PLoS ONE: Antioxidanter ophæver Alpha-Tocopherylquinone-medieret nedregulering af Androgen receptor i Androgen-Responsive prostatacancerceller

abstrakt

Tocopherylquinone (TQ), oxidationsproduktet af alfa-tocopherol (AT), er et bioaktivt molekyle med distinkte egenskaber fra AT. I denne undersøgelse er AT og TQ undersøgt for deres komparative virkninger på vækst og androgen aktivitet i prostata kræftceller. TQ hæmmede potent væksten af ​​androgen-responsiv prostatacancer cellelinier (fx LAPC4 og LNCaP celler), mens væksten i androgen-uafhængige prostatacancerceller (fx DU145 celler) blev ikke påvirket af TQ. På grund af de væksthæmmende effekter induceret af TQ på androgen-responsive celler blev de anti-androgene egenskaber TQ undersøgt. TQ inhiberede androgen-induceret aktivering af en androgen-responsiv reporter og inhiberede frigivelsen af ​​prostataspecifikt antigen fra LNCaP-celler. TQ forbehandling viste sig også at inhibere AR aktivering som målt ved anvendelse af multifunktionelle Androgen receptor screeningsassayet. Desuden TQ nedsat androgen-responsiv genekspression, herunder TM4SF1, KLK2, og PSA over 5 gange, mens AT ikke påvirkede ekspressionen af ​​androgen-responsive gener. Af betydning blev de antiandrogene effekter af TQ på prostata kræftceller fundet at skyldes androgen receptor protein nedregulering produceret af TQ, der ikke blev observeret med AT behandling. Desuden er ingen af ​​de androgene endpoints vurderede var påvirket af AT. Nedreguleringen af ​​androgen receptor protein ved TQ blev ophævet ved samtidig behandling med antioxidanter. Samlet blev de biologiske virkninger af TQ fundet at være forskellig fra AT, hvor TQ viste sig at være en potent inhibitor af cellevækst og androgen aktivitet i androgen-responsive prostata cancerceller

Henvisning:. Fajardo AM, MacKenzie DA, Olguín SL, Scariano JK, Rabinowitz i, Thompson TA (2016) Antioxidanter ophæver Alpha-Tocopherylquinone-medieret nedregulering af Androgen receptor i Androgen-Responsive prostatacancerceller. PLoS ONE 11 (3): e0151525. doi: 10,1371 /journal.pone.0151525

Redaktør: Lucia R. Languino, Thomas Jefferson University, UNITED STATES

Modtaget: Oktober 21, 2015; Accepteret: 28 Februar 2016; Udgivet: Marts 17, 2016

Copyright: © 2016 Fajardo et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. der blev leveret af National Institutes of Health Grant, give nummer: 1 R03 CA133941 (TAT) og University of New Mexico Cancer center Focus-Interactive Group Award (TAT og IR). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

rolle antioxidant handling i cancer udvikling og progression er uklar. Vitamin E er en familie af naturligt forekommende kostfaktorer (f.eks α-, β-, γ-, δ-tocopheroler og tocotrienoler) med en større biologisk aktiv form anerkendt som RRR-α-tocopherol (RRR-AT) [1, 2]. α-tocopherol (AT) virker primært som en antioxidant, reducere cellulær oxidativ skade frembragt af oxiderede lipider [1,2]. Det oxidationsprodukt af AT er α-tocopherylquinone (TQ), der er dannet af de to-elektron oxidation af chromanol-delen af ​​AT (figur 1). TQ har forskellige kemiske egenskaber i forhold til AT med en unik spektrum af biomolekylære aktioner [3]. For eksempel har TQ vist sig at hæmme væksten af ​​colon cancerceller, mens AT ikke blev observeret til at ændre væksten af ​​disse celler [4]. Selvom TQ etableres som en bioaktiv quinon for nogle kræftformer, sin indsats om prostatakræft cellevækst og androgene veje i prostatacancerceller er ukendte.

