PLoS ONE: Klotho sensibiliserer Menneskelig Lung Cancer Cell Line til cisplatin via PI3K /Akt Pathway

abstrakt

Klotho blev først identificeret i 1997 og er blevet betragtet som en anti-aging gen. Nye beviser viser, at klotho har et tæt forhold til kræft, herunder lungekræft, brystkræft, etc, ved at hæmme proliferation og fremme apoptose af cancerceller. Cisplatin har været den mest udbredte stof i den første linje kemoterapi. Imidlertid har stigningen i cisplatin-resistente cancerceller blevet en stor hindring i kliniske behandling af cancere. I vores undersøgelse, vi for første gang påvist, at klotho kunne dæmpe modstanden af ​​lungekræft for cisplatin kemoterapi og apoptose af de resistente celler med klotho overekspression blev markant forøget. Men viste klotho knockdown celler forbedret resistens mod kemoterapi. Yderligere analyse viste, at hæmning af PI3K /Akt vej med specifik inhibitor (LY294002) svækket de fremmende effekter på væksten kræft efter forstyrrer klotho shRNA. Desuden viste vi, at klotho modulerede modstanden til cisplatin i en xenograft nøgne mus model. Disse observationer foreslog, at klotho kunne forbedre modstanden af ​​lungekræft celler til kemoterapi og kan tjene som et potentielt mål for genterapi af lungekræft resistente over for cisplatin kemoterapi

Henvisning:. Wang Y, Chen L, Huang G, Han D, han J, Xu W, et al. (2013) Klotho sensibiliserer human lungekræft Cell Line til cisplatin via PI3K /Akt Pathway. PLoS ONE 8 (2): e57391. doi: 10,1371 /journal.pone.0057391

Redaktør: Devanand Sarkar, Virginia Commonwealth University, USA

Modtaget: Juni 7, 2012; Accepteret: 24 Jan 2013; Publiceret: 21 feb 2013

Copyright: © 2013 Wang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af en bevilling fra National Natural Science Foundation of China (nr 30.971.320). Den bidragyder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Ikke-småcellet lungecancer (NSCLC) tegner sig for 75-85% af lungekræft tilfælde og kemoterapi spiller en vigtig rolle i behandlingen af ​​lungecancer [1]. Cisplatin har været den mest udbredte stof i den første linje kemoterapi. Cisplatin kan aktivere flere signalveje, herunder dem, der involverer ATR, p53, p73, og MAPK, og aktivere apoptose [2], [3]. Dens cytotoksicitet tilskrives dannelsen af ​​DNA-addukter, som forårsager inter- og intra-streng tværbinding, som inhiberer DNA-replikation. Imidlertid har modstanden af ​​lungekræft for kemoterapi været en væsentlig faktor, der påvirker den terapeutiske virkning ved behandling af lungecancer. Således er det bydende nødvendigt at udvikle strategier for at forbedre modstanden af ​​menneskelig lungekræft at Platin kemoterapi. Den mekanisme, der ligger resistensen af ​​cancerceller over for kemoterapi er kompliceret og involverer aktiveringen af ​​PI3K /Akt (også kendt som PI3K /PKB) pathway, tab af p53-funktion, overekspression af HER-2 /neu og anti-apoptotisk bcl -2, og den kompromitterede caspaseaktivering [2], [3]. Således dybt at undersøge mekanismen bag resistensen af ​​cancerceller over for kemoterapi har stor klinisk betydning ved behandling af cancere.

Klotho er en nyligt fundet anti-aging gen og blev oprindeligt identificeret i klotho homozygote mutante mus ( KL – /-) som viste en menneskelignende aldersrelaterede syndrom og udvikle flere lidelser, såsom hypogonadisme, ektopisk forkalkning, osteoporose, hudatrofi, og lungeemfysem [4]. Imidlertid mus med klotho overekspression har en udvidet levetid, der er 30% længere hos mænd og 20% ​​længere hos kvinder [5]. Klotho genet koder for et enkelt-pass typen-1 transmembrane eller secerneret form af klotho protein gennem alternativ RNA-splejsning [6]. Klotho blev vist at udøve en hæmmende virkning på insulin-lignende vækstfaktor-1 (IGF-1) pathway i både humane beast cancerceller og bugspytkirtelkræftceller [7], [8]. Vores tidligere undersøgelse viste også dette fænomen i humane lungecancer-celler (A549-celler) i hvilken klotho også tillægges en pro-apoptotisk virkning gennem Bax /bcl-2 pathway [9]. PI3K /Akt vej er en af ​​de vigtige down-streams af IGF-1-vejen, og talrige undersøgelser har bekræftet sin rolle i apoptose af cancerceller [10] – [12]., Og kunne sensitisize disse kræftceller til cisplatin

