PLoS ONE: Aktivering af AMP-aktiveret protein kinase med 3,3′-diindolylmethane (DIM) er forbundet med menneskelige prostatakræft Celledød in vitro og in Vivo

Abstrakt

Der er en stor mængde videnskabelig tyder på, at 3,3′-diindolylmethane (DIM), en forbindelse afledt af fordøjelse af indol-3-carbinol, hvilket er rigeligt i korsblomstrede grøntsager, huser antitumoraktivitet

in vitro

in vivo

. Akkumulere tyder på, at AMP-aktiveret protein kinase (AMPK) spiller en væsentlig rolle i cellulær energi homeostase og tumor udvikling, og at målrette AMPK kan være et lovende behandlingsmulighed til kræftbehandling i klinikken. Vi har tidligere rapporteret, at en formuleret DIM (BR-DIM, herefter benævnt B-DIM) med højere biotilgængelighed var i stand til at inducere apoptose og inhibere cellevækst, angiogenese og invasion af prostatacancerceller. Men den præcise molekylære mekanisme (r) for de anti-cancer effekter af B-DIM er ikke blevet fuldt belyst. I den foreliggende undersøgelse undersøgte vi, om AMP-aktiveret protein kinase (AMPK) er et molekylært mål af B-DIM i humane prostatacancerceller. Vores resultater viste, for første gang, kan denne B-DIM aktivere AMPK signalvejen, der er forbundet med undertrykkelse af mammalian target of rapamycin (mTOR), nedregulering af androgen receptor (AR) ekspression og induktion af apoptose i både androgen-sensitive LNCaP og androgen-ufølsom C4-2B prostatacancerceller. B-DIM aktiverer også AMPK og nedregulerer AR i androgen-uafhængige C4-2B prostata tumorxenoplantater i SCID-mus. Disse resultater antyder, at B-DIM kunne anvendes som en potentiel anticancermiddel i klinikken til forebyggelse og /eller behandling af prostatacancer uanset androgen reaktionsevne, selv om der kan kræves funktionelle AR

Henvisning:. Chen D, Banerjee S, Cui QC, Kong D, Sarkar FH, Dou QP (2012) Aktivering af AMP-aktiveret protein kinase med 3,3′-diindolylmethane (DIM) er forbundet med menneskelige prostatakræft Cell Død

In vitro

og

In Vivo

. PLoS ONE 7 (10): e47186. doi: 10,1371 /journal.pone.0047186

Redaktør: Libing Song, Sun Yat-sen University Cancer Center, Kina

Modtaget: Marts 5, 2012; Accepteret: September 13, 2012; Udgivet: 9. oktober, 2012 |

Copyright: © Chen et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev delvist støttet af tilskud fra Karmanos Cancer Institute (til QPD) National Cancer Institute (1R01CA120009, 3R01CA120009-04S1 og 5R01CA127258-05, til QPD). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

AMP-aktiveret protein kinase (AMPK) udtrykkes i alle eukaryote celler og er en kritisk enzym, der spiller en væsentlig rolle i cellulær energi homeostase, samt kontrollerende processer relateret til tumorudvikling, herunder cellecyklusprogression, celle proliferation, proteinsyntese, og overlevelse. Derfor, som et anti-cancer-target, har AMPK modtaget intensiv opmærksomhed i de senere år. Mammal AMPK er en trimer serin /threoninproteinkinase bestående af en katalytisk α underenhed og to regulatoriske underenheder, β og γ. AMPK aktiveres gennem phosphorylering af Thr-172 på α subunit af en energi-nedbrydende stress, såsom øget forhold mellem AMP /ATP [1] og ADP /ATP [2], eller stimuleret af cellulære kinaser herunder lever kinase B1 (LKB1 ) [3] – [4] og calmodulin-afhængig proteinkinase kinase (CaMKK) [5]. Når den er aktiveret, AMPK spiller to vigtige funktioner, metaboliske og ikke-metaboliske. I reguleringen af ​​metaboliske proces, AMPK phosphorylerer serin dele i mange målproteiner og resulterer i tænding af kataboliske veje til at aktivere ATP-genererende processer, herunder optagelse og oxidation af glucose og fedtsyrer, og slukning af anabolske veje, herunder protein, fede syre- og kolesterol synteser, der forbruger ATP [6]. Vedrørende ikke-metaboliske funktioner af AMPK, kan aktivering af AMPK inducerer cellecyklusstandsning og inhibere celleproliferation og proteinsyntese i maligne celler via flere mekanismer, såsom akkumulering af tumor suppressor faktor p53 og cyclin-afhængige kinaseinhibitorer p21 og p27 [7 ], såvel som nedregulering af mTOR pathway [8] – [9]. Omfattende forskning understøtter rolle AMPK i forebyggelse og terapi af kræft, hvilket antyder, at målretning AMPK kan være en lovende mulighed for kræftbehandling.

