PLoS ONE: Vigtigheden af ​​Stem Cell Marker Prominin-1 /CD133 i Optagelse af Transferrin og i Iron Metabolisme i Human Colon Cancer Caco-2 Cells

Abstrakt

Som det pentaspan stamcelle markør CD133 var vist sig at binde kolesterol og at lokalisere i plasma membran fremspring, vi har undersøgt en mulig funktion for CD133 i endocytose. Brug af CD133 siRNA knockdown strategi og ikke-differentieret human coloncancer Caco-2-celler, som konstitutivt over-udtrykte CD133, vi leverer for første gang direkte bevis for en rolle CD133 i den intracellulære akkumulering af fluorescensmærkede ekstracellulære forbindelser. Vurderet ved hjælp AC133 monoklonalt antistof, blev CD133 knockdown vist sig at forbedre Alexa488-transferrin (Tf) optagelse i Caco-2 celler, men havde ingen effekt på FITC-dextran eller FITC-kolera-toksin. Manglende effekt af CD133 knockdown på Tf genbrug etableret en rolle for CD133 hæmme Tf endocytose snarere end at stimulere Tf exocytose. Anvendelse af tidligere identificerede inhibitorer af kendte endocytiske veje og den positive effekt af CD133 knockdown på cellulære optagelse af clathrin-endocytose syntetiske lipidkapslen støttet, at CD133 indvirkning på endocytose primært blev tilskrevet den clathrin vej. Også, cholesterol ekstraktion med methyl-β-cyclodextrin op reguleret Tf optagelse ved større intensitet i CD133

høj stilling end i CD133

lav situationen, hvilket tyder på en rolle for cholesterol i den inhibitoriske virkning af CD133 på endocytose. Interessant celle behandling med AC133 antistof nedreguleres Tf optagelse, hvilket viser, at direkte ekstracellulært binding til CD133 kan påvirke endocytose. Desuden flowcytometri og konfokal mikroskopi konstateret, at nedregulering af CD133 forbedrede adgangen til TfR fra det ekstracellulære rum, hvilket giver en mekanisme, hvorved CD133 inhiberede Tf optagelse. Som Tf er involveret i at levere jern til cellen, blev virkningerne af jerntilskud og afsavn på CD133 /AC133 udtryk undersøgt. Begge viste en dosisafhængig nedregulering her diskuteret til lyset fra transkriptionelle og post-transciptional virkninger. Tilsammen disse data udvide vores viden om funktionen af ​​CD133 og understreger interesse yderligere udforske CD133-Tf-jern netværk

Henvisning:. Bourseau-Guilmain E, Griveau A, Benoit JP, Garcion E ( 2011) Vigtigheden af ​​Stem Cell Marker Prominin-1 /CD133 i optagelse af Transferrin og i Iron Metabolisme i human tyktarmskræft Caco-2 celler. PLoS ONE 6 (9): e25515. doi: 10,1371 /journal.pone.0025515

Redaktør: Wael El-Rifai, Vanderbilt University Medical Center, USA

Modtaget: Marts 22, 2011; Accepteret: September 7, 2011; Udgivet: 26 September, 2011

Copyright: © 2011 Bourseau-Guilmain et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af “Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale”, den “Axe Cellules Souches et Cancer” på “Cancéropôle Grand-Ouest” og “La Ligue Contre le Cancer” gennem en “Equipe Labellisée 2007” tilskud . Erika Bourseau var oprindeligt en ph.d.-stipendiat med “Conseil Général de Maine-et-Loire” og derefter et ph.d.-stipendiat med “Comité Départemental de Maine-et-Loire de La Ligue Contre le Cancer”. Audrey Griveau var en ph.d.-stipendiat med “Conseil Général de Maine-et-Loire”. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

som følge af anvendelse af nye monoklonale antistoffer dannet mod neuroepitel og hæmatopoietiske stamceller, CD133, også kendt i mennesker og gnavere som Prominin-1, blev først isoleret og klonet i 1997 [1], [2], [ ,,,0],3]. CD133 er en fem-domæne transmembrant protein, som består af en N-terminal ekstracellulær hale, to små cytoplasmatiske løkker, to store ekstracellulære løkker indeholdende syv potentielle glycosyleringssites og en kort C-terminale intracellulære hale, der kan alternativt splejset [4] eller phosphoryleret [5].

