PLoS ONE: Aktivering af NF-kappa B Signaling Fremmer vækst af prostatakræft celler i Bone

Abstrakt

Patienter med fremskreden prostatacancer næsten uvægerligt udvikle ossøse metastaser. Selv om mange undersøgelser viser, at aktivering af NF-KB-signalering ser ud til at være korreleret med fremskreden cancer og fremmer tumormetastase ved at påvirke tumorcellemigration og angiogenese, indflydelsen af ​​ændret NF-KB-signalering i prostatacancerceller inden Boney metastatiske læsioner er ikke klart forstået. Mens C4-2B og PC3-prostatacancerceller vokse godt i knoglen, LNCaP-celler er vanskelige at dyrke i murine knogle efter intraskeletal injektion. Vores undersøgelser viser, at sammenlignet med LNCaP, NF-KB-aktivitet er betydeligt højere i C4-2B og PC3, og at aktiveringen af ​​NF-KB-signalering i prostatacancerceller resulterede i forøget ekspression af osteoklast inducerende gener PTHrP og RANKL. Endvidere konditioneret medium afledt af NF-KB aktiverede LNCaP-celler inducerer osteoklastdifferentiering. Desuden inaktivering af NF-KB signalering i prostatacancerceller inhiberede tumordannelse i knoglen, både i osteolytisk PC3 og osteoblastiske /osteoklastisk blandede C4-2B celler; mens aktiveringen af ​​NF-KB-signalering i LNCaP-celler fremmes tumoretablering og proliferation i knoglen. Aktiveringen af ​​NF-KB i LNCaP-celler resulterede i dannelsen af ​​et osteoblastiske /osteoklastisk blandet tumor med forøgede osteoklaster omgiver nydannede knogle, svarende til metastaser almindeligvis ses hos patienter med prostatacancer. Disse resultater indikerer, osteoklastisk reaktion er påkrævet, selv i de osteoblastiske cancerceller og aktiveringen af ​​NF-KB signalering i prostatacancerceller øger osteoklastogenese ved opregulering osteoclastogenic gener, hvilket bidrager til knogle metastatisk dannelse

Henvisning.: Jin R, Sterling JA, Edwards JR, DeGraff DJ, Lee C, Park SI, et al. (2013) Aktivering af NF-kappa B Signaling Fremmer Vækst af prostata cancer celler i Bone. PLoS ONE 8 (4): e60983. doi: 10,1371 /journal.pone.0060983

Redaktør: Qiming Jane Wang, University of Pittsburgh School of Medicine, USA

Modtaget: August 16, 2012; Accepteret: 5 mar 2013; Udgivet: April 5, 2013 |

Copyright: © 2013 Jin et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet til RJ af Department of Defense (DOD) Prostata Cancer Research Program (PCRP) (W81XWH-10-1-0236); til JAS af tmen (5U54 CA 126.505), Vanderbilt University Bone center PPG (5P01 CA40035) og Department of Veterans Affairs Karriereudvikling Award; til RJM af National Cancer Institute (4R01 CA076142-14) og Frances Preston Laboratories i T.J. Martell Foundation. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Næsten alle patienter med fremskreden prostatacancer (PSA) udvikle osseus metastaser. Udviklingen af ​​tumorvækst i knoglen er den mest kritiske komplikation af avancerede PCa, hvilket ofte resulterer i signifikant morbiditet og mortalitet [1]. I modsætning til andre former for kræft, er en indledende metastatisk indbetaling på PCA celler næsten strengt begrænset til knogle og er ofte det eneste sted af distal spredning selv i sene stadier af sygdommen [2]. Når prostata tumorceller ind i skelettet, en destruktiv cyklus af grov knogleskader og tumorvækst sker, på hvilket tidspunkt helbredende terapi ikke længere er mulig og palliativ behandling bliver den eneste mulighed. Den gennemsnitlige tid mellem diagnose af en klinisk evident skelet metastase og død er ca 3-5 år [3]. Derfor forstå den mekanisme, hvorved PSA celler trives i knoglen miljøet og udvikle effektive metode (r) til forebyggelse eller behandling PCa knoglemetastaser er kritisk for at forøge overlevelsesraten for avancerede PCA patienter.