AR er en nødvendig bidragyder til udvikling prostatakræft og er anerkendt som en meningsfuld mål for forebyggelse og behandling af prostatacancer [5]. Dette understøttes af betydningen af ​​AR i prostatacancer progression [6-8] og af resultatet af undersøgelser under anvendelse inhibitorer af testosteron metabolisme at forhindre prostatakræft udvikling [8,9]. AR er medlem af steroidhormon /nuklear receptor superfamilien [10], der virker som en ligand-aktiveret transkriptionsfaktor for gener involveret i vækst, overlevelse og differentiering af prostata [11]. Desuden AR aktivitet bidrager til udvikling, progression, og vedligeholdelse af prostatacancer [7,12]. Klinisk nedregulering af AR aktivering opnås gennem en række midler, der omfatter direkte indgreb af androgen binding til AR som med AR-antagonister, ved at nedsætte dihydrotestosteron produktion med 5-alfa-reduktase-inhibitorer, eller ved at reducere produktionen af ​​testosteron ved gonadotropin-releasing hormon agonister og CYP17A1 hæmmere [7,12,13]. Disse strategier ikke direkte rettet mod ekspression af AR protein og dermed under disse indgreb, AR forbliver funktionelt.

Oplysninger om de biologiske virkninger af TQ er begrænset i forhold til de mere omfattende undersøgelser på AT. Til dato er der ingen undersøgelser der undersøger effekten af ​​TQ på cellevækst og androgen aktivitet i prostata kræftceller. Imidlertid modulering af AR-aktivitet ved AT-relaterede midler er blevet rapporteret. Mekanismen af ​​androgen hæmning af disse kemikalier kan være direkte eller indirekte. For eksempel har vi tidligere vist, at chromanol del med ved blokke androgen aktivitet ved kompetitiv inhibering af androgen binding til AR [14]. Direkte inhibering af AR er blevet observeret med AT succinat, et mere vandopløseligt esterderivat af AT, som har vist sig at nedregulere AR protein i androgen-responsive prostata cancerceller [15]. Fordi på analoger og derivater har vist biologisk indsats mod prostata kræftceller, mens handlinger oxidation produkt af AT i prostatakræft er ukendte, vi havde til formål at afgøre, om TQ besad enestående biologiske handling i prostata kræftceller. I denne undersøgelse blev virkningerne af både AT og TQ om prostatacancer celleproliferation, anti-androgen aktivitet, og potentiel mekanisme af AR protein nedregulering evalueret. I forhold til AT, blev TQ sig at have særlige egenskaber på androgen-responsiv prostatakræft-cellelinier med bemærkelsesværdige handlinger på ekspressionen af ​​AR. Antioxidanter fandtes at modificere virkningerne af TQ på disse celler. Denne undersøgelse begynder at belyse mekanismen i TK på at hæmme AR protein udtryk, der kan være gennem sin aktivitet til at ændre redox tilstand i prostata kræftceller.

Resultater

Hæmning af celleproliferation i androgen- følsomme prostata cancer cellelinjer ved TQ

Tidligere undersøgelser har vist, at ester-konjugeret, vandopløselige VE analoger (fx vitamin E-succinat) kan inhibere prostatakræft cellevækst i kultur [15,16]. På grund af bekymringer vedrørende produktionen af ​​de fysiologisk aktive frie former for AT og TQ fra de konjugerede former, blev ukonjugerede, frie former af disse stoffer undersøgt. Som de frie former af AT og TQ har lav vandopløselighed, blev en bærer-baserede levering metode udviklet til at administrere de frie former af disse midler i cellekultur, som beskrevet i

Materialer og fremgangsmåder

. AT behandling havde minimal effekt på væksten af ​​androgen-følsomme LAPC4 og LNCaP celler samt androgen-uafhængige DU145 prostatacancerceller efter behandling med koncentrationer på op til 40 pM (Fig 2A). I modsætning hertil TQ behandling producerede en dosisafhængig vækst fald i androgen-responsive LAPC4 og LNCaP prostatacancerceller, mens væksten af ​​DU145 celler ikke var påvirket af TQ i doser på op til 40 pM (Fig 2B). I en mere løst dosis-respons med LAPC4 celler, EF

