PLoS ONE: Nuclear Factor-KB-Dependent Epithelial til Mesenchymale Transition induceret af HIF-1α Aktivering i bugspytkirtelkræftceller under hypoxiske betingelser

Abstrakt

Baggrund

Epithelial til mesenchymale overgang (EMT) induceret af hypoxi er en af ​​de kritiske årsager til behandlingssvigt i forskellige typer af humane kræftformer. NF-KB er tæt involveret i udviklingen af ​​EMT. Sammenlignet med HIF-1α, har sammenhængen mellem NF-KB og EMT under hypoxi blevet mindre studeret, og selvom der blev observeret fænomenet i fortiden, de molekylære mekanismer, der er involveret forblev uklart.

Metode /vigtigste resultater

Her rapporterer vi, at hypoxi eller overekspression af hypoxi-inducerbare faktor-1α (HIF-1α) fremmer EMT i bugspytkirtelkræftceller. På molekylær eller farmakologisk hæmning af NF-KB, hypoxiske celler genvandt ekspressionen af ​​E-cadherin, mistede udtryk for N-cadherin, og svækket deres meget invasiv og multiresistent fænotype. Indførelse af en pcDNA3.0 /HIF-1α i bugspytkirtelkræftceller under normoksiske betingelser forhøjet NF-KB-aktivitet, phenocopying EMT virkninger af hypoxi. Omvendt inhiberer den øgede NF-KB-aktivitet i denne indstilling svækkede EMT fænotype.

Konklusioner /Signifikans

Disse resultater antyder, hypoxi eller overekspression af HIF-1α inducerer EMT, der er i høj grad afhængig på NF-KB i bugspytkirtelkræftceller

Henvisning:. Cheng ZX, Sun B, Wang SJ, Gao Y, Zhang YM, Zhou HX, et al. (2011) Nuclear Factor-KB-Dependent Epithelial til Mesenchymale Transition induceret af HIF-1α Aktivering i bugspytkirtelkræftceller under hypoxiske betingelser. PLoS ONE 6 (8): e23752. doi: 10,1371 /journal.pone.0023752

Redaktør: S. K. Batra, University of Nebraska Medical Center, USA

Modtaget: 20. april, 2011; Accepteret: 23, 2011; Udgivet: 22 August, 2011

Copyright: © 2011 Cheng et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra New Century Support Foundation for Elitist kinesiske undervisningsministerium (NCET-07-0248), den Videnskabelige Institut til Prominent Ungdom i Heilongjiang provinsen, Kina (JC200717), det videnskabelige og teknologiske projekt i Heilongjiang-provinsen, Kina (GC09C407-2), og National Natural Scientific Foundation of China (30.571.808, 30.872.987). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Bugspytkirtelkræft, som er en af ​​de mest aggressive og dødelige cancere verdensplan, er meget modstandsdygtige over for kemoterapi [1]. Selv systemisk terapi med gemcitabin, en aktuel first-line behandling for fremskreden kræft i bugspytkirtlen giver kun beskedne fordel på grund af iboende eller erhvervet kemoresistens [2], [3]. Endvidere nyere kliniske undersøgelser viser, at kun 12% af patienter med fremskreden bugspytkirtelkræft have en reaktionstid med gemcitabin-[4]. De fattige svarprocent tyder på, at kræft i bugspytkirtlen enten hurtigt udvikler eller har gemcitabin kemoresistens. De mekanismer, som kemoresistens opstår i bugspytkirtelkræft er ukendte; således en bedre forståelse af, hvordan modstand opstår, og hvad molekylære forandringer forårsage eller korrelerer med resistens er sandsynligvis føre til nye terapeutiske strategier for kræft i bugspytkirtlen.

Hypoxi er en miljømæssig stimulus, der spiller en central rolle i udviklingen og kræft progression . Tumoral hypoxi eller udtryk HIF-1 (hypoxi-inducerbare faktor-1) er blevet forbundet med en aggressiv fænotype, der korrelerer med en dårlig reaktion på kemoterapi og en dårligere samlet overlevelse af kræftpatienter [5], [6]. HIF-1 er et heterodimert protein bestående af HIF-1β, en konstitutivt udtrykt underenhed, og HIF-1α, et oxygen-sensitive inducerbar underenhed. Under normoxiske betingelser, er HIF-1α protein hydroxyleret af en familie af oxygen-afhængig prolyl hydroxylaser (PHD1-3); dette målretter det til polyubiquitination af et proteinkompleks indeholdende von Hippel-Lindau-proteinet (pVHL) og derefter nedbrydning. Under hypoxiske betingelser, prolyl hydroxylaser er inaktiveret, og HIF-1α nedbrydning er blokeret; dette giver mulighed for HIF-1α at akkumulere og associeret med HIF-1β at danne en funktionel transskription kompleks, der udløser transskription af et væld af hypoxi-inducerbare gener [7].

