PLoS ONE: Enterococcus faecalis Infektion forårsager betændelse, Intracellulære Oxphos-Uafhængig ROS Produktion, og DNA-skader i Human Gastric Cancer Cells

Abstrakt

Baggrund

aklorhydri forårsaget af f.eks atrofisk gastritis muliggør bakteriel overvækst, som inducerer kronisk inflammation og beskadigelse af slimhindeceller inficerede individer køre gastriske maligniteter og cancer.

Enterococcus faecalis

(

E. Faecalis

) kan kolonisere achlohydric maver og vi ønskede derfor at undersøge virkningen af ​​

E. faecalis

infektion på inflammatorisk respons, reaktive ilt arter (ROS) dannelse, mitokondrie åndedræt, og mitokondrie genetiske stabilitet i gastriske slimhindeceller.

Metoder

For at adskille forandringer som følge af bakterier fra de af de inflammatoriske celler vi etableret en

in vitro E. faecalis

infektion model systemet ved hjælp af gastrisk karcinom cellelinje MKN74. Total ROS og superoxid blev målt ved fluorescensmikroskopi. Cellular iltforbrug blev karakteriseret non-invasivt ved hjælp XF24 mikroplade baseret respirometri. Genekspression blev undersøgt ved microarray, og respons veje blev identificeret ved Gene Set Analysis (GSA). Udvalgte gen-transkripter blev verificeret ved kvantitativ real-time polymerasekædereaktion (QRT-PCR). Mitokondrie mutationer blev bestemt ved sekventering.

Resultater

Infektion af MKN74 celler med

E. faecalis

induceret intracellulær ROS produktion gennem en vej uafhængig af oxidativ fosforylering (oxphos). Desuden

E. faecalis

infektion induceret mitokondrie-DNA ustabilitet. Efter infektion, gener, der koder for inflammatoriske respons proteiner transkriptionelt opreguleret mens DNA skader reparation og cellecyklus kontrol gener nedreguleret. Cellevækst bremset når inficeret med levedygtige

E. faecalis

og svarede i en dosisafhængig måde til

E. faecalis

lysat.

Konklusioner

Infektion med

E. faecalis

inducerede en oxphos-uafhængig intracellulære ROS respons og beskadigede den mitokondrielle genom i gastrisk cellekultur. Endelig bakterierne inducerede en NF-KB inflammatorisk respons samt nedsat DNA-skade respons og cellecykluskontrol genekspression.

Transcript profilering

Array Express tiltrædelse nummer E-MEXP-3496.

Henvisning: Strickertsson JAB, Desler C, Martin-Bertelsen T, Machado AMD, Wadstrøm T, Winther O, et al. (2013)

Enterococcus faecalis

Infektion forårsager betændelse, Intracellulær Oxphos-Uafhængig ROS Produktion, og DNA-skader i Human Gastrisk kræftceller. PLoS ONE 8 (4): e63147. doi: 10,1371 /journal.pone.0063147

Redaktør: Shree Ram Singh, National Cancer Institute, USA

Modtaget: August 28, 2012; Accepteret: April 2, 2013; Udgivet: 30 april, 2013 |

Copyright: © 2013 Strickertsson et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. AMDM er støttet af et fællesskab fra portugisisk Videnskab, Teknologi Foundation. LFH er støttet af det danske MRC. Jabs er støttet af den danske Kræftens Bekæmpelse, og Københavns Universitet SUND. TMB og OW er støttet af en bevilling fra Novo Nordisk Fonden til Bioinformatik Center. CD og LJR understøttes af Nordea-fonden. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

mavekræft er blandt de ti mest almindelige kræftformer, og med en global årlig dødelighed på ca. 700.000, det er den næsthyppigste årsag til kræft dødelighed [1]. Tarmens typen mavekræft udvikler gennem en række patologiske begivenheder startende med kronisk inflammation, atrofisk gastritis, intestinal metaplasi og endelig cancer [2].