i denne undersøgelse har vi en hypotese klotho kunne hæmme PI3K /Akt vej og videre til at afhjælpe modstanden af ​​lungekræft celler til cisplatin og kan tjene en potent kandidat til genterapi af lungekræft.

Materialer og metoder

Etik erklæring

Denne undersøgelse blev udført i nøje overensstemmelse med anbefalingerne i Vejledning for Pleje og anvendelse af forsøgsdyr af National Institutes of Health. Protokollen blev godkendt af Udvalget for den etiske af dyreforsøg i Nanjing medicinsk universitet (Permit Nummer: 2.120.474). Alle operation blev udført under natrium pentobarbital anæstesi, og blev gjort alle bestræbelser på at minimere lidelse.

Cell kultur og transfektion

Menneskelig lungekræft cellelinje (A549 celler) blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC). Den H460 celler og cisplatin-resistente A549 og H460 (A549DDP og H460DDP) celler blev venligst stillet til rådighed af Prof. Zhou i Shanghai Pulmonal Hospital. Alle cellelinier blev opretholdt i RPMI 1640 (Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD) indeholdende 10% føtalt bovint serum (FBS) (Life Technologies, Inc.), 100 U /ml penicillin, 100 U /ml streptomycin, 2 mM glutamin i en befugtet atmosfære med 5% CO

2 ved 37 ° C. For at opretholde lægemiddelresistens blev A549 /DDP og H460 /DDP-celler dyrket i RPMI 1640 indeholdende 2 pg /ml DDP og derefter i DDP fri RPMI 1640 to dage før eksperimenterne. A549DDP celler der strækker 80% konfluens blev transficeret med pCMV6-MYC-KL og de specifikke shRNAs i nærvær af Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Den shRNAs var som følger:

sh-1: CCTAAGCTCTCACTGGATCAATCCTCGAA;

sh-2: CTGAGGCAACTGCTTTCCTGGATTGACCT;

sh-3: GGTCACTCACTACCGCTTCTCCATCTCGT;

SH- 4:. GTTACAGCATCAGGCGTGGACTCTTCTAT;

Alle plasmider blev købt fra OriGene (Rockville, MD, USA)

MTT Assay

den halve maksimale hæmmende koncentration (IC50) af A549DDP og A549-celler blev bestemt ved MTT (3- [4,5-dimethylthiazol-2-yl] -2,5-diphenyltetrazoliumbromid) assay (Sigma). Cancerceller blev podet i 96-brønds plader (1 × 10

4 celler per brønd) og behandlet med cisplatin ved forskellige koncentrationer i 48 timer. Efter inkubation blev medierne erstattet med 50 pi MTT-reagens (2 mg /ml) efterfulgt af yderligere inkubation i en atmosfære med 5% CO

2 ved 37 ° C i 2 timer. Derefter blev mediet fjernet og dimethylsulfoxid (DMSO) (150 pi) blev tilsat til hver brønd. Den optiske densitet (OD) af hver brønd blev målt ved anvendelse af en mikropladelæser ved 560 nm.

Morfologisk undersøgelse

Fireogtyve timer efter transfektion blev cellerne behandlet med 80 pM (IC50 for A549DDP) cisplatin i 8 timer, og 60 uM for H460DDP, og derefter vasket en gang i phosphatpuffer saltvand (PBS) efterfulgt af fiksering i kold methonal: acetone (1: 1) i 5 minutter. Efter vask tre gange i PBS i 5 minutter, blev disse celler behandlet med 4 ug /ml 4 ‘, 6-diamidine-2’-phenylindol dihydrochlorid (DAPI) (Sigma) i 10 minutter ved stuetemperatur. Celler blev derefter undersøgt ved fluorescensmikroskopi. Celler blev udvalgt tilfældigt til undersøgelse på et stor forstørrelse (× 400) og fotograferet. Begge normale celler (store nukleare, dispersion og homogen fluorescens) og de apoptotiske celler (nuklear svind og hyperkromatiske kerner) blev talt under hvert felt.