Epithelial til mesenkymale overgang (EMT) er den proces, hvorved adhærente epitelceller konvertere til bevægelige mesenchymal-celler og er afgørende i fosterudviklingen. EMT vides nu at også forekomme i en række forskellige sygdomme, herunder udvikling af kræft [8]. I den seneste undersøgelse, er beviser tyder på, at moderate hypoxiske betingelser kan udløse, som en selvstændig faktor, en EMT program, der fører forskellige humane kræftceller at øge invasionsevne [9]. Imens rapporterede nogle undersøgelser også, at aktivering af NF-KB er tæt involveret i udviklingen af ​​EMT [10] – [13]. Detaljerede undersøgelser af de mange facetter af EMT-programmet har afsløret sit engagement i mere end bare invasion og metastase; nylige undersøgelser viste, at fænotypen af ​​EMT er forbundet med kemoresistens i forskellige faste tumorer [14] – [17]

Nuclear faktor-kappa B (NF-KB) repræsenterer en familie af transkriptionsfaktorer, der modulerer ekspression af. gener med forskellige funktioner. Aktiviteten af ​​NF-KB er reguleret af NF-KB-inhiberende protein (IKB), som binder til og sekvestrerer NF-KB familiemedlemmer i cytoplasmaet. Når NF-KB-vejen er aktiveret, IKB phosphoryleres med IKB kinase (IKK), som phosphorylerer IKB. Phosphoryleret IKB underkastes ubiquitinering og proteasom-medieret nedbrydning, hvilket resulterer i translokationen af ​​NF-KB til kernen. NF-KB er en allestedsnærværende transskription faktor reguleret af mange stimuli, herunder hypoxi, cytokiner og kemoterapeutiske stoffer, og har for nylig vist sig som et mål for kræft. NF-KB konstitutivt aktiveret i de fleste humane pankreatiske cancerceller og primære tumorprøver, men ikke i normale pancreas væv eller ikke-tumorigene cellelinjer [18] – [20]. Nogle nylige undersøgelser viste, at hypoxia kan aktivere NF-KB og inducere resistens af bugspytkirtelkræftceller med gemcitabin-[21] – [23]. Vi har tidligere rapporteret, at anvendelse af dihydroartemisinin eller lille interfererende RNA (siRNA) inaktiverer NF-KB og potentierer antitumorvirkningen af ​​gemcitabin på bugspytkirtelkræft både in vitro og in vivo [24], [25].

I denne undersøgelse, søgte vi beviser, at bugspytkirtelkræftceller (PANC-1, BxPC3) under hypoxiske betingelser gennemgår processen med EMT og erhverve invasive og resistente fænotyper i en NF-KB-afhængig måde. Heri viste vi, at hypoxi eller overekspression af HIF-1α aktiveret NF-KB og fremmes EMT i bugspytkirtelkræftceller. På molekylær eller farmakologisk hæmning af NF-KB, hypoxiske celler genvandt ekspressionen af ​​E-cadherin, mistede udtryk for N-cadherin, og svækket deres meget invasiv og multiresistent fænotype. Indførelse af en pcDNA3.0 /HIF-1α i bugspytkirtelkræftceller under normoksiske betingelser forhøjet NF-KB-aktivitet, phenocopying EMT virkninger af hypoxi. Omvendt hæmme den øgede NF-KB-aktivitet i denne indstilling vendt EMT fænotype. Tilsammen disse resultater tyder på, at hypoxi eller overekspression af HIF-1α inducere EMT, der er i høj grad afhængig af NF-KB i bugspytkirtelkræftceller.

Resultater

Hypoxi resulterer i morfologiske og celle biologiske forandringer karakteristiske for EMT i bugspytkirtelkræftceller

for at rekapitulere virkningerne af hypoxi som det forekommer i bugspytkirtelkræft, vi udsættes 55-60% subkonfluente bugspytkirtelkræftceller (Panc-1, BxPC-3) til hypoxiske betingelser (1% O

2, 5% CO

2, og 94% N

2) op til 48 h. Vi observerede markante forskelle i morfologi og tendens til at danne cellulære reder eller klynger mellem de bugspytkirtelkræftceller under hypoxiske betingelser og deres normoksiske modstykker (95% luft og 5% CO

2). De normoksiske celler udviste en polygonal form og brosten-lignende ark, der indikerer en epitelial fænotype. I modsætning hertil hypoxiske celler begyndte at miste celle-kontakter, spredt fra celleklynger og erhvervede et langstrakt, fusiform morfologi med dendritiske processer i overensstemmelse med en mesenkymale overgang (fig. 1B).