50 i TQ til inhibering af cellevækst viste sig at være 8,2 uM (fig 2C). Tilsvarende i fokus danner analyse af LNCaP cellevækst, blev TQ sig at hæmme dannelsen fokus, mens AT ikke påvirkede fokus dannelse (figur 2D). For at bestemme om inhiberingen af ​​cellevækst med TQ var delvis skyldes virkninger på cellelevedygtighed, blev DU145, LAPC4 og LNCaP cellelevedygtighed målt ved hæmocytometriske og trypanblåteksklusion. Levedygtigheden af ​​celler behandlet med 5, 10 og 25 uM TQ sig ikke fra vehikelbehandlede celler (Fig 2e). Desuden er en flowcytometrisk-baserede propidiumiodid udelukkelse analyse af LNCaP-celler viste 92,4% (± 1,4%) levedygtighed i vehikelbehandlede kontroller og 93,2% (± 1,2%) for 25 uM TQ-behandlede LNCaP-celler. For DU145 celler, 94,7% (± 1,0%) blev observeret levedygtighed i bærerbehandlede kontroller og 94,4% (± 1,3%) for 25 uM TK-behandlede celler ved propidiumiodid udelukkelse, yderligere underbygger, at TQ ikke akut påvirker cellulær levedygtighed på doser på op til 25 uM. LNCaP-celler behandlet med enten 10 eller 25 uM TQ viste øget antal celler i G1-fasen med en samtidig reduktion af S-fase celler (fig 2F). Disse data understøtter, at TQ inhiberer androgen-sensitive prostatacancer celleproliferation gennem en G1 standsning ved doser, der ikke nedsætter levedygtigheden af ​​disse celler.

A-F. TQ-medieret inhibering af celleproliferation, men ikke levedygtighed, i prostata cancercellelinier. (A) AT vækstanalyse i androgen-sensitive LAPC4 og LNCaP-celler og androgen-uafhængige DU145 prostatacancerceller. (B) Dosis-respons af DU145, LAPC4, og LNCaP-cellevækst i celler behandlet med TQ i 4 dage. (C) TQ EF

50 beslutsomhed for LAPC4 cellevækst. (D) Bestemmelse af LNCaP vækst foci efter behandling med enten 10 uM AT eller 10 uM TQ i 5 d. (E) Levedygtighed analyse i DU145, LAPC4 og LNCaP-celler ved 5, 10 og 25 uM TQ i 48 timer med nogen nedgang i cellelevedygtighed. (F) Cellecyklusanalyse (dvs. DNA-indhold) i LNCaP-celler behandlet med 10 og 25 uM TQ viser en G1 arrest. *

P

. 0,05

TQ, ikke AT, behandling nedsætter AR aktivitet og AR reguleret mRNA transkriptniveauer

Undersøgelser for at afgøre, om TQ eller AT moduleret AR-aktivitet blev initieret ved anvendelse af en androgen-sensitive luciferase reporter system. Til denne undersøgelse blev androgen-sensitive reporteraktivitet stimuleret anvendelse af det syntetiske androgen R1881 og blev vurderet efter behandling med enten 30 uM TQ eller AT (figur 3A). TQ behandling alene ikke modulere reporter aktivitet. I modsætning hertil blev TQ fundet signifikant at hæmme R1881-inducerede reporter aktivering efter 2 d sammenlignet med R1881-stimulerede kontrolceller. Overraskende, 30 pM AT behandling øget androgen-følsomme reporter aktivitet (figur 3A). Disse data understøtter en inhiberende rolle for TQ på AR-aktivitet i modsætning til AT, som ikke udviser antiandrogen aktivitet.

A-D. Inhibering af androgene reaktioner i LNCaP-celler ved TQ behandling. (A) Androgen-induceret [dvs. R1881 (R)] luciferase ekspression fra en androgen-sensitive promoter målt efter TQ eller AT behandling i 48 timer. Bicalutamid blev anvendt som en androgen-receptorantagonist. (B) PSA frigivelse blev stimuleret med 50 pM R1881 eksponering i LNCaP celler og målte 4 d efter TQ eller AT behandling. (C) PC3-celler co-transficeret med en androgen receptor ekspressionsvektor og et androgen-responsiv GFP reporter stimuleret med R1881. Celler behandlet med vehikel (venstre panel) og 25 uM TQ (højre panel) viser R1881-stimuleret, GFP-udtrykkende celler (pile) (se MARS assay i Materialer og fremgangsmåder). (D) Kvantificering af GFP-positive celler pr sammenlignet med kontrol, bærerbehandlede prøver i en dosis-respons af TQ fra 5 til 50 uM. *