Flowcytometri

Celler blev høstet og forsigtigt disaggregeret til en enkelt cellesuspension. Farvning blev fremstillet ifølge producentens protokol. Hastigheden af ​​apoptose induceret af anticancermidler regimer blev analyseret ved flowcytometri under anvendelse af et annexin V-FITC /PI kit (BD Biosciences, San Diego, CA) ifølge producentens instruktioner.

Real-time RT-PCR

Totalt RNA blev ekstraheret fra celler med TRIzol-reagens (Invitrogen, San Diego, CA) ifølge producentens instruktioner, og kvantificeres ved at måle absorbansen ved 260 nm. Genekspressioner blev påvist ved kvantitativ real-time RT-PCR (QRT-PCR) under anvendelse af standard SYBR Green RT-PCR kit (Takara, Dalian, Kina) ifølge producentens instruktioner. CDNA’et blev syntetiseret under anvendelse af RevertAid First-Strand cDNA Synthesis kit (Fermentas, Vilnius) ifølge producentens instruktioner. Primer sekvenser blev designet med Origene Technologies, Inc. De anvendte primere var som følger:

klotho

forstand: 5′-GCTCTCAAAGCCCACATACTG -3 «

antisense: 5 ‘ -GCAGCATAACGATAGAGGCC -3 «

β-actin

forstand: 5′-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3 ‘;

antisense: 5′-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3′;

PCR-betingelser bestod af præ-denaturering ved 94 ° C i 5 minutter, efterfulgt af 30 cykler af denaturering ved ved 94 ° C i 30 sekunder, annealing ved 60 ° C i 30 sekunder og forlængelse ved 72 ° C i 30 sek og en endelig forlængelse ved 72 ° C i 10 min.

Western blot assay

24 timer og 48 timer efter transfektion, cellerne blev vasket to gange i iskoldt PBS og proteiner blev ekstraheret fra celler ved lyse i RIPA-buffer (150 mM NaCl, 1% [v /v] NP-40, 0,5% [vægt /vol] natriumdeoxycholat, 0,1% [vægt /vol] natriumdodecylsulfat (SDS), 50 mM Tris-HCI [ ,,,0],pH 8], 10 mM EDTA og 1 mM PMSF [Sigma]) i 30 minutter ved 4 ° C og efterfølgende centrifugering i 15 minutter ved 12.000 g. Proteinkoncentration blev bestemt med et BCA-kit (Pierce) ifølge producentens instruktioner. Derefter, 60 ug protein blev sat på en 10% (w /v) SDS-polyacrylamidgel, elektroforeret og overført til en PVDF-membran (Millipore Corporation Billerica, MA 01821), som derefter blev blokeret i 2 timer ved stuetemperatur med blokerende buffer (TBS indeholdende 0,1% [v /v] Tween 20 [Sigma] og 5% [w /v] mælkepulver). Primære antistoffer (anvendt i 1 time ved stuetemperatur, eller natten over ved 4 ° C) var: anti-phospho-AKT, anti-akt, (Cell Signaling Technology, Inc., Beverly, MA), anti-Bax, anti-klotho og anti-GAPDH (Santa Cruz). Antistoffer blev fortyndet til 1: 1.000, bortset fra anti-GAPDH-antistof (1: 500). Derefter blev membraner inkuberet i 2 timer med HRP-konjugerede sekundære antistoffer (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA) (heste-anti-mus eller ged-anti-kanin, 1: 20000). Visualisering blev udført ved hjælp af en ECL-kit, og signalerne blev kvantificeret ved scanning densitometri.

transduktion af lentivirus

De lentivirale vektorer, der udtrykker korte hårnål RNA (shRNAs) lykkedes bygget af OriGene (Rockville , MD, USA) som tidligere beskrevet. De effektivt konstrueret klotho-shRNA oligonukleotidsekvenser var som følger, fornuft: 5′-

CGCGTCCCC

CTGAGGCAACTGCTTTCCTGGATTGACCT

TCAAGAGAGGTCAATCCAGGAAAGCAGTTGCCTCAGTTTTTGGAAAT

-3′.