I modsætning til andre faststof tumorer, der er forbundet med osteolytiske knoglemetastaser, er PCa knoglemetastaser forbundet med osteoblastisk metastase. Men den vellykkede kolonisering af knoglen ved PCA-celler kræver både osteolytiske og osteoblastiske processer,. Dette sker dels på grund PCA-celler kan producere vækstfaktorer, der kan påvirke både osteoblaster og osteoklaster, hvilket resulterer i osteoblastisk knogledannelse og overdreven knogleresorption [1], [4]. Mens rolle osteoblaster i PCa knoglemetastaser er velkendt, flere fund tyder stærkt en vigtig rolle for osteoklastfunktion i den vellykkede dannelse af PCA knoglemetastaser [5] – [10]. For eksempel, når PCA-celler indledningsvis koloniserer en knogle, er de dog at først medføre osteoklastogenese [11], og efterfølgende knogleresorption. Histomorfometrisk evidens for, at osteoblastiske metastaser dannes i trabekulær knogle på steder med foregående osteoklast-resorption og sådan resorption er påkrævet for efterfølgende osteoblastisk knogledannelse [12]. Disse resultater tyder på, at PCa inducerer knogle aflejring gennem en samlet stigning i knogle remodellering. Derudover osteoklastisk knogleresorption bidrager til størstedelen af ​​skelettet følgetilstande eller skelet-hændelser (SREs, såsom brud og smerter), hos patienter med knoglemetastaser. Endvidere osteoklastisk knogleresorption også bidrager til etableringen af ​​tumorer i skelettet. Derfor er osteoklastogenese induceret af PCA-celler foreslået at være en tidlig begivenhed af knoglemetastaser og er en nødvendig forudsætning for initial PCa knogle kolonisering. Selvom begrebet osteoklast aktivering som en underliggende del af PCa væksten i knogler er allerede velkendt, de mekanistiske detaljer, som PCA cellerne øger osteoklast aktivering og efterfølgende fremkalde metastaser til benet miljø er stadig uklart.

Det er nu udbredt opfattelse, at den molekylære triade – receptor Activator of NF-KB-ligand (RANKL), dets receptor RANK, og den endogene opløselige RANKL inhibitor, osteoprotegerin (OPG) – spille essentielle og direkte roller i dannelsen, funktion og overlevelse osteoklaster. Mange undersøgelser har vist, at RANKL /RANK /OPG er de vigtigste regulatorer af knoglemetabolisme både normale og patologiske tilstande, herunder PCA knoglemetastaser [13], [14]. Et andet vigtigt gen, Parathyreoideahormon-relateret protein (PTHrP), er kendt for at være involveret i osteoklastdifferentiering. PTHrP er produceret af næsten alle tumorer, der metastaserer til knoglerne, og talrige undersøgelser har vist en sammenhæng mellem PTHrP udtryk og skelet lokalisering af tumorer. PTHrP har fremtrædende virkninger i knoglen via sin interaktion med PTH-1-receptor på osteoblastiske celler. Gennem indirekte midler, PTHrP understøtter osteoklastogenese ved opregulering RANKL i osteoblaster [15]. PCA-celler er blevet vist at udtrykke flere faktorer, der regulerer osteoklastogenese, herunder PTHrP, makrofag-kolonistimulerende faktor (M-CSF), medlemmer af transformerende vækstfaktor-β (TGF-p) superfamilien, og urokinase-plasminogenaktivator (uPA- plasmin), hvilket resulterer i aktiveringen af ​​matrixmetalloproteinaser (MMP’er; specifikt MMP-2 og MMP-9) såvel som interleukin-1 (IL-1) og interleukin-6 (IL-6) [16]. Men identifikation af den kritiske mekanisme (r) eller primære vej (e), der har ansvaret for den indledende udtryk for osteoclastogenic gen (er) og overdreven resorption resulterer i fremme af PCa knoglemetastaser stadig undvigende.