Kronisk inflammation og cancer er blevet forbundet i flere undersøgelser af patienter og af genetisk modificerede mus, og menes at være involveret i patogenesen for ca. 25% af alle cancertilfælde verdensplan [2] – [4]. Karakteristik af cancer-relaterede inflammation omfatter tilstedeværelsen af ​​chemokiner og cytokiner i tumorvæv, der har potentiale til at stimulere tumor-celleproliferation og overlevelse af maligne celler [5], [6]. Kronisk betændelse favoriserer også en overproduktion af DNA skade reaktive ilt arter (ROS), hvis produktion kan være sekundært i forhold til oxidativ fosforylering (oxphos) reaktioner i mitokondrier (oxphos-afhængig) eller er fremstillet af uden for mitokondrierne oftest ved Nikotinamid dinukleotidphosphat ( NADPH) oxidaser (oxphos-uafhængige) (for gennemgang se [7] – [9]). Kronisk produktion af ROS årsag DNA-skader, hvilket tillader akkumulering af mutationer, som igen kan aktivere onkogener og /eller inaktivere tumorsuppressorgener derved øge risikoen for udvikling af kræft [3].

Den mest almindelige risikofaktor for udvikling af mavekræft er kronisk bakteriel infektion i maven med

Helicobacter pylori

(

H. pylori

) [10]. Kronisk infektion i maven ved

H. pylori

påvirke mavens pH balance og kan forårsage aklorhydri eller hyperchlorhydria [11]. Selv om denne bakterie er klassificeret som et klasse én carcinogen, er det ikke altid forbundet med en øget risiko for gastrisk cancerudvikling. Eksempelvis

H. pylori

inficerede patienter med sår på tolvfingertarmen og høje niveauer af mavesyre har en reduceret risiko for at udvikle gastrisk cancer i forhold til dem fra den almindelige befolkning [11] – [13]. I modsætning hertil patienter med atrofisk gastritis og reduceret mavesyresekretion har en øget risiko for at udvikle gastrisk cancer [11], [13], [14]. Den øgede risiko for kræft i achlorhydric individer kan skyldes bakteriel overvækst af andre bakterier i mavens lumen [15]. I begge achlorhydric mennesker og dyremodeller bakteriel overvækst forårsage kronisk gastritis, der udvikler sig til intestinal metaplasi og endelig gastrisk cancer [16] – [18]. Blandt de bakterier, der findes i maven af ​​achlorhydric mus

Enterococci

arter, som er gram-positive kokker i stand til at overleve i miljøer med et pH så lav som 4,5 [19], [20].

Enterococcus faecalis

(

E. Faecalis

) er et medlem af den humane kommensale mikrobiota og en af ​​de mest almindelige bakterier i mave-tarmkanalen [19]. På trods af dette,

E. faecalis

kan fungere som et humant patogen [21], og er blevet fundet i væsentligt forøgede antal i orale kræft og i humane coloncancerformer [22], [23]. I forbindelse med dette

E. faecalis

kan frembringe N-nitrosaminer og inducere genetiske ustabilitet i colon epitelceller gennem oxidativ beskadigelse af DNA’et [24], [25].

Gastritis er associeret med infiltration af immune celler i væv, hvilket gør det vanskeligt at dissekere virkningen af ​​immuncellerne fra de foring slimhindeceller

in vivo

. Vi brugte derfor et

in vitro

vævskultur model, der tillod os at undersøge, hvordan isolerede slimhindeceller reagerer på bakterier og de molekylære mekanismer, som tarmbakterier, såsom

E. faecalis

inducere skade i gastriske epitelceller. Ved hjælp af denne model, vi undersøgte effekten af ​​

E. faecalis

infektion af gastrisk adenocarcinom cellekulturer på ROS produktion, cellulær respiration, vækst, DNA-skader /reparation og inflammatoriske reaktioner.