(A) Western blot-analyse af epitelial markør (E-cadherin) og mesenchymale markører (vimentin, N-cadherin) og HIF-1α af PANC-1, BxPC-3-celler under normoxiske (N) eller hypoxiske (H) forhold i 48 timer. En repræsentativ blot fra tre uafhængige forsøg blev vist. Histogrammet viste den gennemsnitlige mængde tæthed korrigeret for ladningskontrol (β-actin). *,

s

0,05. (B) Fase kontrast analyse (original forstørrelse, × 100) af morfologiske ændringer påvist i bugspytkirtelkræftceller under normoxisk eller hypoxiske betingelser i 48 timer. (C) Immuofluorescence farvning af E-cadherin og vimentin i PANC-1, BxPC-3-celler under normoxiske eller hypoxiske betingelser i 48 timer. Grøn repræsenterer E-cadherin farvning, mens rød repræsenterer Vimentin farvning. Blå signal repræsenterer kerne-DNA-farvning af DAPI. (D) Cellernes levedygtighed blev vurderet af Cell Counting Kit-8 assay og anvendes til at beregne viabilitetsindekset. Panc-1 og BxPC-3-celler blev udsat for gemcitabin (0 pmol /l) i 48 timer som grundlinjen. *,

s

0,05. (E) Spredningen af ​​celler blev målt ved krystalviolet assay. Tal blev udvalgt som repræsentative scener fra tre uafhængige forsøg. (F) Matrigel invasion assay. Venstre, mikrofotografier af celler, der har passeret gennem Matrigel under normoxiske eller hypoxiske betingelser i 48 timer (oprindelig forstørrelse, × 100). Right, kvantificering af invasion. *,

s

. 0,05

For at bekræfte, om bugspytkirtelkræftceller undergik EMT udsat for hypoxi, vi bestemt også udtryk for markører for epitel og mesenkymale fænotyper ved Western blot-analyse . Som vist i fig. 1A, hypoxiske celler undergik en “cadherin switch”, hvorved de manifesterede reduceret E-cadherin udtryk og øget N-cadherin udtryk. Derudover er ekspressionen af ​​HIF-1α, en vigtig markør for hypoxi pathway, blev fundet intenst udtrykkes under hypoxisk tilstand i 48 timer (fig. 1a). Immunofluorescens farvning blev ansat til yderligere at bekræfte EMT fænotype ændringer i bugspytkirtelkræftceller under hypoxiske tilstand. Det blev vist, at ekspressionen af ​​E-cadherin reduceres og ekspressionen af ​​vimentin øget sammenlignet med dem i normoksiske celler (Fig. 1C).

Cancerceller, der har undergået EMT tendens til at udvise større resistens lægemiddel og invasionsevne . Som sådan, vi undersøgte disse egenskaber i normoksiske celler versus hypoxiske celler i Cell Counting Kit-8 assay, Crystal violet assay og Matrigel invasion assay. Slående forskelle blev observeret. Celletælling Kit-8 assay blev anvendt til at vurdere cellernes levedygtighed sats. Panc-1 og BxPC-3-celler blev udsat for gradient doser af gemcitabin (0-200 pmol /l) i 48 timer. Data er vist i fig. 1D, når de behandles med koncentrationen af ​​gemcitabin større end 100 nmol /l, viste hypoxiske celler signifikant højere cellelevedygtighed end de normoksiske celler. Disse resultater blev yderligere bekræftet af Crystal violet assay (Fig. 1E), når celler blev behandlet med gemcitabin (10 pmol /L for PANC-1 og 500 nmol /L for BxPC-3) under hypoxiske eller normoxiske betingelser i 48 timer, hypoxiske celler viste signifikant højere cellelevedygtighed end normoksiske celler. Matrigel invasion assay blev anvendt til at vurdere celle invasionsevne. Både PANC-1 og BxPC-3-celler under hypoxiske betingelser i 48 timer let migrerede gennem Matrigel kammeret i relativt høje tal, hvorimod deres normoksiske partnere udviste en markant reduktion i invasion (fig. 1F).