Med henblik herpå metformin, et antidiabetisk lægemiddel, har vist sig at aktivere AMPK , hæve en hypotese om, at metformin kan reducere risikoen for cancer i patienter med type 2-diabetes ved aktivering af AMPK pathway [10]. Faktisk har rapporter fra kliniske studier vist, at diabetiske patienter behandlet med metformin havde en signifikant lavere kræft forekomster og kræft dødelighed sammenlignet med patienter udsat for andre anti-diabetisk medicin [10] – [12]. Prækliniske undersøgelser har også vist, at metformin ikke kun hæmmer væksten af ​​dyrkede kræftceller [13] -. [14] og tumorer i mus [15], men også selektivt fokuserer på cancer stamceller [16]

Udover metformin, nogle naturlige forbindelser, herunder quercetin, genistein [17], capsaicin, EGCG [18], og curcumin [19], har vist sig at have anticancer effekter i forbindelse med aktivering af AMPK signalvejen. Faktisk har naturlige produkter været den mest produktive kilde til leads til udvikling af anticancerlægemidler. Ifølge litteraturen, blev ca. 73% af lægemidler mod cancer opdaget fra naturlige oprindelse, eller stammer fra naturlige forbindelser i det sidste halve århundrede [20]. Den naturlige sammensatte indol-3-carbinol (I3C), som findes på relativt høje niveauer i korsblomstrede grøntsager som broccoli og kål, og dens dimer 3,3′-diindolylmethane (DIM) har vist anti-tumor aktivitet

i vitro

in vivo

[21] – [22]. For nylig rapporterede vi, at en formuleret DIM (BR-DIM, opnået fra biorespons Næringsstoffer, LLC., Boulder, Colorado, herefter forkortet som B-DIM), viste ca. 50% højere biotilgængelighed

in vivo

[23] sammenlignet med DIM. B-DIM induceret apoptose og hæmmede cellevækst, angiogenese og invasion af prostatacancerceller, som er forbundet med regulering af Akt, NF-KB, VEGF og AR signalveje [24] – [25]. Desuden har nylige resultater vist, at B-DIM behandling af prostatacancer celler

in vitro

eller B-DIM intervention i patienter med prostatacancer førte til den nukleare udelukkelse af AR associeret med aktivering af MIR-34a [24 ]. den præcise molekylære mekanisme (r), hvorved B-DIM spiller Men dens anti-cancer og kræftforebyggende roller er ikke blevet fuldt belyst; Mere specifikt er det ikke blevet rapporteret om den biologiske aktivitet af B-DIM er relateret til induktion af AMPK signalering.

Derfor, i den aktuelle undersøgelse, undersøgte vi virkningerne af B-DIM på AMPK signalering og dets relaterede downstream mål i både androgen-følsomme LNCaP og androgen-ufølsom C4-2B prostata cancer celler, der indeholder funktionelle AR. Vores resultater viste, for første gang, at B-DIM kunne fungere som en AMPK aktivator. Aktivering af AMPK ved B-DIM resulterede i nedregulering af AR og prostataspecifikt antigen (PSA) ekspression, og forårsagede induktion af celleapoptose, undertrykkelse af mTOR pathway, og inhibering af prostasphere i humant prostatacancerceller

In vitro

in vivo

. Vores resultater viste også, at AMPK vej er en af ​​de nye molekylære mål af B-DIM for sine anti-cancer effekt mod menneskelig prostatakræft.