The sekvenser blev indsat i

mul

I og

CLA

jeg enzym steder i pLVTHM vektor, hhv. Til rekombination under anvendelse pCMV-dR8.74 og pCMV-VSV-G-vektorer (

Addgene

, Cambridge, MA), lentivirale vektor-DNA’er og emballering vektorer blev derefter transficeret i 293T-celler. Efter 48 timers transfektion blev supernatanter indeholdende lentivirus høstet, centrifugeret ved 1800 g i 10 min og filtreret gennem et 0,45 um poly (vinylidendifluorid) Durapore membran (Millipore, Billerica, MA, USA) for at fjerne eventuelle ikke-vedhæftende pakkeceller. Resistent lungecancer-cellelinie (A549DDP) blev inficeret med lentivirus. Derefter blev de inficerede celler udvælges ved puromycin (0,4 ug /ml) i 14 dage. A549DDP celler inficeret med lentivirus-medieret shRNA målrettet klotho (sh-klotho) eller lentivirus-medieret shRNA (scramble) blev navngivet A549DDP-Lenti-sh-2 eller A549DDP-Lenti-scramble hhv.

In vivo eksperimenter i

​​Til in vivo eksperimenter, Male athymiske nøgne mus (BALB /c nu /nu, fire uger gamle) blev anvendt nøgne mus

. De blev injiceret subkutant med A549DDP-Lenti-sh-2 eller A549DDP-sh-scramble celler. Når tumorer målt en gennemsnitlig volumen på 100 mm3, blev musene (6 pr gruppe) blev behandlet med cisplatin (3,5 mg /kg, 2 gange om ugen) eller PBS i 21 dage. Tumorer blev målt med passere. Tumorvolumener blev beregnet efter følgende formel: tumor volumen (mm3) = 0,5 * (mm) * bredde (mm) * bredde (mm)

Statistisk analyse

Data blev udtrykt som. middelværdi ± standardafvigelse (SD). Eksperimenter blev udført mindst tre gange. Sammenligninger blev udført med to-halet Students t-test eller ANOVA. En værdi på

P

. 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

Klotho udtryk blev nedreguleret i cisplatin-resitant celler

For at bekræfte modstand A549DDP og H460DDP celler, blev MTT-assayet udført for at måle IC50 for A549-celler og A549DDP celler. Resultaterne viste IC50 var 17,7 ± 1,93 uM i A549 celler og 86,6 ± 13,2 uM i A549DDP celler, mens H460DDP og dets moderselskab cellelinje var 63,5 ± 3,8 og 27,7 ± 2,0 (fig 1A). Ekspressionen af ​​klotho blev bestemt ved real-time PCR og western blot-assay. Den relative mRNA-niveauet af klotho i A549DDP celler var ca. 35% lavere end i A549-celler (fig 1B). Western blot assay viste den samme tendens i proteinet ekspression af klotho i begge cellelinier (figur 1C). Endvidere har vi identificeret ekspressionen af ​​klotho og IC50-værdier i andre cellelinier, herunder H1299, PC-9, H1650 og MCF-7 (Fig 1C), og vi fandt, at de endogene klotho udtryk negativt var relateret til cisplatin følsomhed (Fig 1C) og statistisk analyse viste et omvendt forhold mellem klotho udtryk og IC50-værdier. Således har vi spekuleret på, at der var sammenhæng mellem klotho udtryk og modstanden mod cisplatin og klotho udtryk kan bidrage til modstanden

A:. To cellelinjer behandlet med cisplatin viste forskel i IC50. B: Kvantitativ RT-PCR til påvisning af klotho ekspression i A549-celler og A549DDP celler. C: Western blot analyse af klotho ekspression i et panel af lungekræft cellelinjer, herunder to cisplatin resistente varianter og en brystcancer-cellelinie (MCF-7). Klotho ekspression er højere i parental H460, og A549-cellelinier i sammenligning med cisplatin resistente varianter. Højere Klotho ekspression blev også påvist i H1299, PC-9, H1650 og MCF-7-cellelinjer. GAPDH tjente som en intern reference. Detektion blev udført i tre eksemplarer og data blev præsenteret som gennemsnit ± SD (* P 0,05)