P

. 0,05

Frigivelsen af ​​prostata specifikt antigen (PSA, KLK3) fra LNCaP celler er anerkendt som en følsom indikator for androgen respons i LNCaP celler [17] . For yderligere at undersøge TK virkninger på androgene veje blev androgen-stimuleret frigivelse af PSA fra LNCaP celler bestemmes. LNCaP-celler behandlet med TQ viste en dosisafhængig reduktion i R1881-inducerede PSA frigivelse sammenlignet med ubehandlede kontrolceller (fig 3B). I modsætning hertil behandling med 10 til 40 uM AT ikke påvirkede androgen-induceret PSA-frigivelse fra LNCaP-celler (figur 3B). Tvungen ekspression af androgenreceptoren i PC3-humane prostata celler til at vurdere aktivering af en androgen-responsiv grøn fluorescens reporter blev anvendt til at måle evnen hos TQ at inhibere androgen receptor aktivering. Kontrol, viste vehikelbehandlede celler omfattende androgen receptor aktivering efter stimulering med det syntetiske androgen R1881 (fig 3C [venstre panel] og fig 3D), hvorimod celler behandlet med 5, 10, viste 25 eller 50 uM TQ en signifikant reduktion i androgen receptor-aktivering af R1881 (fig 3C [højre panel] og figur 3D).

faldet i PSA frigivelse kan skyldes til dels nedregulering af

PSA

genekspression produceret af TQ ( tabel 1). Foruden

PSA

mRNA-niveauer, andre androgen-responsive gener blev målt efter TQ behandling. Som vist i tabel 1, mRNA-niveauer for AR-responsive gener

kallikrein 2

,

prostein

,

prostatasyrephosphatase

,

NKX3

.

1

og

prostataspecifikt membran-antigen

blev reduceret i LNCaP celler 4 d efter behandling med TQ. I modsætning til TQ, AT behandling ændrede ikke signifikant udtryk for androgen-følsomme mRNA (tabel 1).

nedregulering af AR protein niveauer i androgen-responsive prostata kræftceller ved TQ

for at bestemme virkningerne af aT og TQ på AR protein i androgen-responsive celler, blev udført immunoblotanalyse for AR protein. LNCaP og LAPC4 celler blev behandlet med vehikelkontrol, 25 uM TQ, eller 25 uM AT for 4 d (Fig 4A og 4B). For begge linier, celler behandlet med TQ viste en væsentlig reduktion af AR-protein i sammenligning med vehikelbehandlede kontroller, hvorimod AT viste ingen forskel i AR påvisning sammenlignet med kontroller (Fig 4A og 4B). For bedre at forstå dynamikken i AR nedregulering af TQ i prostatacancerceller, blev den cellulære AR lokalisering, dosis, og tid, der kræves for TK effekter i LAPC4 og LNCaP celler bestemmes. En dosis-respons på 4, viste 12,5 eller 25 uM TQ i LNCaP-celler reducerede AR proteinniveauer med 25 pM efter 4 d (Fig 4C). Svarende til LNCaP-celler, TQ signifikant inhiberede AR proteinniveauer i LAPC4 celler behandlet med 25 pM TQ i 24, 48, 72, og 96 h (Fig 4D). Immuncytokemisk farvning af AR i LNCaP-celler viste signifikant kernelokalisering af AR (Fig 4E), hvorimod celler behandlet med 25 pM TQ i 4 dage viste intakte celler med en signifikant reduktion i niveauerne af AR proteinfarvning (fig 4F). Tilsammen viser disse resultater, at TQ, men ikke AT, har potente antiandrogene effekter på androgen-responsiv prostatacancer cellelinjer.

A-F. Cellulær lokalisering, dosis-respons, og tidsforløbet for TQ-induceret AR protein nedregulering i AR-udtrykkende prostatacancerceller. AR proteinniveauer bestemt ved immunoblot i LNCaP (A) og LAPC4 (B) celler behandlet med 25 pM TQ eller 25 pM AT i 4 dage. (C) TQ dosisafhængig reduktion i AR proteinniveauer i LNCaP-celler behandlet med 4, 12,5 eller 25 uM TQ i 4 dage. (D) Immunoblot af tidsafhængige ændringer i AR proteinniveauer fra LAPC4 celler behandlet med 25 pM TQ i 24, 48, 72 og 96 timer. Kvantitetsbestemte AR protein niveauer præsenteres nedenfor hver immunoblot (*

P

0,05). (Ef) LNCaP celler blev behandlet med køretøj kontrol (E) eller 25 uM TQ (F) i 4 d og AR proteinekspression blev opdaget af immunocytokemi.