Materialer og metoder

Cell Culture,

E. faecalis

, og vækstbetingelser

Menneskelig MKN74 gastrisk adenocarcinom cellekulturer fra den japanske Indsamling af Research Bioressourcer celle bank (JCRB # JCRB0255) blev opretholdt i RPMI 1640-medium (Invitrogen, Carlsbad, CA), suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) (Invitrogen), 100 pg /ml streptomycin og 100 U /ml penicillin (Invitrogen) ved 37 ° C, og 5% CO

2 fugtig atmosfære. Infektioner blev udført med

E. faecalis

stamme (ATCC 29212). Bakterier blev dyrket i 5% blodagarplader ved 37 ° C. Optisk densitet (OD) af bakterier dyrket i RPMI 1640-medium blev målt ved 550 nm på et UV-1601 spektrofotometer (Shimadzu, Kyoto, Japan) (figur S1).

E. faecalis

lysat blev udarbejdet af fryse /tø bakteriesuspensionen tre gange, mens sonikering suspensionen mellem hver cyklus.

Infektion af gastriske celler til RNA og DNA isolation

For 24 h infektioner blev 80% konfluente MKN74 celler vasket med PBS og inkuberet i antibiotisk medium. Overnatning dyrket kolonier af

E. faecalis

blev tilsat til MKN74 cellekulturen ved en infektionsmultiplicitet (MOI) på 50 bakterier per celle. 5 dages infektioner blev udført ved at behandle 65% sammenflydende MKN74 celler med

E. faecalis dele på en MOI på 10 eller med et lysat proteinkoncentration på 40 pg /pl. Hver 24 timer blev celler vasket med PBS og frisk medium og bakterier eller lysat blev tilsat. Kontrolceller blev behandlet på samme måde i fravær af bakterier eller bakterielysat.

In vitro Salg undersøgelser blev udført under anvendelse af en gastrisk cancercellelinie at teste den skadelige effekt af

E. faecalis

på gastrisk adenocarcinom celler. Disse celler adskiller sig fra normale gastriske epitelceller ved at flere kromosomafvigelser, men tilbyder den fordel, at en reproducerbar model system, på mange måder replikerer de begivenheder i maven. Sammenligning inficerede celler til ikke-inficerede celler giver et pålideligt billede af skader og ændringer i genekspression forårsaget af infektionen.

RNA og DNA isolation

Efter infektion, RNA og DNA blev ekstraheret ved at tilføje Trizol Reagent (Invitrogen) til hver dyrkningskolbe. RNA blev isoleret ifølge producentens protokol. DNA-holdige mellemfase blev udfældet ved tilsætning af 100% ethanol. Prøver blev centrifugeret ved 4 ° C, 3500 g i 6 min. Phenol-ethanol supernatant blev fjernet, og den resterende DNA-ekstraktion blev udført ved anvendelse af et NucleoSpin tissue kit (Macherey-Nagel, Duren, Tyskland). RNA- og DNA-koncentrationer blev målt på et NanoDrop ND-1000 spektrofotometer. RNA integritet numre blev målt på et 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, Californien) ifølge producentens protokol.

Måling af ROS og Superoxide

To dage før infektion 8 × 10

4 MKN74 celler blev udsået i hver brønd i en Lab-Tek

TM Chambered Coverglas (Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts). MKN74 celler blev farvet for to timer før infektion med 2-plex detektion mix. ROS og superoxid-farvning blev udført under anvendelse af ROS /RNS Detection Kit (Enzo Life Sciences, Farmingdale, New York) ifølge producentens instruktioner. MKN74 celler blev inficeret ved MOI på 50 i 30 minutter og analyseret under et Zeiss LSM 510 konfokalt mikroskop under anvendelse af LSM 510 software (Zeiss, Oberkochen, Tyskland). Ikke-inficerede farvede MKN74 celler blev anvendt som negative kontroller.