Taget sammen , vores data, der indikerer ændringer i morfologi, vækstmønster, proteinekspression, lægemiddelresistens og invasion støtter idéen om, at hypoxi fører til EMT i bugspytkirtelkræftceller.

bugspytkirtelkræftceller under hypoxiske betingelser udviser øget NF-KB-aktivitet

Nogle undersøgelser har tidligere vist, at hypoksi resulterer i aktivering af NF-KB [19], [20]. Således har vi forsøgt at afgøre, om den observerede i bugspytkirtelkræftceller under hypoxiske betingelser EMT henføres til øget NF-KB-aktivitet. Først, vi dokumenteret, at NF-KB p65 proteiner og NF-KB-DNA-bindingsaktivitet faktisk blev forøget i hypoksiske bugspytkirtelkræftceller sammenlignet med de normoksiske modstykker som bestemt ved Western blot-analyse og EMSA. I mellemtiden var HIF-1α også analyseret ved Western blot-analyse (fig. 2A). Panc-1 og BxPC-3 celler blev inkuberet under hypoxiske betingelser for forskellige perioder (24 t, 48 t, 72 h). Efter hver angivet inkubationsperioden blev cellerne opsamlet, og total eller kerneproteiner ekstraheret. Som vist i fig. 2A og B, NF-KB p65-proteiner og NF-KB-DNA-bindingsaktivitet blev forøget 24 h efter initiering af hypoxi og opretholde høje niveauer. Specificiteten af ​​gel-skiftet bånd i EMSA blev dokumenteret ved kolde konkurrenceeksperimenter, hvori overskydende koldt vildtype men ikke koldt mutant KB-probe ophævede signalerne fra de forskudte bånd.

PANC-1 og BxPC- 3-celler blev dyrket under normoxiske (N) eller hypoksiske betingelser (H) for forskellige perioder (24, 48 h, 72 h). Efter hver angivet inkubationsperioden blev cellerne opsamlet. Kerneekstrakter og totale proteinekstrakter blev fremstillet. (A) NF-KB p65 og HIF-1α blev analyseret ved Western blot-analyse fra respektive celle homogenat. Histogrammet viste den gennemsnitlige mængde tæthed korrigeret for ladningskontrol (β-actin). *,

s

0,05. (B) EMSA for NF-KB-DNA-bindingsaktivitet på respektive kerneekstrakter. Kompetitivt assay bekræftede specificiteten af ​​NF-KB-binding til DNA (se Materialer og fremgangsmåder for detaljer). Højre to baner, WT vildtype; m, mutant. (C) VEGF blev analyseret ved Western blot-analyse fra respektive celle homogenat. Histogrammet viste den gennemsnitlige mængde tæthed korrigeret for ladningskontrol (β-actin). *,

s

0,05. (D) Western blot analyse. Virkninger af NF-KB p65 siRNA om VEGF-ekspression af PANC-1 og BxPC-3-celler under hypoxiske betingelser i 48 timer. Histogrammet viste den gennemsnitlige mængde tæthed korrigeret for ladningskontrol (β-actin). *,

s

. 0,05

I mellemtiden var HIF-1α også analyseret ved Western blot analyse. Som vist ved Western blotting (Fig. 2A), HIF-1α proteinniveauer i bugspytkirtelkræftceller opreguleret under hypoxi. Stigningen i HIF-1α proteinniveau skyldtes muligvis proteinstabilitet virkninger undersøgt tidligere [7]. Eftersom ekspressionen af ​​HIF-1α målgen VEGF, en vækstfaktor, som kan fremme EMT, medieres af NF-KB, vi også afgøre, om hypoxi stimulerer VEGF-ekspression. Som vist i fig. 2C viste Western blotting, at VEGF proteinekspression steg betydeligt efter 24 timer af hypoxi og opretholdes høje niveauer. Derimod blev det opregulering af VEGF undertrykkes ved silencing NF-KB p65 ekspression i hypoksiske bugspytkirtelkræftceller hjælp af NF-KB p65-specifikke siRNA, mens ingen virkning blev set i celler transficeret med kontrol siRNA (fig. 2D) .