Metoder

Cell Culture, Protein Extraction, og Western Blot-analyse

Menneskelig prostatakræft C4-2B (fås fra professor Leland Chung, Emory University, School of Medicine, Atlanta, GA, og i øjeblikket på Cedars-Sinai, Los Angeles, CA) og LNCaP (American Type Culture Collection Manassas, VA, USA) celler blev dyrket i RPMI 1640 medium (Invitrogen, Carlsbad, CA) suppleret med 10% føtalt kalveserum (FCS), 100 ug /ml streptomycin, 100 enheder /ml penicillin, og 2 mM glutamin, i en fugtig inkubator med 5% CO

2 og 95% luft ved 37 ° C. En hel celleekstrakt blev fremstillet som tidligere beskrevet [26]. Til Western blot-analyse blev samme mængde protein fra hver celle ekstrakt underkastes denaturerende polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) og overført til nitrocellulosemembraner. Individuelle membraner blev probet med viste antistoffer. Immunreaktive bånd blev udviklet under anvendelse af peberrodsperoxidasekonjugeret sekundære antistoffer og SuperSignal WestPico kemiluminescerende substrat (Pierce) og fremkaldes med røntgenfilm.

Prostasphere Formation Assay

Prostasphere formation assay blev udført for at vurdere kapaciteten af kræft stamceller selvfornyelse efter vores publiceret procedure [27]. Kort fortalt blev enkelt-celle suspensioner af C4-2B celler grundigt suspenderet og udpladet i ultralav adhærente-brønde i 6-brønds plader (Corning, Lowell, MA) ved 1.000 celler /brønd i 1,5 ml sfære dannelse medium (01:01 DMEM /F12 medium suppleret med 50 enheder /ml penicillin, 50 mg /ml streptomycin, B-27, og N-2). En milliliter af kugle-dannelse medium blev tilsat hver 3. dag. Efter 6 dages inkubation med forskellige koncentrationer af B-DIM eller metformin (som kontrol), blev de dannede kugler indsamlet ved centrifugering ved 300 × g i 5 minutter og prostasphere numre blev talt under et omvendt fase-kontrast mikroskop. Andelen af ​​sfære-frembringende celler blev beregnet ved at dividere antallet af celler podet med antallet af prostaspheres.

forsøgsdyr Salg

Male homozygot CB-17 SCID-mus (4-5 uger gamle) blev indkøbt fra Taconic Farms (Germantown, NY). Musene blev huset og vedligeholdes under sterile forhold i anlæg akkrediteret af American Association for akkreditering af Laboratory Animal Care og i overensstemmelse med gældende regler og standarder for det amerikanske Department of Agriculture, US Department of Health og Human Services, og NIH. Musene blev anvendt i overensstemmelse med Animal Care og Brug retningslinjer for Wayne State University under en protokol godkendt af Wayne State University Animal Care og brug Udvalg. Mus fik Lab Diet 5021 (Purina Mills, Inc., Richmond, IN).

Menneskelig Bone og Implantation af tumorceller

Menneskelig mandlige føtalt knoglevæv blev opnået af en tredjepart nonprofit organisation ( Avancerede Bioscience Resources, Alameda, CA) og skriftligt informeret samtykke blev opnået fra donor familien, i overensstemmelse med forskrifter fra hver involveret statslige og føderale regering. Efter en uges akklimatisering blev musene implanteret med en enkelt human føtal knoglefragment som tidligere beskrevet [28] – [29]. C4-2B celler blev høstet fra subkonfluente kulturer efter en kort udsættelse for 0,25% trypsin og 0,2% EDTA. Trypsinisering blev standset ved tilsætning et medium indeholdende 10% FBS. Cellerne blev vasket en gang i serumfrit medium og resuspenderes. Kun suspensioner består af en enkelt celle med 90% levedygtighed blev anvendt til injektionerne. Celler (1 x 10

6) i 20-pi serumfrit RPMI-medium blev injiceret intraosseously ved indsættelse af en 27-gauge nål og Hamilton-sprøjte gennem musehud direkte ind i marven overflade af den tidligere implanteret knogle. I vores tidligere erfaringer med denne model, fandt vi en tumoroptagelse på 95% i forhold til huden xenograft hvor tumoren optagelseshastigheden var forholdsvis mindre med forlænget latenstid. Så snart størstedelen af ​​knogleimplantater begyndte at forstørre (nu kaldet en “knogle tumor”) som bestemt ved caliper-målinger (30. dag efter cancercelle injektion), blev mus randomiseret i følgende behandlingsgrupper (n = 7): ( a) ubehandlet kontrol; (B) kun B-DIM, 5 mg /mus fodret daglige oralt med sonde i 4 uger siden indledningen af ​​behandlingen. Volumenet af knoglen tumor i hver gruppe blev bestemt ved to gange om ugen tykkelsesmålinger. Legemsvægten af ​​mus i hver gruppe blev også målt. Alle mus blev aflivet en dag efter den sidste dosis af B-DIM behandling (5 uger), fordi store tumorer blev dannet i kontrolmusene, der krævede ophør, og deres endelige kropsvægt og tumorvolumen blev registreret. På obduktion, blev tumoren pænt udskåret, befriet for enhver uvedkommende vedhæftende væv, og en del af vævet blev fikseret i formalin og indlejret i paraffin for immunfarvning og H 0,05, ** P. 0,01