Det er almindeligt accepteret, at RANKL /RANK /OPG er de vigtigste regulatorer af knogle metabolisme og den PTHrP er en af ​​de vigtigste centrale regulatorer i osteoclast og osteoblast differentiering. Derfor i denne nærværende undersøgelse har vi fokuseret på at forstå, hvordan RANKL og PTHrP er reguleret i PCA celler ved NF-KB. NF-KB-proteiner er en vigtig klasse af transkriptionelle regulatorer i PSA. Rigelige data understøtter en vigtig rolle for NF-KB-signalering pathway ved styring af initiering og progression af human cancer [17] – [20]. Over-ekspression af NF-KB i kernen af ​​PCA-celler synes at være korreleret med PCa kemoresistens, fremskredent stadium, PSA recidiv og metastatisk spredning [21] – [27]. Flere undersøgelser har offentliggjort dokumentation for, NF-KB-vejen er en bidragyder til visceral eller “bløddele” metastaser i PCa [18], [19], [28], [29]. Vi har tidligere rapporteret, at aktivering af NF-KB-signalering fremmer kastrationsniveau-resistent vækst af PCa [30]. I denne undersøgelse undersøgte vi rollen af ​​NF-KB-signalering i koloniseringen af ​​PCA-celler i knoglen miljø og den rolle, denne mekanisme spiller i skelet ødelæggelse forbundet med PCa knoglemetastaser. Vi rapporterer, at aktiveringen af ​​NF-KB-signalering øger ekspressionen af ​​osteoclastogenic gener i PCA-celler, hvilket er tilstrækkeligt til cancerceller at vedhæfte og vokse i knoglen miljøet og øge læsionsdannelse. Så vidt vi ved, er dette den første rapport, at aktivering af NF-KB-signalering i PCA-celler øger osteoklastogenese ved opregulering osteoclastogenic gener og dermed bidrage til knoglemetastaser formation. Vores undersøgelse tyder på, at målrette nedregulering af NF-KB kunne have en stor indvirkning på at reducere smertefulde knoglemetastaser i avancerede PCA patienter.

Materialer og metoder

Cell kultur og materialer

De humane prostata carcinom-cellelinier LNCaP og PC-3 blev opnået fra ATCC (Manassas, VA). C4-2B celler var gaver af Dr. Leland Chung (Cedars Sinai Medical Center, Los Angeles, Californien) [31]. Celler blev holdt ved 37 ° C i en fugtig atmosfære af 5% CO

2 i luften. Cellelinjer blev rutinemæssigt dyrket i RPMI 1640 (Gibco-BRL) medium indeholdende 5% føtalt kalveserum (FBS) (Hyclone), 0,1% ITS og 0,1% glutamin (Gibco-BRL).

Generation of NF- KB-signalering kontinuerligt aktiveret /inaktiveret PCA cellelinjer

For at generere en konstitutivt aktiveret NF-KB-signalering PCa cellelinje blev LNCaP celler stabilt inficeret med IKK2-EE retroviral vektor resulterer i LNCaP-EE, hvor NF-KB aktivitet blev aktiveret med et konstitutivt aktiv (EE) mutanter af IKK2 [32], [33]. For at generere NF-KB signalering kontinuerligt inaktiverede PCA cellelinier blev C4-2B og PC3-celler, der stabilt inficeret med IKK2-KD retroviral vektor (C4-2B-KD og PC3-KD), hvori NF-KB-aktivitet blev inhiberet med en kinase døde (KD) IKK2 mutant [32], [33]. De celler inficeret med tom vektor, blev anvendt som kontroller (LNCaP-EV, C4-2B-EV og PC3-EV). Alle retrovirusvektorer var en gave fra Dr. Martin Leverkus, University of Magdeburg, Tyskland.

Reverse Transcription og Real-time PCR

I alt RNA fra LNCaP, LNCaP-EE, C4-2B og PC3-celler blev ekstraheret ved anvendelse af Trizol (Gibco-BRL), og resterende genomisk DNA blev fjernet ved DNasel (Invitrogen) behandling. RNA’erne blev revers transkriberet under anvendelse af tilfældige primere og Superscript II (Gibco-BRL) ifølge fabrikantens protokol. Primerne anvendt til at amplificere RANKL var 5′-TGGAAGGCTCATGGTTGGAT-3 ‘(fremad), 5′-CATTGATGGTGAGGTGTGCAA-3′ (revers); PTHrP var 5’-TTAAAGCAGTACCCCCCTACCA-3 ‘(fremad), 5′-ATGGGCTCTAGCGCCTCTCT-3’ (tilbage). Real-time PCR reaktioner blev udført i et 20 pi volumen under anvendelse af en 96-brønds pladeformat og fluorescens blev detekteret ved anvendelse af Bio-Rad I-Cycler IQ real-time detektionssystem. Genekspression blev normaliseret til 18s rRNA af 2

-ΔΔCt metode [34].