på trods af konstante forskningsindsats, den biologiske funktion af CD133 stort set ukendt. Blandt notoriske fænotyper, er det blevet vist, at en trunkeret CD133, som ikke transporteres til cellemembranen, fører til human retinal degeneration [6]. Understregning denne vigtige observation, analyse af en generation af CD133-mangel mus viste, at mens udtrykt meget tidligt under retinal udvikling, CD133 fungeret som en vigtig regulator af disk morfogenese og at tab af CD133 forårsagede fotoreceptordegenerering og blindhed [7]. Desuden AC133, et glycosyleret epitop af CD133-proteinet oprindeligt forbundet med embryonale stamceller [8] og en række somatiske stamceller, blev grundigt beskrevet som en formodet cancer stamcellemarkør i blod, hjerne, colon, prostata, lunge, bryst , lever og hudkræft [9], [10]. Andre undersøgelser har vist, at CD133 er knyttet til cellemetabolisme som glukose lydhør gen i myorør [11], samt give bevis for bioenergetic stress [12] og ikke-eksponering for høj ilt spændinger i gliomer (Bourseau-Guilmain et al. indgav).

på det subcellulære niveau, er CD133 fortrinsvis lokaliseret i plasma membran fremspring og mikrovilli [13]. Derfra kan CD133 binde til kolesterol [14] og interagere med gangliosider [15]. Som membran fremspring og mikrovilli muliggøre udvidelse af membranoverfladen for at øge celle eksponering for det ekstracellulære rum, disse observationer giver vigtige fingerpeg identificere den molekylære rolle CD133, navnlig ved at overveje cellulære udvekslinger med mikromiljøet. Faktisk CD133 blev fundet i membranvesikler adskiller sig fra exosomer der blev udgivet fra epitelceller under differentiering [16].

Samtidig med disse uden-på signaler, kolesterol og sphingolipider adskille i lipid raft membran mikrodomæner impliceret i inde udtjekning signalering og endocytose [17], [18]. I betragtning af den tætte relation mellem CD133 og kolesterol, plus dens mulige forbindelse til sphingolipider og eksponering for det ekstracellulære rum, vi hypotese, at CD133 er involveret i endocytose: en grundlæggende proces, hvorved ekstracellulære forbindelser internaliseres og distribueres til intracellulære rum

i den foreliggende undersøgelse under anvendelse af RNA-interferens strategi og udifferentieret human coloncancer Caco-2-celler, som konstitutivt over-udtrykte CD133 /AC133, vi leverer for første gang evidens for en rolle CD133 i den intracellulære akkumulering af ekstracellulære forbindelser , især eksemplificeret ved transferrin (Tf). Ud over data, der etablerer en rolle for CD133 i endocytose, vi også vise, at CD133 selv er reguleret af jern, hvilket understøtter eksistensen af ​​et Tf-CD133-jern-netværk. Disse nye observationer diskuteres i lyset af CD133 mønster af udtryk og aktuel viden på området.

Materialer og metoder

Cell kultur

Udifferentieret menneskelige kolon carcinoma Caco- 2-celler (American Type Culture Collection: HTB-37 ™) blev dyrket ved 37 ° C i en atmosfære af 5% CO

2 i Dulbeccos modificerede Eagle-medium (DMEM; Lonza, Levallois-Perret, Frankrig) indeholdende 4,5 g /l glucose og L-glutamin. Mediet blev tilsat 10% føtalt bovint serum (FBS, Lonza, Verviers, Belgien), 1% antibiotika (10 enheder /ml penicillin, 10 mg /ml streptomycin, 25 ug /ml amphotericin B; Sigma-Aldrich, Saint Louis, USA, MO) og 1% ikke-essentielle aminosyrer (NEAA, Lonza, Verviers, Belgien). Når cellerne nåede 80% sammenløb, blev de dissocieret i 0,5% porcint trypsin og 0,2 g /mL EDTA (Lonza, Verviers, Belgien) før genbrug plating på ubestrøget plastik kolber på 15 × 10