Hæmning af NF-KB-aktivitet i bugspytkirtelkræftceller under hypoxiske betingelser medierer EMT

efter at have fastslået, at hypoksi medfører forhøjet NF-KB-aktivitet i bugspytkirtelkræftceller, vi næste undersøgt potentialet for inhibering af NF-KB at afbøde mesenkymale karakteristika hypoxiske celler. Til den ende, vi brugte både molekylære og farmakologiske midler til at hæmme NF-KB i disse hypoxiske celler og derefter sammenlignet den resulterende fænotype med kontrol-behandlede celler. Molekylær inhibering blev opnået ved siRNA at nedregulere p65 subunit af NF-KB. Vi brugte også en kommercielt tilgængelig IKK-inhibitor BAY 11-7082 til farmakologisk blok NF-KB-aktivitet. Inhibering af NF-KB-aktivitet ved enten NF-KB p65 siRNA eller BAY 11-7082 under hypoxiske betingelser i 48 timer resulterede i en ændring i proteinekspression karakteriseret ved øget E-cadherin og reducerede N-cadherin ekspression som bestemt ved Western blot-analyse (fig. 3A), i overensstemmelse med tilbagevenden til en epitelial fænotype. Vigtigere, hæmning af NF-KB ved enten NF-KB-p65 siRNA eller BAY 11-7082 ført til en markant nedgang i invasiv af hypoxiske celler sammenlignet med kontrol behandlede celler i Matrigel invasion assay under hypoxiske betingelser i 48 h (fig. 3B) . Når celler blev behandlet med gemcitabin (10 pmol /L for PANC-1 og 500 nmol /L for BxPC-3) i 48 timer med inhibering af NF-KB-aktivitet ved enten NF-KB p65 siRNA eller IKK-inhibitor under hypoxiske betingelser, de viste også signifikant lavere levedygtighed end deres respektive kontroller i Crystal violet assay (fig. 3C) og Cell Counting Kit-8-assay (fig. 3D). På trods af disse ændringer i proteinekspression, invasionsevne og resistens kan henføres til NF-KB-blokade, vi ikke observere nogen dybtgående ændringer i morfologi eller vækstmønstre af kræft i bugspytkirtlen celler under hypoxiske betingelser, en observation, der implicerer NF-KB-uafhængige biokemiske begivenheder der også bidrager til EMT fænotype i hypoksiske bugspytkirtelkræftceller.

(A) Western blot analyse. Virkninger af NF-KB p65 siRNA og IKK-inhibitor BAY 11-7082 på N-cadherin og E-cadherin ekspression af PANC-1 og BxPC-3-celler under hypoxiske betingelser i 48 timer. Histogrammet viste den gennemsnitlige mængde tæthed korrigeret for ladningskontrol (β-actin). *,

s

0,05. (B) Matrigel invasion assays. Venstre, mikrofotografier efter celler blev behandlet med NF-KB p65 siRNA eller BAY 11-7082 (10 pmol /L) eller passende respektive kontroller. Original forstørrelse, × 100. Ret, kvantificering af invasion assay. *,

s

0,05. (C) Spredningen af ​​celler blev målt ved Crystal violet assay. Tal blev udvalgt som repræsentative scener fra tre uafhængige forsøg. (D) Cellernes levedygtighed blev vurderet af Cell Counting Kit-8 assay og anvendes til at beregne viabilitetsindekset. *,

s

. 0,05

bugspytkirtelkræftceller under hypoxiske betingelser udviser NF-KB-afhængig opregulering af Twist, transkriptionelle regulatorer af EMT-programmet

den genekspression program, der medierer EMT er reguleret af en eller flere transskriptionsfaktorer, herunder Twist, Zeb1, Zeb2, og snail [26]. Disse transskriptionsfaktorer påvirke ekspressionen af ​​cadheriner og metalloproteinaser, blandt andre proteiner, der er involveret i EMT. At disse transkriptionsfaktorer er transkriptionelt fremkaldt af opstrøms signalveje, herunder NF-KB [26], fik os til at observere deres differentielle ekspression i bugspytkirtelkræftceller under hypoxiske betingelser versus normoksiske betingelser ved Western blot-analyse. Hypoksiske bugspytkirtelkræftceller udstillet væsentlig opregulering af Twist, Snail, Zeb1, og Zeb2 i forhold til normoksiske celler (Fig. 4A). Farmakologisk hæmning af IKK af BAY 11-7082 i hypoxiske celler resulterede i en dosisafhængig reduktion i Twist udtryk, men ingen markante ændringer i Zeb1, Zeb2 eller Snail udtryk, en konstatering af, at indicts den øget tilstand af NF-KB som en ætiologisk biokemisk kraft underliggende Twist overekspression i bugspytkirtelkræftceller under hypoxiske betingelser (fig. 4B). Disse resultater indikerer, at den forøgede ekspression af Twist, der forekommer i fastsættelsen af ​​bugspytkirtelkræftceller under hypoxiske betingelser medieres af forhøjet NF-KB-aktivitet.