RANKL ELISA og PTHrP Radio-immunoassays (RIA)

Til bestemmelse af RANKL og PTHrP niveauer udskilles af PCA celler, LNCaP-EV, LNCaP-EE, PC3-EV og PC3-KD-celler blev dyrket separat for 48 timer; celleantal blev talt. 40 og 100 pi af dyrkningsmedier blev anvendt i ELISA (MyBioSource) og RIA (Beckman Coulter) ifølge producentens anvisninger, hhv. Hver prøve blev analyseret i tre eksemplarer ved ELISA-læser eller en gammatæller (Beckman Coulter) og koncentrationer blev bestemt ifølge producentens instruktioner.

Western blot-analyse

helcellelysat blev ekstraheret fra NF-KB aktiveret /inaktiverede PCA celler. En 20 ug portion af hver proteinprøve blev separeret på en 4 til 12% Tris-glycin-gradient gel (NOVEX ™), og derefter overført til nitrocellulosemembraner (Schleicher C4-2B-EV, C4-2B-KD; PC3-EV og PC3-KD-celler). For at generere de konditionerede medier indeholdende sekreter af PCA-celler, RPMI 1640 medium (indeholdende 5% FBS, 0,1% ITS og 0,1% glutamin) blev tilsat til PSA cellekulturskåle. Efter 24 timer blev mediet høstet og overført til målceller (osteoblaster). MTT assayet blev udført ved 48 timer efter behandlingen.

Mus model af tumor-induceret knoglesygdom

Alle dyreforsøg blev udført i nøje overensstemmelse med anbefalingerne i Vejledning for pleje og brug af forsøgsdyr af National Institutes of Health. Protokollen blev godkendt af Vanderbilt Institutional Animal Care Brug Udvalg (Permit nummer: M /09/387). Både NF-KB aktiveret (PC3-EV, C4-2B-EV og LNCaP-EE) og inaktiveret (PC3-KD, C4-2B-KD og LNCaP-EV) PCA celler blev anvendt til at undersøge, om aktiveringen af ​​NF- KB-signalering bidrager til PCa tumor etablering og vækst i knoglen miljø. For at reducere inter-vært variabilitet, når man sammenligner kontrol- og testgrupper, NF-KB aktiveret og inaktiverede PCA celler blev podet i samme mus. I hver enkelt vært, blev venstre skinneben injiceret med NF-KB aktiveret PCa (PC3-EV, C4-2B-EV og LNCaP-EE) celler, mens højre skinneben blev injiceret med NF-KB inaktiveret PCa (PC3-KD, C4-2B-KD og LNCaP-EV) celler. Specielt har en enkelt-cellesuspension af 2 × 10

5 PC3-EV eller PC3-KD; C4-2B-EV eller C4-2B-KD; LNCaP-EV eller LNCaP-EE celler /10 pi PBS blev anbragt direkte i 6-7 uger gamle mandlige athymiske nøgne mus (BALB /c-stammen) knogle ved intratibial injektion under isofluran-narkose, hhv. Hver gruppe havde et minimum af 4 mus. Osteoblastiske læsioner blev vurderet ved hjælp af små dyr røntgen røntgenbillede imaging (Faxitron LX-60; Lincolnshire). Efter offer blev knogle volumen evalueret ved mikro CT scanning og histologisk analyse på 3 (for PC3-EV og PC3-KD celler injicerede mus) og 10 (for LNCaP-EV, LNCaP-EE, C4-2B-EV og C4-2B -KD celler injiceret mus) uger efter podning med tumoren. Høstet tibia blev fikseret i 10% neutral pufret-formalinopløsning i 24 timer og afkalket i 0,5 mol /l EDTA i Ca

2 + – og Mg

2 + -fri Dulbeccos PBS i en uge før indlejring i paraffin. Seks mikrometer langsgående serielle snit blev skåret fra skinneben og farvet med H PSA: 1:500; Fox A1: 1:1000) i en time ved stuetemperatur. Det sekundære antistof blev inkuberet i 60 minutter ved brug af enten peberrod-peroxidase-konjugeret gede-anti-kanin eller gede-anti-muse (1:1000) hhv. Slides blev skyllet grundigt i vand fra hanen, kontrastfarvet med Mayers hæmatoxylin og monteret