3 celler /cm

2. Halvdelen af ​​mediet blev erstattet med frisk medium hver anden dag.

siRNA knockdown af CD133

Caco-2-celler blev udpladet i seks-brønds plader med 2,3 x 10

5 celler pr i 2 ml af ovennævnte medium i 24 timer. Medium blev fjernet, og celler blev transficeret med 30 nM af RNA oligonucleotidduplexer (Sigma-Aldrich) under anvendelse af N-TER reagens ifølge producentens instruktioner (Sigma-Aldrich). N-TER /siRNA komplekser blev derefter inkuberet i Caco-2-medium i 48 timer ved 37 ° C i en atmosfære indeholdende 5% CO

2. siRNA blev derefter fjernet og erstattet med frisk medium i 24 timer. En sekvens kapløbet blev anvendt som negativ kontrol: 5′-GUCCGGAAUUACCAUGAGUdTdT-3 ‘. Den anvendes til at udføre målrettet RNA-interferens inhibering af CD133-sekvensen var 5’-CCCUUAAUGAUAUACCUGAdTdT-3 ‘.

AC133 immunmærkning

Caco-2 celler udsat for siRNA blev opsamlet og dissocieret ved hjælp af Versene (Lonza) . Celler blev inkuberet med 5 ug /ml AC133 antistof (Miltenyi Biotech, Paris, Frankrig) eller IgG1ĸ isotypekontrol (BD-Biosciences, Le Pont-de-Claix, Frankrig) i 1 time ved 4 ° C i PBS indeholdende 5% FBS og 0,02% natriumazid. Celler blev derefter vasket tre gange i PBS indeholdende 5% FBS og 0,02% natriumazid, og inkuberet i 30 minutter ved 4 ° C med FITC-konjugeret ged anti-mus IgG F (ab ‘) 2-fragment polyklonalt antistof (DakoCytomation, Trappes, Frankrig) ved 20 ug /ml i PBS indeholdende 5% FBS og 0,02% natriumazid. Efter yderligere tre vaskninger i PBS indeholdende 5% FBS og 0,02% natriumazid blev cellerne resuspenderet i PBS indeholdende 2% formaldehyd og 0,02% natriumazid.

Flowcytometri

A BD FACSCalibur ™ fluorescerende aktiveret flowcytometer og BD CellQuest ™ software (BD-Biosciences) blev anvendt til flowcytometri erhvervelse. Analyse blev udført ved hjælp WinMDI 2.9 software (Scripps Institute, La Jolla, CA, USA).

Syntese af Nile rød-mærket lipidkapslen (NR-LNC)

50 nm Nilen rød ( NR) -mærket lipidkapslen (LNC) (NR-LNC), der inkorporerede fluorescerende forbindelse NR blev fremstillet som tidligere beskrevet [19] ved hjælp af en faseinversionsproces som følger dannelsen af ​​en olie /vand mikroemulsion indeholdende triglycerider (Labrafac® WL 1349, Gattefosse, Saint-Priest, Frankrig), et ikke ionisk hydrofilt tensid (Solutol® HS 15, Gmbh, Ludwigshafen, Tyskland) og lecithin (Lipoïd® S75-3, Gmbh). NR blev opløst i acetone ved 1% (vægt /vægt), og den resulterende NR opløsning blev inkorporeret i Labrafac® på 1:10 (vægt /vægt). Således 846 mg Solutol®, 75 mg Lipoïd®, 1029 mg Labrafac® indeholdende NR, 89 mg NaCl og 2975 mg vand blev blandet og opvarmet under magnetisk omrøring op til 85 ° C. Tre cyklusser af progressiv opvarmning og afkøling i mellem 85 ° C og 60 ° C blev derefter gennemført. De blev endelig efterfulgt af en irreversibel chok induceret ved fortynding med 12,5 ml 0 ° C deioniseret vand tilsat til inversion fase zone. Størrelsesudelukkelse og højtryks-væskekromatografi (HPLC) assays demonstrerede en fuldstændig indkapsling og tilbageholdelse af NR som tidligere observeret [19]. LNC blev analyseret for deres størrelsesfordeling under anvendelse af en Malvern Zetasizer® Nano Series DTS 1060 (Malvern Instruments SA, Worcestershire, GB).