B-DIM Aktiverer AMPK og nedregulerer AR i Androgen Uafhængig C4-2B Prostata tumorxenoplantater i SCID mus

ovenstående resultater fra vores

in vitro Salg undersøgelser viste klart, at AMPK-signalvejen er en af ​​de hidtil ukendte molekylære mål af B-DIM i prostatacancerceller. For at bekræfte dette resultat

in vivo

, vi designet og anvendt det eksperimentelle knoglemetastaser dyremodel (se materialer og metoder), som efterligner knoglemetastaser af human prostatacancer. Vi fandt, at B-DIM behandling

in vivo

inhiberede C4-2B tumorvækst i knoglen mikromiljø til en vis grad (20%; data ikke vist). Tumor væv blev fjernet og analyseret ved immunhistokemi under anvendelse af anti-phosphor-AMPKα, fosfor-ACC og AR-antistoffer. Resultaterne viste, at p-AMPK- og p-ACC-positive cellepopulationer steg betydeligt, mens AR-positive celler faldt betydeligt i tumorerne behandlet med B-DIM sammenlignet med kontrollen (fig. 5). Disse resultater bekræfter, at B-DIM er i stand til at aktivere AMPK vej

in vivo

, der er forbundet med dens anti-cancer aktivitet.

ICR SCID-mus blev implanteret med C4-2B celler og behandlet med 5 mg /mus af B-DIM ved orale gavages dagligt i 4 uger. Tumorvæv blev analyseret ved immunohistokemi under anvendelse af anti-phosphor-AMPKα (T172), fosfor-ACC (S79) eller Ar-antistoffer. De farvede snit blev visualiseret under mikroskop (400 x forstærkning). I modsætning til opløsningsmiddel-behandlede kontrol, mus behandlet med B-DIM præsenteret med aktivering af AMPK og betydeligt tab af AR i tumor sektioner.

Diskussion

Jagten på nye antitumorlægemidler fra naturligt kilder er et af de mest lovende tiltag til forebyggelse og behandling af kræft. Vi har studeret formuleret 3,3′-diindolylmethane (B-DIM) og viste, at B-DIM kan inducere apoptose og inhibere cellevækst, angiogenese og invasion af prostata cancerceller ved at regulere NF-KB, Akt og AR signalveje [ ,,,0],24] – [25]. Men den præcise molekylære mekanisme (r), hvorved B-DIM fremkalde sine anti-cancer virkninger på menneskers prostatakræft er ikke blevet fuldt belyst. I denne undersøgelse, opdagede vi, at AMPK er en af ​​de direkte molekylære mål af B-DIM i prostata kræftceller

in vitro

in vivo

.

AMPK signalering sti er for nylig blevet et vigtigt fokus for interesse i forebyggelse og terapi kræft. Bowker

et al

. undersøgte forekomsten af ​​kræft i 10,309 diabetiske patienter behandlet med insulin, metformin eller sulfonylurinstoffer i en periode på 5 år. De rapporterede, at patienter behandlet med metformin havde en signifikant lavere sats for kræft dødelighed sammenlignet med patienter udsat for andre anti-diabetisk medicin [12]. Den største anti-cancer mekanisme metformin var forbundet med aktivering af AMPK signalering [34]. Aktivering af AMPK hæmmer energiforbrugende veje, proteinsyntese og celleproliferation, gennem undertrykkelse af mTOR pathway

via

knolde sklerose 2 protein (TSC-2) [38]. Hirsch H

et al

. rapporterede, at metformin selektivt målretter cancer stamceller og hæmmer tumorvækst i musemodeller medieret af aktivering af AMPK pathway [16]. Det er blevet rapporteret, at nogle naturlige forbindelser, herunder genistein (rig på sojabønne), EGCG (rigelige i grøn te), og capsaicin (fra chili) er i stand til at aktivere AMPK pathway [17]. Opdagelsen af ​​flere AMPK aktivatorer fra naturlige kilder er ved at blive en attraktiv tilgang til forebyggelse og terapi kræft.