Bestemmelse af

AR

mRNA nedregulering af TQ og AT

Vi evalueres yderligere TQ nedregulering af

AR

mRNA og demonstrere denne handling var forskellig fra AT.

AR

mRNA ekspression efter TQ behandling i 24, blev 48, 72 og 96 timer i LNCaP-celler bestemmes viser et signifikant fald i

AR

mRNA efter 96 timer (fig 5A). Således blev ekspressionsniveauerne af

AR

mRNA i LAPC4 celler og yderligere mRNA målt efter behandling med 25 pM TQ eller AT for 4 d.

AR

mRNA niveauer blev reduceret 1,7 gange efter behandling med 25 pM TQ i LAPC4 celler (Fig 5B). Bemærk, at reduktioner i AR protein niveauer (Fig 4D) blev observeret at ske før den observeret i

AR

mRNA reduktion. Selv en betydelig reduktion af

AR

mRNA blev set ved 4 d på TQ behandling i både LNCaP og LAPC4 celler, ved sammenligning med den relative nedregulering af

AR

mRNA ved 4 d , AR protein blev inhiberet mere markant i matchede prøver (data ikke vist), hvilket antyder, at TQ nedregulering af AR protein ekspression kan være, i det mindste delvist uafhængigt af transkriptionel inhibering af

AR

mRNA-ekspression. TQ også signifikant nedsat

FOXA1

mRNA ekspressionsniveauer (Fig 5C). Det er bemærkelsesværdigt, at AT ikke påvirkede

AR

eller

FOXA1

niveauer mRNA-niveauer efter 4 d (Fig 5A, 5B og 5C). Men mRNA nedregulering var ikke en åbenlys handling af TQ som

retinoid X receptor

,

alpha

(

RXRa

) mRNA niveauer blev ikke ændret ved TQ i LNCaP celler (fig 5D). Selvom AT behandling ikke påvirkede mRNA niveauer af androgen-responsive gener vurderede, AT produceret en reduktion i

RXRa

mRNA-niveauer (Fig 5D) 20%, hvilket giver yderligere støtte til forskellige virkninger af AT og TQ på prostata kræftceller.

AD. Ekspression af transkriptionsfaktor-mRNA’er i TQ-behandlede LNCaP og LAPC4 celler. (A) Tidsforløb analyse af AR mRNA-niveauer i TQ behandlede LNCaP celler i forhold til AR mRNA-niveauer i kontrol, vehikelbehandlede LNCaP celler. (B) mRNA-niveauer i LAPC4 celler behandlet for 4 d med 25 pM TQ eller 25 uM AT sammenlignet med kontrol, vehikelbehandlede celler. Niveauer af

Foxa

1 mRNA (C) og

RXR

α mRNA (D) i LNCaP celler behandlet for 4 d med 25 pM TQ eller 25 uM AT sammenlignet med kontrolgruppen. *

P

. 0,05

AR protein nedregulering af TQ blev ophævet af antioxidanter

De antioxidanter N-acetylcystein (NAC) og AT blev brugt at afgøre, om en potentiel mekanisme af TQ s nedregulering af AR-proteinekspression påvirkes af antioxidant behandling. LNCaP-celler blev forbehandlet med 5 mM NAC eller 25 pM AT i 24 timer og efterfølgende behandlet med 25 pM TQ med eller uden AT (Fig 6A) og NAC (Fig 6B) i 48 timer. TQ-medieret nedregulering af AR-protein viste sig at være signifikant svækket ved tilstedeværelsen af ​​antioxidanter, understøtter denne TQ kan nedregulere AR protein gennem veje, der er følsomme over for virkningen af ​​disse antioxidanter.

AB . Hæmning af TQ-medieret AR protein nedregulering af antioxidanter AT og NAC i LNCaP celler. (A) Immunoblotanalyse af AR proteinekspression i celler forbehandlet i 24 timer med 25 pM AT og derefter behandlet med 25 pM TQ i nærvær eller fravær af 25 uM AT i yderligere 48 timer. (B) Immunoblotanalyse af AR proteinniveauer i celler forbehandlet i 24 timer med 5 mM NAC og derefter behandlet med 25 pM TQ i nærvær eller fravær af 5 mM NAC i 48 timer. (*

P

0,05 sammenlignet med kontrol; #

P

0,05 sammenlignet med TQ-behandlede AR protein niveauer)

Diskussion

.