Over-ekspressionen af ​​klotho kunne hæmme Akt signal pathway og inducere apoptose af A549 /DDP celler

for at fastlægge den rolle, klotho i cisplatin-modstand cisplatin resistente celler, først opdaget vi p-AKT udtryk i A549, H460 og deres cisplatin resistente celler. Resultaterne viste, at ekspressionen af ​​phosphoryleret Akt blev signifikant sænket i A549 og H460-celler (fig 2A). Derefter blev kræftceller med klotho overekspression fremstillet. Som vist i figur 2C blev protein udtryk for klotho i begge cellelinier markant forøget efter transfektion. Virkningen af ​​klotho over-ekspression på modstanden af ​​A549 /DDP og H460 /DDP-celler til cisplatin blev bestemt ved MTT-assayet. Data er vist i figur 2B. Spredningen af ​​celler transficeret med klotho blev signifikant undertrykt sammenlignet med kontrolgruppen. De gennemsnitlige IC50-værdier var lavere i klotho transficerede celler antyder, at disse celler var mere følsomme over for cisplatin. Endvidere blev ekspressionen af ​​phosphoryleret Akt negativt relateret til klotho ekspression celler med klotho overekspression viste en nedsat ekspression af phosphoryleret Akt sammenlignet med kontrolgruppen (fig 2C). Derefter, vi opdaget apoptose af celler, som undergår klotho transfektion. DAPI-farvning er en metode til påvisning af apoptose. Apoptotiske celler vil morfologisk præsentere funktionerne i apoptose følgende DAPI farvning: lyse cellekernekondensation og perinuklear apoptotiske legemer. Flowcytometri er en teknik til tælling, undersøgelse og sortering mikroskopiske partikler suspenderet i en strøm af fluidum. Dette muliggør samtidig multiparametric analyse af de fysiske eller kemiske karakteristika af enkelte celler, der strømmer gennem et elektronisk detekteringsapparatur, og det er almindeligt anvendt til at detektere apoptose. Western blot-assay viste, at ekspressionen af ​​Bax og Bcl-2 havde de samme tendenser til dem i flowcytometri og DAPI-farvning (Fig 2D). DAPI-farvning viste antallet af apoptotiske celler med klotho over-ekspression blev dramatisk forøget, når der sammenlignes med dem, der gennemgår transfektion med blank plasmid, men den apoptose af celler behandlet med tomt plasmid var sammenlignelig med den i kontrolgruppen (fig 2E). Flowcytometri-analyse viste apoptose af de A549DDP celler transficeret med klotho var 47%, mens H460DDP var 19,8%, hvilket betyder, at de var mere følsomme over for cisplatin sammenlignet med de negative kontroller (fig 2F). Disse resultater antydede, at klotho kunne forøge følsomheden af ​​cisplatin-resistente celler for cisplatin ved at løfte apoptose i en Akt afhængig måde

A, B:. Western blot-assay viste p-Akt ekspression blev forøget væsentligt i cellerne resistent over for cisplatin. C: MTT-assay viste et stort fald i IC50 for klotho transficerede celler. D: Western blot-assay viste den forhøjede ekspression af klotho i cisplatin-resistente celler. P-Akt udtryk blev nedreguleret i cisplatin resistente celler efter klotho transfektion. GAPDH tjente som en intern reference. Eksperimenter blev udført i tre eksemplarer og data blev præsenteret som gennemsnit ± SD (* P 0,05)

Derudover undersøgte vi fænotype af resistente celler og stamceller, og vi fandt, at ERCC1 blev nedreguleret i klotho transficerede celler, medens p-gp, et gen relateret til lægemidlet efflux, og bidrog til det mest cisplatin modstand, blev ikke påvirket af klotho (fig 2C). Disse resultater antydede, at klotho kan påvirke reparation af cellerne gennem ERCC1 at ændre modstanden i kræftcellerne i stedet øge energi-afhængige udstrømning af hydrofobt stof.

Klotho knockdown hæmmede apoptose og øget resistens over for cisplatin i A549 /DDP celler

for yderligere at undersøge den rolle, klotho i modstanden i cellerne til kemoterapi, blev klotho knockdown udført i A549DDP og H460DDP celler med specifikke shRNAs. Fire shRNAs blev udformet og transficeret ind A549DDP eller H460DDP celler som beskrevet i vores tidligere undersøgelse, hvor resultater viste, at SH-2 udviste den bedste interferens effektivitet [9]. I denne undersøgelse blev sh-2 anvendes i de følgende forsøg. Som vist i figur 3B, western blot-assay demonstrerede ekspressionen af ​​klotho var signifikant nedreguleret med ca. 50% i sammenligning med den negative kontrolgruppe i begge cellelinier. Vi efterfølgende undersøgt effekten af ​​klotho knockdown af følsomheden af ​​de resistente celler til cisplatin, hvor MTT assay var ansat til at undersøge IC50 på A549DDP og H460DDP celler (Fig 3A). Resultaterne viste IC50 for shRNA transficerede celler havde en markant stigning i IC50 i sammenligning med den negative kontrolgruppe. Især i A549DDP celler, Den gennemsnitlige EC50 for celler transficeret shRNA var 452,5 ± 20,69 pM (Fig 3A)