Statistisk og billedanalyse

Eventuelt eksperimentelle grupper blev sammenlignet ved hjælp af to-stikprøve

t

. – test, med signifikans defineret som

P

. 0,05

Resultater

Aktivering af NF-KB-signalering øger ekspressionen af ​​osteoklastogenese-associerede gener i PCA celler

kBa inhiberer NF-KB-signalering ved at binde til NF-KB og forebyggelse kernelokalisering [38], [39]. Derfor nedregulering af kBa resulterer i kontinuerlig aktivering af NF-KB signalering [40], [41]. For at undersøge rollen af ​​NF-KB signalering på prostata /PCa udvikling og progression, udførte vi RNA microarray direkte at sammenligne prostatavæv fra kBa knock out (KO) mus [40], [41] (herunder kBa – /- og kBa +/- mus) med normale mus prostata væv. Resultaterne fra microarray-analyse viste, at ekspressionen af ​​mange osteoklastogenese-associerede gener, såsom RANKL, PTHrP, GM-CSF og uPA, steg over 2 gange i både kBa – /- og kBa +/- prostatavæv sammenlignet med det af normal prostata (data ikke vist). For yderligere at bekræfte, om NF-KB-signalering er involveret i reguleringen af ​​osteoklastogenese-associerede gener i PCA-celler, vi aktiverede NF-KB signalering i LNCaP-celler ved infektion med IKK2-EE retroviral vektor, hvori NF-KB-aktivitet blev aktiveret med et konstitutivt aktive mutanter af IKK2 [32], [33]. Aktiveringen af ​​NF-KB-signalering blev bekræftet under anvendelse af NGL reporter, en NF-KB reporter plasmid, som har en NF-KB-responsive element koblet til en GFP /Luciferase reporter [35] (Fig. 1A). QRT-PCR-analyse viste, at RANKL og PTHrP ekspression, er steget betydeligt i NF-KB aktiverede LNCaP-celler, sammenlignet med tom vektor kontrolceller (fig. 1B og 1C). RANKL og PTHrP er kendt som nøglefaktorer for osteoklastogenese i knoglen, og de spiller en central rolle i knoglemetastaser af mange kræftformer [15], [42] – [45]. Derfor er resultaterne fra vores QRT-PCR viser, at NF-KB-signalering er involveret i reguleringen af ​​RANKL og PTHrP, de osteoklastogenese-associerede gener i PCA celler.

NF-KB-signalering blev aktiveret i LNCaP celler ved inficere med IKK2-EE retroviral vektor (LNCaP-EE), mens LNCaP-celler inficeret med den tomme vektor blev anvendt som kontroller (LNCaP-EV). NF-KB-aktivitet i LNCaP-EV og LNCaP-EE-celler blev målt ved anvendelse af en NF-KB responsive NGL reporter (A). Ekspression af RANKL (B) og PTHrP (C) blev målt ved QRT-PCR. Værdierne plottede repræsenterer middelværdien af ​​mindst tre individuelle prøver ± SEM. Statistisk signifikans blev bestemt ved to stikprøver