internalisering af transferrin (Tf), dextran (Dx), koleratoksin-underenhed B (CTB ) og lipidkapslen (LNC)

mediet af transficerede celler blev fjernet og erstattet med DMEM suppleret med 1% af serumfrit N1 medium (Sigma Aldrich) i 1 time. De tre følgende forbindelser, Tf-Alexa 488 på 0,5 og 5 mg /ml (Invitrogen, Cergy Pontoise, Frankrig), Dx-FITC på 0,5 og 5 mg /ml (Sigma Aldrich) og CTB-FITC ved 1 og 10 ug /ml (Invitrogen), eller i stedet, NR-LNC til 1/1000 fortynding fra initiale suspension således svarer til en 100 ug /ml koncentration, blev derefter tilsat til mediet i 1 time. Celler blev derefter dissocieret ved anvendelse af Versene (Lonza). At muliggøre bestemmelse af fraktionen af ​​mærkede molekyler eller partikler, der effektivt blev internaliseret i cellerne, blev ekstracellulær fluorescens quenchet under anvendelse 0,4% trypanblåt (Sigma-Aldrich). Celler blev derefter vasket i PBS og resuspenderet i PBS indeholdende 2% formaldehyd og 0,02% natriumazid. Internalisering af fluorescerende mærket Tf, Dx, CTB og LNC blev overvåget ved flowcytometri.

Analyse af frigivelsen af ​​Tf fra Caco-2 celler efter internalisering

Kontrol og CD133-specifikke siRNA blev brugt at generere CD133

høje og CD133

lave transficerede Caco-2-celler, hhv. Celler blev derefter inkuberet med Tf-Alexa 488 i 2 timer ved 37 ° C /5% CO

2 før det ekstracellulære medium blev fjernet, vasket og erstattet med frisk medium fri for Tf-Alexa 488. Efter yderligere inkubation ved 37 ° C /5% CO

2 i 1 time, 2 timer og 3 timer, den resterende intracellulære Tf-Alexa 488 fluorescens, der repræsenterer mængden af ​​Tf-Alexa 488, som ikke blev recirkuleret til det ekstracellulære rum, blev målt ved semi- kvantitativ flowcytometri som beskrevet ovenfor.

Cell behandling med kemiske inhibitorer af endocytose og cellulære optagelse af Tf

tidligere identificerede kemiske inhibitorer af kendte endocytiske veje blev anvendt som tidligere beskrevet [19], [20 ], [21]. Kort beskrevet transficerede Caco-2-celler blev forbehandlet med inhibitorer i 1 time ved 37 ° C i N1-medium. Chlorpromazin (10 ug /ml; Sigma-Aldrich) blev anvendt til at inhibere clathrin-medieret transport [22], mens filipin (1 ug /L; Sigma-Aldrich) og dimethylamilorid (DMA, 10 uM; Sigma-Aldrich) blev anvendt til at inhibere caveolae-afhængig endocytose [23] og macropinocytosis [24], hhv. Kolesterol udtømning blev opnået ved en 2 h forbehandling med methyl-β-cyclodextrin (MβCD, 10 mM; Sigma-Aldrich) i nærvær af lovastatin (1 ug /ml; Sigma-Aldrich) [25], [26]. Efterfølgende blev cellulære optagelse af 5 ug /mL Tf-Alexa 488 overvåget ved flowcytometri-analyse som beskrevet ovenfor. For cholesterol inhibering blev 1 ug /ml lovastatin også opretholdt i mediet under behandlingen med Tf-Alexa 488. Salg