A:. Den ERCC1 og p-gp proteinniveauer i cisplatin-resistente celler blev identificeret ved western blot. B: A549DDP og H460DDP celler blev transficeret med klotho specifikke shRNA eller krypteret RNA som en negativ kontrol. MTT-assay viste en øget IC50 på celler transficeret med shRNA. C: Western blot-assay bekræftede klotho ekspression blev nedreguleret i cellerne efter transfektion med shRNA. D: p-Akt blev også påvist ved Western blot-assay. Resultaterne viste, at p-Akt ekspression blev opreguleret betydeligt efter shRNA transfektion. GAPDH tjente som en intern reference. Forsøg blev udført tre gange og data wer præsenteret som middelværdi ± SD (* P 0,05)

Endvidere ekspressionen af ​​total-Akt, phospho-Akt (p-Akt), Bax og Bcl. -2 blev undersøgt i klotho shRNA transfekterede celler. Western blot-assay viste, at klotho knockdown førte til signifikant stigning i ekspressionen af ​​phospho-Akt (fig 3C) og bcl-2, men udtalt fald i ekspressionen af ​​Bax (en pro-apoptotisk protein) (Fig 2D). DAPI-farvning afslørede apoptose af celler, som undergår shRNA transfektion blev markant reduceret demonstreret ved mikroskopi sammenlignet med celler modtager transfektion med scramble shRNA (fig 2E). Flowcytometri viste apoptose af cellerne var 0,2% i A549DDP og 0,1% i H460DDP sammenlignet med celler transficeret med scramble (fig 2F). Disse resultater viste, at klotho nedregulering faldt apoptose via fører til ubalance i udtrykket af apoptose relaterede proteiner (Bax og bcl-2).

Øget modstand efter klotho nedregulering blev svækket af Akt hæmning med LY294002

for yderligere at undersøge, om klotho kunne forbedre modstanden i cisplatin-resistente celler til cispaltin gennem regulering af p-Akt ekspression, celler transficeret med klotho specifik shRNA blev behandlet med 10 pM og 40 pM LY294002, en phosphoinositide- 3-kinase-inhibitor, at belyse den rolle, Akt i forøget resistens over for kemoterapi efter klotho knockdown. LY294002 inhiberede signifikant ekspressionen af ​​p-Akt i shRNA transficerede celler, især efter behandling med 40 pM LY294002 (figur 4A), sammenlignet med den negative kontrolgruppe. Derefter blev MTT-assay anvendes til at bestemme følsomheden af ​​disse celler til cisplatin. Som vist i fig 4B, IC50 for de A549DDP celler behandlet med LY294002 ved 10 pM og 40 pM var 92,97 ± 10,04 um og 50,52 ± 5,63 uM, som var markant lavere end i kontrolgruppen (452,5 ± 20,69 uM; P 0,01), og de samme ændringer blev observeret i H460DDP celler. Derfor blev 40 pM LY294002 anvendt i de følgende eksperimenter. Som vist i fig 2D, Bax, et pro-apoptotisk protein, var signifikant opreguleret i celler, der undergår LY294002 behandling sammenlignet med celler uden behandling med PI3K /Akt inhibitor. Tværtimod ekspressionen af ​​bcl-2 var signifikant nedreguleret efter LY294002 behandling. Desuden DAPI-farvning og flowcytometri (fig 2E, F) viste de samme resultater. Disse resultater antydede, at klotho kunne afhjælpe modstanden af ​​kræftceller til kemoterapeutika ved at regulere apoptose i en PI3K /Akt signal pathway afhængig måde