t

-test. **,

P

. 0,01

PCA celler kan vokse i knoglen mikromiljø har højere NF-KB-aktivitet

Det forlyder, at C4- 2B og PC3 PCA celler vokser godt, men LNCaP celler er vanskelige at dyrke i murine knogle efter intratibial /intrafemural injektion [46]. Dette indikerer, at celle-specifik genekspression begivenheder bidrager til vellykket kolonisering af knoglen ved PCA-celler. For at afgøre, om NF-KB-aktivitet afspejler PCa celler vækst i knoglen, blev endogene NF-KB-aktivitet i LNCaP, C4-2B og PC3 celler målt ved hjælp af NGL reporter [35]. Interessant, NF-KB-aktivitet i C4-2B og PC3-celler (som vokser godt i knoglen) er væsentlig højere end den for LNCaP-celler (fig. 2A). Desuden QRT-PCR indikerer PTHrP (mRNA) ekspression er betydeligt højere i NF-KB aktiverede LNCaP-EE, C4-2B og PC3-celler, sammenlignet med det i LNCaP-celler (fig. 2B). ELISA og RIA-assays viser, at aktiveringen af ​​NF-KB signalering øget RANKL og PTHrP (protein) sekretion betydeligt i LNCaP-EE-celler, sammenlignet med tom vektor kontrolceller (fig. 2C, D og E). Imidlertid inaktivering af NF-KB signalering i PC3-celler (PC3-KD) ved at inficere dem med IKK2-KD retroviral vektor, hvor NF-KB-aktivitet blev inhiberet med en kinase død (KD) IKK2 mutant [32], [33] ( fig. 2C), resulterede i et signifikant fald i RANKL og PTHrP niveau sammenlignet med tom vektor kontrolceller (PC3-EV) (fig. 2D og E). Western blotting-analyse bekræftede yderligere, at ekspressionen af ​​RANKL og PTHrP var forøget i NF-KB aktiverede PCA-celler (LNCaP-EE), mens, faldt i NF-KB inaktiveret PCA-celler (PC3-KD), sammenlignet med tom vektor kontrolceller ( LNCaP-EV og PC3-EV) (fig. 2F). Disse resultater indikerer, at PCA-celler der er i stand til at vokse i knoglen mikromiljø har højere NF-KB-aktivitet og aktivering af NF-KB signalering opregulerer osteoklastogenese-associerede gener i PCA-celler, potentielt forbedre deres evne til at vedhæfte og vokse i knoglen mikromiljø.

(A) PCA celler i stand til vækst i knoglen mikromiljø udviser øget NF-KB-aktivitet. NF-KB-aktivitet i LNCaP, C4-2B og PC3-celler blev målt ved anvendelse af en NF-KB responsiv NGL reporter. (B) Ekspression af PTHrP er korreleret med aktiviteten af ​​NF-KB signalering i PCA-celler. Ekspression af PTHrP i LNCaP, NF-KB aktiverede LNCaP-EE, C4-2B og PC3-celler blev målt ved QRT-PCR. (C) Generering NF-KB inaktiveret PCA cellelinier. NF-KB-signalering blev inaktiveret i C4-2B og PC3-celler ved infektion med IKK2-KD retroviral vektor (C4-2B-KD og PC3-KD), mens PCA-celler inficeret med den tomme vektor blev anvendt som kontroller (C4-2B og PC3-EV). NF-KB-aktivitet blev målt ved anvendelse af en NF-KB responsiv NGL reporter. (D og E) Ekspression af RANKL (D) og PTHrP (E) proteiner i NF-KB aktiverede LNCaP-EE og NF-KB inaktiveret PC3-KD-celler blev målt ved ELISA og RIA-assays, hhv. Cellerne inficeret med tom vektor (LNCaP-EV og PC3-EV) blev anvendt som kontrol. (F) Ekspression af RANKL og PTHrP er korreleret med aktiviteten af ​​NF-KB signalering i PCA-celler. RANKL og PTHrP ekspression blev vurderet ved Western blot-analyse. Værdierne plottede repræsenterer middelværdien af ​​mindst tre individuelle prøver ± SEM. Statistisk signifikans blev bestemt ved to stikprøver