Vores nuværende resultater viser, at B-DIM kan aktivere AMPK signalering så tidligt som tre timer både androgen følsomme LNCaP og androgen -insensitive C4-2B prostatacancerceller, målt ved: (i) steg proteinniveauer af fosfor-AMPKα (T172), (ii) øget phosphoryleret ACC på serinrest 79 [30] – [31], (iii) øget proteinniveauer af fosfor-Raptor (S792), som er et direkte mål for AMPK og en mTOR bindingspartner og inhibitor [8], og (iv) reducerede niveauer af fosfor-mTOR (fig. 1). Følgerne af AMPK aktivering ved B-DIM at være medieret gennem hæmning af AR og PSA-ekspression, hvilket fører til induktion af apoptose efter yderligere behandling i yderligere 21 timer (fig. 1, 6). aktivering AMPK ved B-DIM kunne blokeres af forbehandling med forbindelse C, en AMPK-hæmmer, i prostata cancer celler (Fig. 2).

androgen receptor (AR) er en kritisk faktor for prostatakræft udvikling og progression. Prostatacancer er afhængig af androgen stimulation medieret af AR, og AR selv spiller en vigtig rolle i udviklingen af ​​kræft og lægemiddel-resistens i androgen-uafhængige prostatacancerceller. Alternative mekanismer AR aktivering i androgen-uafhængig prostatacancer foreslås gennem andre signalveje, herunder ERK’er, Akt, β-catenin og caveolin [39] – [41]. Derfor undertrykkelse af AR er en af ​​de terapeutiske strategier for prostatacancerpatienter. Casodex er et anti-androgen lægemiddel klinisk anvendes til patienter i metastatisk /fremskredent stadium. Eventuelle naturlige forbindelser, der kan øge effektiviteten af ​​bicalutamid har potentiel terapeutisk nytte i klinikken. Vi viste i nærværende undersøgelse, at samtidig behandling af celler med bicalutamid og B-DIM ført til en betydelig stigning i fosfor-AMPKα og undertrykt AR udtryk i prostata cancer celler (Fig. 3), hvilket viser en ny mekanisme for synergi af anti- AR terapi.

Prostatacancer væv indeholder en sjælden population af multipotente cancer stamceller med evnen til at forny sig selv. Disse prostatakræft stamceller kunne beriges og målt ved en kolonidannelse assayet i tredimensionale kulturer, benævnt prostasphere formationen. Prostatacancerceller med stamcelle egenskaber besidder evnen til at danne prostaspheres fra enkelte celler som betingelse for selvfornyende i ikke-adhærente dyrkningsbetingelser [42]. For at bestemme, om B-DIM kunne målrette prostata stængel /stamme-lignende celler, vi testede det i prostasphere dannelse analyser. Resultatet viste, at efter seks dages inkubation af C4-2B celler med forskellige doser af B-DIM, ikke kun var antal dannede prostaspheres faldt betydeligt, men størrelsen af ​​prostaspheres blev reduceret samt (fig. 4). Resultaterne fra

in vitro

undersøgelser blev yderligere bekræftet af de immunhistokemiske resultater fra tumorvæv af prostatacancer-xenotransplantater behandlet med B-DIM (fig. 5). Positive cellepopulationer farvet med fosfor-AMPK eller fosfor-ACC blev væsentligt forøget, mens AR-positive celler blev reduceret i B-DIM behandlede tumor væv (fig. 5).

Sammenfattende den foreliggende undersøgelse giver den første dokumentation for, at AMPK signalvejen er en af ​​de molekylære mål af B-DIM for dens anti-cancer-aktivitet. Aktivering af AMPK ved B-DIM resulterer i undertrykkelse af sin nedstrømsmål mTOR, nedregulering af AR ekspression og induktion af apoptose i både androgen-sensitive LNCaP og androgen-ufølsom C4-2B prostatacancerceller (fig. 6). Aktivering af AMPK af B-DIM blev også observeret i behandlede prostatatumorer. Vores resultater viser, at B-DIM kunne bruges som et muligt middel i klinikken til forebyggelse og /eller behandling af prostatacancer uanset androgen responsivitet af cellerne.

Tak

Vi takker Ms Sara Schmitt for kritisk læsning af manuskriptet.