A:. A549DDP og H460DDP celler transficeret med shRNA blev behandlet med LY294002 (10 og 40 uM). Western blot analyse viste, at LY294002 væsentlig grad kan sænke p-Akt udtryk, især efter behandling med 40 pM LY294002. B: Celler transficeret med shRNA blev behandlet med LY294002 i forskellige koncentrationer, og MTT-assay blev udført for at måle IC50. C: Apoptose relaterede proteiner, Bax og Bcl-2, blev påvist. Resultaterne viste klotho overekspression kunne øge Bax /bcl-2-forhold, mens klotho knockdown faldt det. LY294002 kunne vende den faldt forholdet efter shRNA transfektion. GAPDH tjente som en intern reference. Eksperimenter blev udført i tre eksemplarer og data præsenteres som gennemsnit ± SD (* P 0,05, ** P 0,01)

Klotho knockdown

in vivo

signifikant øget modstand. lunge kræftceller til at cisplatin

på baggrund af

in vitro

eksperiment af klotho i cisplatin modstand lungekræft, vi undersøgt, om klotho udtryk påvirker cispaltin følsomhed

in vivo

, A549DDP-Lenti-SH-2 og A549DDP-Lenti-kapløbet celler blev injiceret subkutant i den højre flanke hos nøgne mus. Cisplatin kunne signifikant inhibere tumorvækst i mus injiceret med A549DDP-Lenti-kapløbet celler sammenlignet med phosphatbufferen kontrol imidlertid mus injiceret med A549DDP-Lenti-SH-2-celler viste ingen signifikant inhibering sammenlignet med kontrolgruppen (Fig 5A) . Western blot yderligere indikerede, at ekspressionen af ​​klotho i A549DDP-Lenti-sh-2 solide tumorer var svag, mens det var positiv i kapløbet kontrol solid tumor. Lignende resultater med

in vitro

studier blev identificeret i ekspressionen af ​​p-Akt (Fig 5B). Disse resultater tyder på, at klotho bidrager til cisplatin modstand i lungekræft celler i xenograft tumormodeller, og PI3K /Akt var involveret i proceduren

A:. Apoptose af de analyserede ved flowcytometri celler. B: Apoptose af cellerne blev udført ved DAPI-farvning. Condensed kromatin blev undersøgt af en fluorescens mikroskopi. C:

In vivo

kemoresistens assay af klotho knockdown celler. Xenograft tumorvolumener hos mus behandlet med cisplatin eller fysiologisk saltvand er vist. Tumorvolumen præsenteres som middelværdi ± SD. D:. Ekspression af klotho og p-Akt i tumorvæv fra mus

Diskussion

Modstanden af ​​kræftceller til kemoterapi har været en af ​​de store udfordringer i den kliniske behandling af cancere. I vores tidligere undersøgelse, resultater viste, at den nye anti-aging gen klotho var afgørende for spredning og apoptose af lungekræft celler (A549 celler), primært gennem at hæmme IGF-1 /R vej [9]. Akt, en serin /threonin-kinase, spiller en vigtig rolle i onkogenese [13] – [15], og er blevet observeret ændret ekspression af Akt i forskellige humane cancere [16] – [18]. Akt er også en vigtig nedstrøms protein af IGF-1 /R-vejen. Stigende beviser understøtter, at Akt er involveret i modstanden af ​​kræftceller til kemoterapi og strålebehandling [18], [19]. For nylig har flere undersøgelser konstateret, at inhibering af Akt aktivering kan reducere celleoverlevelse og forbedre cisplatin resistens [20], [21]. Det forlyder, at Akt er involveret i cisplatin resistente i flere kræftformer [22] – [24]. Når den er aktiveret PKB /Akt er phosphorylerer og aktive målrette proteiner involveret i mange forskellige cellulære funktioner, som strækker cellecyklusprogression, celleoverlevelse, ribosom biogenese, proteintranslation og cellemotilitet 25-27. Klotho blev først fundet i 1997 som en formodet aldring-suppressor genet i mus, der forlængede levetid ved overekspression og inducerede en tidlig ældning syndrom, når forstyrret [5]. Da klotho kan inhibere IGF-1 /R-signalvejen i vores tidligere undersøgelse, og autophosphorylering af IGF-1R inducerer aktiveringen af ​​Akt ved phosphorylering, vi hypotese, at klotho kunne afhjælpe resistensen af ​​lungecancerceller (A549DDP og H460DDP celler) til kemoterapeutika, hvor Akt spiller en vigtig rolle.