De biologiske virkninger af AT er blevet undersøgt i udstrakt grad. I modsætning hertil er langt mindre kendt AT s oxidation produkt, TQ. Her blev nedregulering af androgen aktivitet ved TQ undersøgt med konstateringen af, at denne aktivitet var afhængig af TQ aktivitet som en pro-oxidant. AT påvirkede ikke signifikant enten væksten af ​​prostatacancerceller eller veje, der vides at være kritisk i prostatakræft progression i forhold til TQ. Denne undersøgelse begynder at identificere hidtil ukendte anti-androgen aktivitet af TQ og demonstrerer den differentielle aktivitet af AT og TQ i humane prostatacancerceller. TQ inhiberede signifikant androgen-responsiv prostatacancer celleproliferation, AR-aktivitet, og AR proteinekspression. TQ viste sig at nedregulere AR proteinekspression i både en tids- og dosisafhængig måde gennem en mekanisme, der involverer ændringer i cellulær redox. Vi endvidere vist, at TQ nedregulering af AR protein blev svækket af antioxidanter NAC og AT. Evnen af ​​disse forskellige antioxidanter at ophæve handlinger TQ på AR protein i prostata kræftceller er i fokus for fremtidige undersøgelser. Generelt blev en hidtil ukendt sag om TQ fundet i nedregulering af androgen aktivitet i humane prostatacancerceller.

I denne undersøgelse hverken væksten af ​​prostatacancerceller eller de veje, der vides at være kritisk i prostatacancer progression, der blev sammenlignet, blev ramt af aT, mens TQ kraftigt hæmmede væksten af ​​androgen-følsomme prostata kræftceller. Faldet i cellevæksten produceret af TQ behandling kan være AR-afhængig som TQ behandling ikke havde en udtalt virkning på væksten af ​​androgen-uafhængige DU145 human prostatacancer-cellelinie. Vigtigere er det, TQ, men ikke AT, viste sig at reducere både

AR

mRNA og AR protein niveauer i prostata kræftceller med en samtidig reduktion i androgen veje. Flere undersøgelser har vist, at nedregulering af AR resulterer i nedsat celleproliferation i androgensensitive prostatacancerceller. For eksempel faldt AR ekspression blev opnået i LNCaP humane prostatacancerceller hjælp siRNA resulterer i et fald i LNCaP vækst [18,19]. Således kan nedgangen i cellevæksten produceret af TQ i androgen-sensitive prostatacancer-cellelinier skyldes i det mindste delvist for virkningen af ​​TQ at nedregulere AR ekspression.

AR er en vævsspecifik , ligand-aktiverede transkriptionsfaktor, der er kendt for at regulere ekspressionen af ​​gener, såsom

transmembrane 4 L seks familiemedlem 1

,

PSA

,

kallikrein 2

,

prostein

,

prostatasyrephosphatase

,

NKX3

.

1

, og

prostataspecifikt membran-antigen

i prostata celler [20-24 ]. Fordi AR spiller en central rolle i opretholdelsen af ​​ekspressionen af ​​disse gener, ville deres ekspression reduceres ved indgreb, der nedregulerer AR. Faktisk blev ekspressionen af ​​flere af disse gener reduceret efter behandling af LNCaP-celler med TQ. Endvidere blev ekspression fra en androgen-sensitive reporter inhiberet af samtidige androgen og TQ behandling. I modsætning hertil på havde minimale virkninger på modulationen af ​​androgen-responsive gener eller genprodukter. Den reducerede udtryk for AR-responsive gener fremkaldt af TQ behandling støtter kraftigt, at AR er et vigtigt mål for TQ i prostata kræftceller.