(A) Western blot-analyse af baseline ekspression af EMT-medierende transkription faktorer: Twist, sneglen, Zeb1, og Zeb2 i bugspytkirtelkræftceller under normoxisk (N) versus hypoxiske (H) betingelser for 48 h. Histogrammet viste den gennemsnitlige mængde tæthed korrigeret for ladningskontrol (β-actin). *,

s

0,05. (B) Western blot analyse. Dosisafhængige virkninger af en 48-h eksponering af IKK-inhibitoren BAY 11-7082 om ekspression af Twist, snail, Zeb1, og Zeb2 under hypoxiske betingelser. En repræsentativ blot fra tre uafhængige forsøg blev vist. Histogrammet viste den gennemsnitlige mængde tæthed korrigeret for lastning kontrol (β-actin).

Overekspression af HIF-1α i bugspytkirtelkræftceller under normoksiske betingelser inducerer EMT i NF-KB-afhængig måde

De seneste rapporter har etableret en ætiologisk sammenhæng mellem HIF-1α udtryk for undertrykkelse af E-cadherin og erhvervelse af et mesenkymale fænotype [27]. Vi hypotese således at EMT at bugspytkirtelkræftceller undergår som reaktion på HIF-1α ekspression forekommer, i det mindste delvist, skyldes den HIF-1α-medieret aktivering af NF-KB-vejen. Først, vi forbigående indført en pcDNA3.0 /HIF-1α i PANC-1 under normoxiske betingelser (HIF-1a

+ /N) med en LipofectamineTM 2000. betragtninger HIF-1α var næsten ikke målbart i PANC-1 under normoksiske betingelser transduceret med kontrol tom vektor (pcDNA3.0 /N), HIF-1α niveauer i HIF-1α

+ /N-celler var sammenlignelige med dem, i cellerne under hypoxiske betingelser i 48 timer (fig. 5A). Dernæst vi bekræftet, at NF-KB-aktivitet faktisk stigning i disse HIF-1α

+ /N celler end pcDNA3.0 /N-celler. Faktisk HIF-1α

+ /N-celler udviste forhøjet NF-KB-aktivitet som bestemt ved Western blot-analyse og EMSA (fig. 5A og B).

(A) Western blot-analyse af NF-KB p65 og HIF-1α ekspression af PANC-1-celler under hypoxiske betingelser i 48 timer (H /48 h), PANC-1-celler transduceret med pcDNA3.0 tom vektor (pcDNA3.0 /N) og pcDNA3.0 /HIF-1α (HIF-1α

+ /N) under normoxiske betingelser i 48 timer. Histogrammet viste den gennemsnitlige mængde tæthed korrigeret for ladningskontrol (β-actin). *,

s

0,05. (B) EMSAs for NF-KB-DNA-bindingsaktivitet i H /48 H, HIF-1α

+ /N, og pcDNA3.0 /N PANC-1-celler. Right to baner, kold konkurrence EMSA.

Efter at have konstateret, at HIF-1α

+ /N celler åbenbart øget NF-KB-aktivitet, vi næste vurderede disse celler for tegn på EMT. Sammenlignet med pcDNA3.0 /N-celler, HIF-1α

+ /N-celler udviste en stigning i N-cadherin ekspression og undertrykkelse af E-cadherin under normoxiske betingelser i 48 timer som bestemt ved Western blot analyse (fig. 6A) . Immunofluorescens-farvning blev anvendt til yderligere at bekræfte en EMT induceret af HIF-1α under normoxiske betingelser, ekspressionen af ​​E-cadherin reduceres og vimentin forøget i HIF-1α

+ /N-celler sammenlignet med pcDNA3.0 /N-celler under normoxiske betingelser i 48 timer (fig. 6b). Denne cadherin kontakt var også forbundet med øget Twist, sneglen, Zeb1, og Zeb2 udtryk (fig. 6A), resultater, der minder om dem, der observeres i bugspytkirtelkræftceller under hypoxiske betingelser (Fig. 4A). Rollen af ​​NF-KB ved modulering disse proteinekspressionssystemer ændringer blev illustreret ved virkningen af ​​inhibering af NF-KB i HIF-1α

+ /N-celler ved udsættelse for IKK-inhibitoren BAY 11-7082 (0-10 pmol /L), som tilbageføres cadherin switching fænomen samt reduceret ekspression af Twist i en dosisafhængig, men ingen markante ændringer i Zeb1, Zeb2 eller snail ekspression (fig. 6C). Invasion og gemcitabin modstand HIF-1α