t

-test. **,

P

. 0,01

Aktivering af NF-KB-signalering i PCA celler bidrager til osteoklastogenese

Osteoklaster er højt specialiserede flerkernede celler, der er ansvarlige for knogle resorption, en proces kritisk for opretholdelse af knoglestrukturen og calcium homeostase. Imidlertid patologisk aktivering af osteoklaster resulterer i knogletab associeret med inflammatorisk arthritis, periodontal sygdom og cancermetastase til knogler. Osteoklaster afledt af monocyt /makrofag afstamning progenitorer under indflydelse af cytokinet RANKL [47]. For at bestemme, om aktivering af NF-KB signalering i PCa celler påvirkninger osteoklastogenese i knoglemarv, blev monocyt /makrofag afstamning progenitorer fra primær knoglemarvsceller behandlet med konditioneret medium fra NF-KB aktiveres /inaktiverede PCA-celler, og overvåges for osteoclast differentiering. Vores resultater viser, at konditioneret medium fra NF-KB aktiverede LNCaP-celler (LNCaP-EE) inducerede TRAP-positive multinuclear celle formationsegenskab af osteoklaster, mens det konditionerede medium fra LNCaP-celler undladt at gøre det (fig. 3A og tabel 1). C4-2B og PC3-celle konditionerede medier også induceret TRAP-positive flercellede celle-dannelse (fig. 3A og tabel 1). For yderligere at forstå hvordan NF-KB signalering i PCA celler påvirkninger cellulære bestanddele i knoglen microenviornment blev osteoblaster fra primære kulturer af murine knoglemarvsceller behandlet med konditioneret medium fra NF-KB aktiveres /inaktiverede PCA-celler. Vores resultater viser, at konditioneret medium afledt af NF-KB aktiverede PSA-celler havde ingen signifikant virkning på osteoblast proliferation (fig. 3B). Disse resultater viser, at aktivering af NF-KB signalering i PCA-celler bidrager til osteoklastogenese, men ikke til osteoblastproliferation.

(A) konditioneret medium fra NF-KB aktiverede PSA-celler inducerer osteoklast-lignende celle dannelse

in vitro

. Knoglemarvafledte makrofager blev behandlet med konditionerede medier fra LNCaP, NF-KB aktiverede LNCaP-EE, C4-2B og PC3-celler. TRAP-farvning blev udført efter 10 dages yderligere dyrkning med konditioneret medie. Pile angiver osteoklastlignende celler. (B) Aktivering af NF-KB-signalering i PCA-celler ikke har nogen signifikant effekt på osteoblaster proliferation. Primære dyrkede osteoblaster blev behandlet med konditioneret medie fra NF-KB aktiveret (LNCaP-EE, C4-2B-EV og PC3-EV) eller inaktiveret (LNCaP-EV, C4-2B-KD og PC3-KD) PCA celler. Proliferation assay (MTT assay) blev udført ved 48 timer efter behandlingen.

antagonisering NF-KB-signalering hæmmer PCa tumor etablering og vækst i knoglen

For at bestemme hvis modvirkning NF-KB-signalering hæmmer PCa tumor etablering og vækst i knoglen mikromiljø, genereret vi NF-KB-signalering inaktiverede PCA cellelinjer ved stabilt inficere med IKK2-KD-vektorer (PC3-KD og C4-2B-KD) (fig. 2C ). Selvom NF-KB blokade lidt ændrede opformeringsrater (fig. 4), alle de manipulerede celler voksede godt (overleve)

in vitro

efter nedregulering af NF-KB-aktivitet. NF-KB inaktiveret PC3 og C4-2B celler (PC3-KD og C4-2B-KD) blev inokuleret i knoglen af ​​mus ved intratibial injektion og lille dyr X-ray røntgenbillede billeddannelse blev udført for at overvåge knoglelæsion udvikling. Mus blev aflivet til histologisk analyse efter 3 uger (for PC3-EV og PC3-KD-celler injicerede mus) og 10 uger (for C4-2B-EV og C4-2B-KD-celler injicerede mus) efter podning. Alle tumorer podet med PC3-EV og C4-2B-EV-celler (PC3 og C4-2B celler inficeret med tom vektor, blev anvendt som kontroller) voksede godt i knoglen; henviser, NF-KB inaktiveret PC3-KD og C4-2B-KD cellevækst blev ikke påvist (0/4 i begge gruppe) ved røntgen røntgenbillede billeddannelse eller histologisk analyse (fig. 5A og 5B). Histomorfometriske analyser viste, at den gennemsnitlige BV /TV er 5,3% for PC3-EV og 13,9% for C4-2B-EV tumorer. Disse resultater viser, at inaktivering af NF-KB-signalering hæmmer både osteolytiske (PC3) og osteoblastiske /osteoklastisk blandet (C4-2B) PCa tumorer etablering og vækst i knoglen miljø.

NF-KB aktiveres /inaktiveret PCa celle linier blev dannet ved stabilt at inficere med IKK2-EE /IKK2-KD vektorer. IKK2-EV blev anvendt som kontrol vektor. Proliferation blev bestemt ved MTT-analysen.

NF-KB inaktiveret PC3-KD og C4-2B-KD-celler blev podet ind i musen knogler ved intratibial injektion.