AR er anerkendt som en vigtig bidragyder til alle stadier af prostatakræft fra carcinogenese til kastrationsresistent sygdom [7,12,25,26]. Hidtil har de fleste indgreb mod prostatacancer reducere AR aktivering via inhibering af produktionen af ​​androgene ligander, såsom testosteron eller dihydrotestosteron. Disse strategier påvirker ikke AR selv. For at modulere AR aktivitet, er det nødvendigt at identificere tiltag, der er målrettet nedregulering af AR udtryk. Her viser vi, at der kan opnås nedregulering af AR-protein og mRNA under anvendelse af TQ med en udtalt virkning på androgen aktivitet i prostatacancerceller. Det er bemærkelsesværdigt, at AT ikke inhiberede enten AR ekspression eller aktivitet i prostatacancerceller. Dette er vigtigt, da dette er den form for AT, der forventes at være fysiologisk aktive i modsætning til ester konjugerede former, såsom vitamin E-succinat, der er angiveligt omdannes til a-tocopherol ved indvirkning af esteraser i celler og i kroppen.

Selvom aT ikke udviste anti-androgene egenskaber inden vores system, har E-vitamin (VE) analoger blevet rapporteret at påvirke AR proteinekspression i prostata kræftceller. For eksempel, Zhang et al. [16] rapporterede, at VE analogen, VE succinat, reducerer AR-aktivitet i androgen-sensitive humane prostatacancerceller. Svarende til TQ, VE succinat behandling viste sig at mindske både AR mRNA og protein niveauer i LNCaP-celler [16]. Af betydning, Zhang et al. [16] fandt, at i det mindste en del af VE succinat indsats skyldes et fald i AR oversættelse. Vores laboratorium har tidligere rapporteret på den anti-androgen aktivitet af anden VE analog, 2,2,5,7,8-pentamethyl-6-chromonol (PMCol) [14]. Denne antioxidant-delen af ​​AT, PMCol, består af det chromonal ringstruktur af AT men mangler phytyl kæden. Vi viste, at PMCol inhiberede proliferationen af ​​androgen-sensitive prostatacancerceller fungerer som en kompetitiv inhibitor af AR ligandbinding og at PMCol inhiberer AR-aktivering [14]. Desværre fik PMCol ikke hæmme AR udtryk. Derfor begrænsninger VE analoger kan nævnes manglende metabolisk omdannelse til AT og dermed TQ, eller mangel på AR protein nedregulering.

Identifikation mekanismen i TQ anti-androgen aktivitet og selektiv inhibering af AR proteinekspression kan give indsigt i nye AR reguleringsmekanismer. Fordi TQ havde udtalt inhiberende virkning på markører for AR aktivitet, blev AR i androgen-sensitive prostatacancercellelinjer undersøgt. Både AR-protein og mRNA blev fundet at blive reduceret med TQ behandling i både LAPC4 og LNCaP humane prostatacancerceller. Der var dog signifikant reduktion af AR protein udtryk, der gik forud for hæmning af AR mRNA-ekspression, som viser, at TK handlinger på AR nedregulering måske ikke helt på grund af hæmning af AR mRNA-ekspression. Interessant,

FOXA1

mRNA blev også reduceret med TQ behandling. FOXA1 er anerkendt som en potent bidragyder til androgen aktivitet for prostata gener [27]. Men nedregulering af mRNA-ekspression ikke var en åbenlys handling af TQ-aktivitet. For eksempel,

RXRa

mRNA-ekspression ikke viste sig at være påvirket af TQ behandling.