+ /N-celler og dets afhængighed af forhøjet NF-KB-aktivitet blev evalueret i Matrigel invasion assay Crystal violet assay og Cell Counting Kit-8 assay. F.eks invasivitet af HIF-1α

+ /N-celler gennem en Matrigel kammer var signifikant større end den af ​​pcDNA3.0 /N-celler under normoxiske betingelser i 48 timer (fig. 6D). Tilsvarende, når celler blev behandlet med gemcitabin (10 pmol /l) i 48 timer under normoxiske betingelser blev signifikant højere cellernes levedygtighed, påviste i HIF-1α

+ /N-celler sammenlignet med pcDNA3.0 /N-celler som bestemt ved Crystal violet assay (fig. 6E) og Cell Counting Kit-8-assay (fig. 6F). Den forbedrede invasion og gemcitabin modstand HIF-1α

+ /N-celler blev ophævet af NF-KB blokade ved hjælp af eksponering for IKK-inhibitoren BAY 11-7082 (10 pmol /l) under normoxiske betingelser for 48 timer (Fig . 6D, E og F). Således augmentation i invasivitet og gemcitabin resistens i PANC-1, som er kendetegnet ved hypoxi forekommer som et resultat af aktivering af NF-KB-vejen induceres af HIF-1α.

(A) Western blot-analyse af niveauer af angivne proteiner i PANC-1-celler transduceret med pcDNA3.0 tom vektor (pcDNA3.0 /N) og pcDNA3.0 /HIF-1α (HIF-1α

+ /N) under normoxiske betingelser i 48 timer. Histogrammet viste den gennemsnitlige mængde tæthed korrigeret for ladningskontrol (β-actin). *,

s

0,05. (B) EMT fænotype ændringer blev bekræftet med Immuofluorescence mikroskopi farvning af E-cadherin og vimentin. Grøn repræsenterer E-cadherin farvning, mens rød repræsenterer Vimentin farvning. Blå signal repræsenterer kerne-DNA-farvning af DAPI. (C) Western blot analyse. Dosisafhængige virkninger af en 48-timers udsættelse for IKK-inhibitoren BAY 11-7082 på de angivne proteiner. Histogrammet viste den gennemsnitlige mængde tæthed korrigeret for ladningskontrol (β-actin). (D) Matrigel invasion assays. Virkninger af en 48-h BAY 11-7082 (10 pmol /l) på invasion af PANC-1-celler under normoxiske betingelser. Venstre, mikrofotografier ved oprindelig forstørrelse på × 100; Ret, histogram at illustrere invasion analyseresultater. *,

s

0,05. (E) Crystal violet assay. Virkninger af en 48-h BAY 11-7082 (10 pmol /l) om gemcitabin modtagelighed PANC-1-celler under normoxiske betingelser. Tal blev udvalgt som repræsentative scener fra tre uafhængige forsøg. (F) Virkningerne af IKK-hæmmer på gemcitabin modtagelighed PANC-1 celler under normoksiske forhold blev også målt ved Cell Counting Kit-8 assay og anvendes til at beregne rentabiliteten indekset. *,

s

. 0,05

Diskussion

I de senere år er det blevet mere og mere klart, at EMT spiller en vigtig rolle i udviklingen af ​​kræft og er også ansvarlig for den resistente fænotype af cancerceller til konventionelle kemoterapeutika [8]. Forskellige faktorer, herunder hypoxi, er blevet tiltalt som fremkalde dette fænomen gennem induktion af Twist, Snail, Zeb1, og Zeb2 afhængig af de cellulære sammenhænge [11], [26] – [28]. En hypoxisk mikromiljø er almindeligt forekommende i den centrale region af faste tumorer. Forbindelsen mellem hypoxi og EMT er tidligere blevet rapporteret, og HIF-1α er blevet tiltalt som mediere dette fænomen. Imidlertid har de molekylære fundament for HIF-1α-induceret opregulering af disse EMT-inducerende transkriptionsfaktorer været stort set udefineret, skønt beviser til støtte for evnen hos HIF-1α til direkte at inducere Twist transkription er for nylig blevet beskrevet i humane embryoniske nyreceller [27].