Analyse af Tf optagelse af Caco-2-celler efter behandling med AC133 antistof

Caco-2-celler blev udpladet med 2,3 x 10

5 i plader med 24 brønde i 400 pi serumholdigt medium. Efter en 24 timer initial inkubation ved 37 ° C /5% CO

2 den oprindelige medium blev erstattet af N1 serumfrit medium før inkubation med enten 0, 5 eller 10 ug /ml AC133 antistof eller af isotypekontrol IgG1ĸ . Tf-Alexa 488 blev derefter tilsat ved 5 ug /ml og inkuberet ved 37 ° C /5% CO

2 i 1 time at undersøge virkningen af ​​immunglobulin behandling på Tf-Alexa 488-optagelse. Tf-Alexa 488 optagelse blev kvantificeret ved flowcytometri som beskrevet ovenfor.

Antibody anerkendelse af Tf-receptoren på overfladen Caco-2 celler afhængigt af niveauet af CD133 ekspression

Caco-2 celler udsat for CD133 eller kontrol siRNA blev indsamlet og dissocieret ved hjælp Versene (Lonza). Celler blev inkuberet med 5 ug /ml CD71 monoklonalt muse-antistof, der genkender Tf receptor (TfR eller CD71 antigen) (klon M-A712, BD-Biosciences) eller med 5 ug /ml IgG2a, κ isotypekontrol (BD-Biosciences) til forløbe i immunolabeling og flowcytometri som beskrevet ovenfor for AC133 celleoverfladen anerkendelse.

Immunocytochemisty kombineret med konfokal laser scanning mikroskopi til identifikation af AC133, CD71 og clathrin tung kæde i Caco-2-celler

Caco-2-celler blev udpladet med 4 x 10

3 celler per brønd i otte brønde Lab-Tek Chamber Slides (Nunc, Roskilde, Danmark) i 300 pi DMEM indeholdende 10% FCS i 24 timer. De blev derefter udsat for CD133 eller kontrol siRNA som beskrevet ovenfor, før at fortsætte til immuncytokemi. Celler blev derefter vasket med PBS og fikseret med 4% paraformaldehyd i PBS (pH 7,4) i 20 minutter ved 4 ° C. Efter vask i PBS blev cellerne eksponeret i 60 minutter ved stuetemperatur til en blokerende opløsning af PBS indeholdende 4% bovint serumalbumin (Sigma-Aldrich) og 10% af normalt gedeserum (Sigma-Aldrich). Primære monoklonale antistoffer mod CD133 (IgG1ĸ, Miltenyi Biotech), TfR eller CD71 (IgG2aκ, BD-Biosciences) eller clathrin tung kæde (CHC) (lgG1, BD-Biosciences) blev inkuberet ved 5 ug /ml i PBS /BSA 4% for natten over ved 4 ° C. Bemærk, at Triton X-100 for CHC intracellulær immunolabeling, blev tilsat ved 0,1% under proceduren blokering for celle gennemtrængning. Efter vask blev et sekundært heste-anti-muse biotin-konjugeret antistof (Vector, Burlingame, CA) påført ved 1/100 i PBS /BSA 4% i 1 time ved stuetemperatur. Efter yderligere vaske Streptavidin Fluo Probe Alexa 488 (Interchim, Montluçon, Frankrig), fortyndet 1/700, blev anvendt. Celler blev endelig vasket og monteret under dækglasset i fluorescerende monteringsmedium (DakoCytomation). Konfokalt mikroskop-billeder blev opnået ved anvendelse af et Olympus FluoView ™ FU 300 konfokal laser scanning mikroskopi imaging system (Paris, Frankrig).