De handlinger AT som en foranstaltning til at lindre prostatakræft er kontroversielle. På grund af uoverensstemmelser mellem epidemiologiske undersøgelser vedrørende AT-aktivitet for prostatakræft, bør alternative forklaringer på resultaterne af disse undersøgelser blive udforsket. For eksempel rygning var en stor uoverensstemmelse mellem deltagerne i Alpha-Tocopherol, beta-caroten Cancer Prevention (ATBC) forsøg [28], som er indskrevet storrygere, og Cancer Prevention Trial på selen og E-vitamin (SELECT) [29] , som indskrevet meste ikke-rygere. Dette er spændende, når man overvejer de prostatakræft forebyggende handlinger supplerende på, når taget af mænd, der ryger som ses mellem disse to undersøgelser. For eksempel i ATBC studie blev en reduktion på 32% i prostatakræft incidens og 41% reduktion i dødelighed observeret blandt rygere tage supplerende AT sammenlignet med kontrolgrupper [30]. I Harvard Health Professionals undersøgelse blev ingen effekt af supplerende AT alene findes på prostatakræft forekomst; men det blev rapporteret, at “blandt nuværende rygere og seneste quitters, dem, der forbruges mindst 100 IE supplerende AT pr dag havde en relativ risiko på 0,44 for metastatisk eller dødelig prostatakræft” [31]. Yderligere undersøgelser har fundet nogen effekt af supplerende AT når det tages alene, men gjorde rapportere en reduktion i udviklingen af ​​prostatakræft blandt rygere tager VE kosttilskud [28,32,33]. I modsætning til disse rapporter har en nylig undersøgelse viste, at AT selv kan have aktivitet mod udviklingen af ​​fremskreden prostatacancer [34]. Disse finde konflikt med resultaterne fra SELECT, der har undladt at finde prostatakræft forebyggende handlinger supplerende AT [29,35]. Således flere undersøgelser til dato tyder på, at AT selv kan ikke være en effektiv indgriben mod prostatakræft. Støtter disse resultater, har resultaterne fra den aktuelle undersøgelse ikke finde væsentlig indvirkning på prostatacancerceller af AT. Vi har imidlertid fundet, at TQ, den oxidationsprodukt af AT, er yderst effektiv til at reducere både vækst og androgen aktivitet i prostata cancercellelinier. Det er spændende at overveje at TQ kan være den aktive derivat af AT involveret i forebyggelse af prostatakræft blandt storrygere tager supplerende VE, som besidder en fysiologisk oxidativ stress effektivt kan omdanne AT til TQ. Resultaterne fra den aktuelle undersøgelse støtter kraftigt yderligere undersøgelser for at fastlægge effekten af ​​TQ som modalitet til forebyggelse af prostatacancer.

Den forhøjede detektion af TK niveauer om på tilskud og øget oxidativ stress er blevet påvist i dyremodeller. For eksempel Wurzel, H et al. [36] gennemført en

in vivo

undersøgelse, som udsatte rotter for kronisk cigaretrøg og AT i 65 uger. I forsøgsgruppen, fandt de høje niveauer af TQ i bronkoalveolærvaskevæsken demonstrerer, at røg-eksponerede dyr genereret en større mængde oxidative produkter [36]. Påvisning af TQ i mennesker er blevet rapporteret i en sammenlignende undersøgelse af voksne pulmonale patienter rutinemæssigt som modtager iltbehandling [37]. Omdannelsen af ​​AT i TQ under oxidative fornærmelse kunne være en potentiel forklaring på uoverensstemmelsen observeret mellem de forebyggende undersøgelser nævnt tidligere.

Rapporter om de biologiske virkninger af TQ er begrænsede. Dette kan skyldes til dels, at TQ betragtes blot som et produkt af AT oxidation med begrænset iboende biologisk aktivitet. Men TQ er kemisk forskellige fra AT og kan derfor have unikke biologiske virkninger i forhold til AT. De forskellige biologiske virkninger af TQ og AT kraftigt støttet af resultater på selektiv AR nedregulering af TQ observeret i den aktuelle undersøgelse. En fysiologisk virkning forbundet med TQ er antikoagulerende aktivitet [38]. Dette er ikke overraskende i, at quinon og phytyl kædestruktur af TQ minder med den for vitamin K, et kritisk vitamin er involveret i blodkoagulation. I almindelighed kemikalier besidder quinon strukturer sig at være toksisk. Dette skyldes i høj grad af tilstedeværelsen af ​​elektrofile carbon centre til stede i quinon struktur, der kan påvirkes af nukleofiler til stede i cellulære bestanddele [3]. I den aktuelle undersøgelse blev TQ ikke fundet at være meget cytotoksisk. Interessant er alle elektrofile steder i TQ blokeret af methyl substitutioner og således TQ ville forventes at være mindre reaktive end kemikalier med ublokerede quinon strukturer. Derudover TQ har vist sig at være en kraftig substrat for biotransformation enzym NQO1 [39]. Reduktionen af ​​TQ til hydroquinon ved NQO1 viste sig at være så effektiv det blev foreslået, at TQ kan være en af ​​de primære substrater for NQO1 biologiske aktivitet [39]. Resultater fra den aktuelle undersøgelse og andre stærkt støtter, at TQ har potente biologiske handlinger, der er adskilt fra AT. Vigtigt er TQ s nedregulering AR proteinekspression i humane prostatacancerceller medieret af ændringer i cellulær oxidativ stress, der kan ophæves ved antioxidanter.

Materialer og metoder

Kemikalier, cellekultur og