tidligere undersøgelse viste, at hypoxia fører til NF-KB-aktivering og en sådan aktivering blev medieret af phosphorylering af kBa på tyrosinrester [28]. NF-KB-aktivering er en kritisk komponent i den transskriptionelle respons på hypoxi. Vores data præsenteret heri angivet, at NF-KB-aktivering øges under hypoxiske betingelser samt forbigående transficeret med en pcDNA3.0 /HIF-1α i bugspytkirtelkræftceller under normoxiske betingelser. I mellemtiden er den øgede NF-KB-aktivitet under hypoxi inhiberet af IKK-inhibitor BAY-11-7082, der kan inhibere phosphorylering og nedbrydning af kBa, og forhindrer translokation af p65 /p50. Begge vores data og tidligere undersøgelser viste, at biokemiske veje, der fører til NF-KB-aktivering konvergeret på IKK-komplekset under hypoxiske betingelser. For nylig blev det rapporteret, at NF-KB transkriptionelt inducerer HIF-1α ekspression i murine makrofager, lever og hjerne [29]. Vi fandt også, at farmakologisk inhibering af NF-KB, IKK-inhibitor BAY-11-7082, resulterede i reduceret HIF-1α ekspression i både PANC-1 og BxPC-3-celler under hypoxiske betingelser (data ikke vist). Disse resultater tyder på, at der findes en biokemisk løkke, hvorved HIF-1α aktiverer NF-KB og vice versa. Afbrydelse denne løkke i bugspytkirtelkræftceller på et eller flere af de mange biokemiske trin, der linker HIF-1α til NF-KB er tilbøjelige til at have en betydelig effekt på bugspytkirtlen vækst kræft. Forholdet mellem HIF-1α og NF-KB i processen med tumorudvikling er særlig kompleks og kræver yderligere udforskning. Vi har desuden vist, at EMT program tilskrives hypoxi eller overekspression af HIF-1α largly drives ved aktivering af den klassiske NF-KB-vejen. Dette EMT program er kendetegnet ved vimentin og N-cadherin ekspression og E-cadherin suppression, slående morfologiske forandringer, en særdeles invasiv og gemcitabin-resistente mesenkymale fænotype.

nylig undersøgelse viste, at ekspressionen af ​​HIF-1α mål gen VEGF, en vækstfaktor, som kan fremme EMT i prostatacancer [30]. I denne undersøgelse, viste data også, at protein udtryk for VEGF steget betydeligt i bugspytkirtelkræftceller under hypoxiske betingelser og opregulering af VEGF, fremkaldt af hypoxi, blev ophævet af NF-KB-p65 siRNA. Vi fandt også, at disse celler inkuberes under hypoxiske betingelser eller transficeres med pcDNA3.0 /HIF-1α under normoxiske betingelser udviser forhøjet NF-KB-aktivitet, inhibering af hvilket resulterer i reversion af cadherin kontakten med den for en epitelial fænotype karakteriseret ved reduceret invasion og øget gemcitabin følsomhed, resultater, der implicerer NF-KB som en principal mediator af HIF-1α-induceret EMT program i bugspytkirtelkræftceller under hypoxiske betingelser.

Andre undersøgelser har tidligere identificeret Zeb1, Zeb2, og Snail som centrale regulatorer af E-cadherin undertrykkelse og EMT i bugspytkirtelkræftceller [11], [31]. Imidlertid blev ekspressionen af ​​Twist ikke registreret under normoxiske betingelser og Twist genet blev aktiveret efter udsættelse for hypoxi i fem bugspytkirtelkræft cellelinjer [32]. I denne undersøgelse viste vi, at EMT induceret af hypoxi eller overekspression af HIF-1α var forbundet med øget Twist, snail, Zeb1 eller Zeb2 ekspression. Vi fandt også, at farmakologisk inhibering af IKK af BAY 11-7082 i hypoxiske celler resulterede i en dosis-afhængigt fald i Twist ekspression men ingen markante ændringer i Zeb1, Zeb2 eller snail ekspression, hvilket antyder, at de specifikke transkriptionsfaktorer der regulerer EMT afhænger af cellulær kontekst og den specifikke tilstand af celler. Denne mesenchymale transformation kan i vid udstrækning blive dæmpet ved at inhibere NF-KB gennem enten molekylære eller farmakologiske tilgange, selvom NF-KB blokade ikke fremmer en fuldstændig tilbagevenden til en epitelial fænotype, som vist ved opretholdelsen af ​​sneglen, Zeb1 eller Zeb2 ekspression i lyset af NF-KB p65 siRNA eller IKK inhibering. Sidstnævnte fund tyder på eksistensen af ​​NF-KB-uafhængig EMT regulatoriske veje i bugspytkirtelkræftceller under hypoxiske betingelser, der mangler at blive defineret.