Jern behandlinger

Caco-2-celler blev udpladet i seks-brønds plader med 2,3 × 10

5 celler per brønd i 2 ml i 24 timer. Før jern behandling begyndte, blev FBS indeholdende medium erstattet med serumfrit N1 medium i yderligere 24 timer. Celler blev derefter behandlet med forskellige koncentrationer (50-800 uM) af ferri nitrilotrieddikesyre (Fe-NTA) i 72 timer ved 37 ° C /5% CO

2, som angivet. Fe-NTA (molforhold 01:04) blev fremstillet på bestilling fremstillet som en 20-mM stamopløsning fra NTA og ferrichloridhexahydrat (Sigma-Aldrich). Cellerne blev alternativt behandlet med FeSO

4 (Sigma-Aldrich), et andet jern donor [27], [28], på enten 150 eller 300 uM i 24 timer.

Jern afsavn og behandling med hypoxia- mimetiske agenter

følge en lignende fremgangsmåde kultur som før jern behandling, blev cellerne i stedet behandlet i 24 timer med en jern chelator, også kendt som en hypoxi-mimetisk middel, Desferrioxamin (DFO, Sigma-Aldrich) ved 100 og 150 pM [29], [30]. Alternativt blev de behandlet i 24 timer med en hypoxi-mimetiske middel, der virker uafhængigt af jern afsavn, Cobalt dichlorid (CoCl

2, Sigma-Aldrich) ved 100 og 150 uM [31].

Database , bioinformatik

for at søge efter formodede jern responsive element (IRE) sekvenser inden for 3 ‘og 5’ utranslaterede region (UTR) af humant CD133 mRNA, de anvendes i denne undersøgelse sekvenser (blandt hvilke

Homo sapiens

prominin en udskrift variant 2, NM_001145847.1) blev opnået fra NCBI GenBank. Alle sekvenssammenligninger blev udført under anvendelse af ClustalW computerprogrammet fra EMBL European Bioinformatics Institute (Heidelberg, Tyskland). De hingste (søger efter IRES) webserver (https://ccbg.imppc.org/sires/) blev også anvendt til forudsigelse af jern responsive elementer i RNA [32].

Statistisk analyse

XLSTAT 2006 Version 2006,3 (Addinsoft Paris, Frankrig) blev anvendt til dataanalyse. Den statistiske signifikans af hvert forsøg blev bestemt ved en Dunnetts test. Testene blev betragtet som signifikant med p-værdier. 0,05

Resultater

Virkningen af ​​specifikke siRNA-medieret knockdown af CD133 på den intracellulære akkumulering af Tf, Dx og CTB i ikke-opdelte Caco -2 celler

for at bestemme den potentielle indflydelse af CD133 på den intracellulære akkumulering af ekstracellulære forbindelser, ikke-differentieret human colon carcinoma Caco-2-celler, som naturligt udtrykker høje niveauer af CD133, blev anvendt. Anvendelse af enten siRNA, der ikke fører til transkriptionelle nedregulering (kontrol siRNA) eller siRNA, der nedregulerer målrettet CD133 mRNA og proteinekspression (CD133 siRNA), to situationer blev analyseret: Caco-2-celler udtrykker høje niveauer af CD133, og Caco -2 celler, der udtrykker lave niveauer af CD133. Figur 1A viser, at behandling af Caco-2-celler med 30 nM af CD133 siRNA effektivt ført til en reduktion på 52 ± 11% i CD133-proteinekspression, analyseres ved flowcytometri immunofluorescens (AC133 antistof) sammenlignet med kontrollen siRNA. For at analysere Caco-2 celler pinocytic evne i CD133

høje og CD133

lave situationer, blev den intracellulære akkumulering af eksogene markører for pinocytic veje derefter overvåges. Selvom alternative internalisering tilgange er blevet beskrevet afhængig af celletyper og differentiering status (for gennemgang se [33]), Tf-Alexa 488, Dx-FITC og CTB-FITC blev anvendt som prototype markører for receptor-medieret endocytose [34], flydende fase endocytose [24], [35] og caveolae afhængig endocytose [23], [36], hhv. Flowcytometri måling af intracellulær fluorescens efter 1 time eksponering af CD133