Lokalisering af

E. faecalis

under infektion

8 × 10

4 MKN74 celler /brønd blev podet i en 8-kammer glasbund objektglas (Thermo Fisher Scientific) 24 timer før farvning. For at identificere lokaliseringen af ​​

E. faecalis

efter infektion vi separat farves plasmamembranen med CellMask

TM Deep Red plasmamembranen pletten (C10046, Invitrogen) og den bakterielle cellevæg ved hjælp BacLight

TM Grøn bakteriel plet (B-35000, Molecular sonder, Invitrogen) i overensstemmelse med to protokoller henholdsvis. Cellerne og bakterier blev vasket 3 gange i PBS før infektion. Cellerne blev inficeret ved MOI på 100 i 4 timer og analyseret under et Zeiss LSK 510 konfokalt mikroskop under anvendelse af LSM 510 software (Zeiss). Dette eksperiment blev gentaget tre gange og 8 champers blev undersøgt hver gang.

XF24 Microplate baseret respirometri

respirometri af MKN74 celler blev udført ved hjælp af en XF24 Ekstracellulær Flux Analyzer (Seahorse Bioscience, North Billerica, MA ). Halvdelen af ​​de forgyldt MKN74 celler blev inficeret med

E. faecalis dele på en MOI på 50 for 4, 8 eller 24 timer, mens den anden halvdel blev efterladt inficerede. Efter inkubering blev bakterierne fjernet under anvendelse af 4% Penicillin /streptomycin (5 U /ml) og 4% cefotaxim (100 ug /ml) (ACS Dobfar Generics S.A., Luxembourg, Belgien). Celler blev inkuberet i en COZ

2 fri inkubator ved 37 ° C i 1 time for at tillade temperatur og pH ækvilibrering. Mikropladen med celler blev derefter sat ind i XF24 og forbruget på hver brønd oxygen blev målt over en periode på 100 minutter. Lægemidlerne oligomycin (0,5 uM), FCCP (0,3 uM) og antimycin A (2,0 uM) var igen tilsat til hver brønd. Flere detaljer er tilgængelige i File S1.

mitokondrie-DNA Ustabilitet

Hyppigheden af ​​mutationer i D-loop-regionen i mitokondrie-DNA, blev bestemt ved PCR-amplifikation under anvendelse af primerne C6-CA5 (tabel S1 ). De amplificerede fragmenter blev klonet ind i pCR2.1-vektoren (Invitrogen) og indsatser fra 328 kolonier blev amplificeret under anvendelse af VectorD-loop primere (tabel S1). De amplificerede fragmenter blev oprenset og sekventeret under anvendelse af ABI Prism BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit og en ABI Prism 3730 DNA Sequencer (Perkin-Elmer, Waltham, Massachusetts). For at bestemme mutationer blev sekvenserne brugt som forespørgsler mod Cambridge henvisningen sekvens opnået fra MitoMap (https://www.mitomap.org. Tilgænglig februar 9. 2012).

Microarray og GSA

RNA med en RNA-integritet antal 8 eller derover fra tre kontrol og tre infektion prøver til 24 timer (med levedygtig

E faecalis

eller med

E. faecalis

lysat 40 pg /pl.) og 5 dages eksperimenter blev indsendt til RH Microarray center på Rigshospitalet. RNA blev amplificeret og mærket med anvendelse 3’IVT Express kit (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA) ifølge fabrikantens instruktioner. 250 ng total RNA blev anvendt som input. De mærkede prøver blev hybridiseret til GeneChip Genome U133 plus 2 arrays (Affymetrix). Opstillingerne blev vasket og farvet med phycoerytrin konjugeret streptavidin under anvendelse af en Affymetrix Fluidik Station® 450, og arrayene blev scannet i en Affymetrix GeneArray® 2500 scanner til at generere fluorescerende billeder, som beskrevet i Affymetrix GeneChip® protokollen. 24 rå celle intensitet filer (CEL-filer) blev genereret i GeneChip® Command Console® Software (AGCC) (Affymetrix). De rå CEL-filer blev gjort offentligt tilgængelige på ArrayExpress med tiltrædelsen nummer E-MEXP-3496. Forbehandling af mikroarrays til gensæt analyse (GSA) blev udført med R /BioConductor [26], [