i den foreliggende undersøgelse, cisplatin resistente NSCLC celler (A549DDP og H460DDP celler) og dets moderselskab celler (A549 og H460 celler) var ansat til eksperimenter. Først blev klotho ekspression målt i begge cellelinier, og resultaterne viste klotho ekspression både mRNA og protein niveauer i de resistente celler blev signifikant sænket sammenlignet med stamceller (P 0,05). Men udtryk for p-Akt i cisplatin resistente celler var signifikant højere end i moderselskabet celler. Desuden blev de høje IC50-værdier signifikant reduceret i A549DDP og H460DDP celler efter klotho opregulering. Men klotho nedregulering ved transfektion med specifikke shRNA øget resistens over for cisplatin, ledsaget af en stigning i p-Akt udtryk. Tidligere undersøgelser har identificeret Akt som et vigtigt protein i IGF-1-medieret celleoverlevelse [28]. Konstitutivt, Akt aktivering forhindrer fra den ekstracellulære matrix apoptose [29]. Der er 2 store mekanismer resistens i celler: først, forskellige ændringer i celler, som påvirker kapaciteten af ​​cytotoksiske lægemidler til at dræbe celler, herunder ændringer i cellecyklus, forbedret DNA-reparation aktivitet, defekt apoptose pathway, ændret metabolisme af narkotika osv; sekunder, øget energi-afhængig udstrømning af hydrofobe stoffer, repræsenteret ved overekspression af en familie af energi-afhængige transportører, kendt som ATP-bindende kassette transportører, såsom P-glycoprotein (P-gp) [30]. ERCC1 (excision reparation cross-komplementering gruppe 1) er en begrænsende faktor i nukleotid excision reparation, fjerner DNA addukter og reparationer DNA dobbelt-strenget pauser [31], [32]. Høje niveauer af ERCC1 er korreleret med resistens over for cisplatin kemoterapi hos patienter med NSCLC [33], [34]. P-gp var den først opdagede humane ABC transporter, og blev kodet af MDR1-genet [35]. P-gp er en af ​​de klinisk vigtige transmembrane transportører og spiller en vigtig rolle i resistens. At identificere den underliggende mekanisme af resistens over vores celler, vi yderligere udforsket ERCC1 og p-gp proteiner i de transficerede celler, og vi fandt, at ERCC1 blev signifikant reduceret i klotho transficerede celler sammenlignet med de negative kontroller, imidlertid ingen signifikant forskelle blev set i ekspressionen af ​​p-gp. Disse resultater viste, at klotho påvirket resistensen af ​​lungecancerceller for cisplatin, som var forbundet med PI3K /Akt-signalvejen. Endvidere klotho kunne modulere reparation aktivitet af DNA gennem regulering af ERCC1, derefter ændre modstanden i kræftceller. I den foreliggende undersøgelse dybt at undersøge rollen af ​​Akt i resistensen af ​​cellerne, fandt vi, at Akt inhibering med dens specifikke inhibitor (LY294002) reducerede den forhøjede IC50 følgende klotho shRNA transfektion ledsaget af reduktion af p-Akt ekspression. For at identificere resultaterne

in vitro

, vi udførte en

in vivo

eksperiment i nøgne mus. Vi fandt, at den formindskede antitumorvirkning

in vivo

var forbundet med inhiberingen af ​​klotho udtryk og den aktiverede PI3K /Akt pathway. Disse resultater bekræftede, at klotho, en anti-aging gen, kunne afhjælpe modstand A549DDP og H460DDP til cisplatin ved at hæmme Akt signal pathway.

Reguleringen af ​​apoptose er kompliceret og en række gener, der er involveret i denne proces, herunder Bax /bcl-2, celle-regulerende proteiner, etc [36]. Vores undersøgelse viste, at forholdet mellem Bax /bcl-2 blev forøget dramatisk efter klotho over-ekspression i cisplatin-resistente celler, mens klotho knockdown faldt dette forhold ledsaget af inhibering af Akt signalvej. Dette var i overensstemmelse med udviklingen i p-Akt udtryk og IC50. Vi har detekteret at apoptose af cellerne, og vores resultater viste klotho spillet en central rolle i apoptose af kemoterapi-resistente celler: stigning i klotho udtryk blev tæt knyttet til flere apoptotiske.