high-Caco-2 celler til enten 0,5 eller 5 mg /ml Dx-FITC, 1 eller 10 ug /ml CTB-FITC og 0,5 eller 5 pg /mL Tf -Alexa 488 aktiveret 100% optagelse, der skal måles i forhold til det basale GEOMEAN fluorescensintensitet af vehikel alene behandlede celler repræsenterer 0% optagelse. Selv CD133 knockdown ikke havde nogen indvirkning på intracellulær akkumulation af Dx-FITC (figur 1B) eller på CTB-FITC (figur 1C), cellulære optagelse af Tf-Alexa 488 blev væsentligt forstærket i CD133

lav-Caco-2 celler uanset afprøvede koncentration (figur 1 D). Disse data således fastsatte for første gang, at CD133 virker som en modulator af intracellulær akkumulering af exogene forbindelser.

A) Immunofluorescens associeret flowcytometrisk analyse af CD133 ekspression på ikke-opdelte Caco-2-celler behandlet med 30 nM kontrol eller CD133-specifikke siRNA. Resultater udtrykkes som en procentdel af kontrol behandling, der repræsenterer de GEOMEAN fluorescens intensitet niveauer opnået efter AC133 immunfarvning af celler behandlet med irrelevant siRNA (CD133

høje Caco-2-celler); Bemærk den effektive nedregulering af CD133 når CD133-specifik siRNA (CD133

Lav Caco-2-celler) anvendt. B-D) Flowcytometrisk analyse af intracellulær optagelse af Dx-FITC (B), CTB-FITC (C) og Tf-Alexa 488 (D) inden CD133

høje og CD133

lave Caco-2 celler efter en h inkubation ved 37 ° C /5% CO

2. Resultater er udtrykt som procentdel af kontrol, hvilket afspejler GEOMEAN fluorescens intensitet niveauer opnået for celler behandlet med vehikel alene. Data repræsenteret middelværdi ± S.E.M. opnået fra tre uafhængige forsøg. Dunnetts test: ** p 0,01, *** p 0,001

Virkning af siRNA-medieret knockdown af CD133 på Tf exocytose

I betragtning af, at CD133 syntes at være en inhibitor af cellulære optagelse af Tf samtidig have nogen indvirkning på Dx og CTB, vi yderligere fokuseret på forholdet mellem CD133 udtryk og Tf akkumulation. Den potentielle effekt af siRNA medieret knockdown af CD133 på Tf-Alexa 488 exocytose blev derfor undersøgt. Til dette formål CD133

høj og CD133

lave ikke-opdelte Caco-2-celler blev inkuberet med Tf-Alexa 488 i 2 timer ved 37 ° C /5% CO

2 før det ekstracellulære medium blev fjernet , vasket og erstattet med frisk medium fri for Tf-Alexa 488. efter yderligere inkubation i 1, 2 og 3 timer ved 37 ° C /5% CO

2 mængden af ​​Tf-Alexa 488, som ikke blev recirkuleret til det ekstracellulære kammer blev målt ved flowcytometri som beskrevet i Materialer og Metoder. Data præsenteret i figur 2 fastslået, at intracellulære niveauer af Tf-Alexa 488 faldt med inkubationstid. Efter 1 h inkubation forblev mere end 80% af den internaliserede Tf-Alexa 488 i celler i både CD133

høj og CD133

lav udtrykkende celler, mens efter en 3 timers inkubation, 54 ± 9% og 43 ± 4 % af den internaliserede Tf-Alexa 488 holdt sig inden for CD133

høje og CD133

lave udtrykkende celler, hhv. Men på alle tidspunkter undersøgte iagttoges ingen signifikant forskel afhængigt af CD133-ekspressionsniveauer (figur 2). Disse observationer understregede, at selv om Tf genbrug fandt sted i både CD133

høj og CD133

lave ikke-opdelte Caco-2 celler, kortsigtede forskelle i intracellulær Tf ophobning skyldes hovedsagelig til virkningen af ​​CD133 på endocytose mekanismer snarere end exocytose .

