdet og forøgelse af P62-niveau (fig 5A, nederst). I DU145 celler, kunne stabil ekspression af exogen AR opregulere miR-101 udtryk og kunne undertrykke autofagi udløst af celastrol. Når MIR-101 blev inhiberet ved tilsætning af MIR-101-inhibitor, som bestemt ved qPCR (figur 5B, øvre) blev autofagi reddet uanset AR overekspression (Fig 5B, nederst). Disse data tyder på, at den negative rolle AR spiller i reguleringen af ​​autofagi afhænger af dets efterfølgende mål. Desuden et par MIR-101 ekspressionskonstruktioner, pGL3-B-MIR-101-W, der indeholder vildtype ER, og pGL3-B-MIR-101-M, der har mutant ARE blev dannet. pGL3-B-MIR-101-W væsentligt forbedret MIR-101-ekspression end pGL3-B-MIR-101-M i co-transfektion med eksogent AR i DU145-celler med eller uden celastrol behandling (Fig 5C). I overensstemmelse med MIR-101 niveauer, co-transfektion med pGL3-B-MIR-101-W, der kan transaktiveres ved AR viste mere suppression på autophagy på det basale niveau eller celastrol induceret sammenlignet med pGL3-B-MIR-101- M, der ikke kunne genkendes af AR (fig 5C), hvilket indikerer, at AR hæmmer celastrol-induceret autophagy via transaktivering af miR-101.

for at se, om miR-101 kunne påvirke AR undertrykkelse på celastrol-induceret autofagi, AR positive LNCaP-celler blev transficeret med mIR-101 mimic eller negativ kontrol (NC) i 24 timer (A), efterfulgt af yderligere 24 h behandling med celastrol (2,0 uM, CEL). MIR-101-niveauer blev bestemt ved RT-PCR. #,

P

0,05

versus

NC transfektion uden celastrol treament. **,

P

0,01 mellem miR-101 og NC transfektioner med celastrol behandling. Protein- niveauerne af LC3 og P62 samt AR blev bestemt ved Western blotting under anvendelse af GAPDH som en loading kontrol. B, blev AR negative DU145-celler transficeret med pEGFP-C1-AR (EGFP-AR) eller tom vektor (EGFP-V) i nærvær af MIR-101-inhibitor (MIR-101 Inh) eller negativ kontrol (NC). Celler blev inkuberet i celastrol (2,0 pM, CEL) i yderligere 24 timer. MIR-101-niveauer blev bestemt ved RT-PCR. #,

P

0,05

versus

EGFP-V plus NC transfektioner. *,

P

0,05 mellem EGFP-V og EGFP-AR i tilstedeværelsen af ​​miR-101-hæmmer. Protein- niveauerne af AR, blev LC3and P62 detekteret ved Western blotting. C, DU145-celler blev transficeret med pGL3-B-MIR-101-W (med vildtype AR-bindingssted) eller pGL3-B-MIR-101-M (med mutant AR bindingssted), sammen med AR ekspressionsvektor (EGFP- AR) eller tom vektor (EGFP-V) i 24 timer, derefter behandlet med DMSO eller celastrol (CEL, 2,0 uM) for yderligere 24 timer. MIR-101-niveauer blev bestemt ved RT-PCR. #,

P

0,05

versus

EGFP-V plus pGL3-B-miR-101-M-transfektioner. *,

P

0,05 mellem pGL3-B-miR-101-M og pGL3-B-miR-101-W transfektioner. De protein niveauer af AR, LC3 og P62 blev detekteret ved Western blotting hjælp GAPDH som lastning kontrol.

AR modulerer miR-101 udtryk uden at påvirke celledød

Da AR reduktion også resulterer i reduceret cellelevedygtighed, hvorvidt den observerede miR-101 undertrykkelse og autophagy induktion skyldtes celledød blev bestemt. LNCaP-celler blev behandlet med AR-antagonist MDV3100 (Enzalutamide) i forskellige tidsrum. Som forventet blev AR protein faldt (figur 6A).