CD133

høj (kontrol siRNA) og CD133

lav (CD133 siRNA) ikke-opdelte Caco-2-celler blev udsat for Tf-Alexa 488 i 2 timer ved 37 ° C /5% CO

2 før det ekstracellulære medium blev fjernet, blev vasket og erstattet med frisk medium fri for Tf-Alexa 488. Mængder af Tf-Alexa 488, som ikke blev genanvendt til det ekstracellulære rum målt ved flowcytometrisk analyse efter yderligere celle inkubation ved 37 ° C /5% CO

2 i 1 til 3 h. Data er udtrykt som en% af Tf-Alexa 488 oprindeligt internaliseret. De repræsenterer middelværdi ± S.E.M. opnået fra tre uafhængige forsøg.

Effekt af kemiske inhibitorer af kendte endocytiske veje på optagelsen af ​​Tf af ikke-opdelte Caco-2 celler afhængig af niveauet af CD133-ekspression understregede betydningen af ​​clathrin vej

Efter at have konstateret, at niveauet af ekspressionen af ​​CD133 haft en indvirkning på Tf optagelse inden for ikke-opdelte Caco-2 celler, men ikke modulere Tf genbrug, vi derefter behandlet spørgsmålet om, hvorvidt CD133 er involveret i specifikke pinocytic veje [ ,,,0],33]. Til dette formål, optagelse af Tf-Alexa 488 inden CD133

høje og CD133

lav udtrykkende celler blev overvåget efter behandling med tidligere identificerede kemiske inhibitorer af kendte endocytiske veje. Chlorpromazin blev anvendt til at inhibere clathrin medieret transport [22], filipin at inhibere caveolae afhængig endocytose [23] og DMA at inhibere macropinocytosis [24]. Flowcytometri fastslået, at forbehandling af kontrol CD133

høje Caco-2 celler med filipin, chlorpromazin og DMA før udsættelse for 5 ug /mL Tf-Alexa 488, førte til en 30%, 90% og ikke-signifikant reduktion i Tf optagelse henholdsvis (figur 3A). Den største effekt af chlorpromazin kombineret med slighter effekten af ​​filipin således understreget, at Tf ophobning inden for ikke-opdelte Caco-2 celler skyldes primært clathrin-medieret transport [37]. Den filipin virkning kan forklares ved, endocytose Protopic substrater for receptor-medieret endocytose, såsom LDL eller Tf, som normalt rute til det intracellulære rum gennem clathrin pathway, kunne alternativt bruge caveolae pathway [38], [39] . Da kolesterol har vist sig at være involveret i dannelsen af ​​clathrin belagt endocytiske vesikler [26], filipin, som sequestrates kolesterol, kan også have en indirekte indvirkning på clathrin endocytose. Det er interessant, når de overvejer CD133 knockdown og CD133

lave Caco-2 celler, blev meget lignende data opnået med filipin, chlorpromazin og DMA, der fører til 18%, 85% og ikke-signifikant reduktion i Tf optagelse henholdsvis (figur 3A) . Således de kvantitative virkninger af CD133 på Tf endocytose synes at være hovedsageligt relateret til clathrin-afhængige vej. Overraskende cholesterol udtømning, opnås ved at anvende MβCD kombineret med lovastatin [25], [26], som er blevet sagt at påvirke clathrin uafhængige veje og i nogen grad clathrin afhængige pathways [26], [40], [41], resulterede i en væsentlig forbedring i Tf-Alexa 488 ophobning inden CD133

høje Caco-2 celler (+ 49%, figur 3A). Interessant nok blev virkningen af ​​kolesterol udtynding på Tf-Alexa 488 optagelse inden CD133

lave Caco-2 celler mindre markant (+ 21%, figur 3A). Disse sidste data støttede den hypotese, at CD133 interaktion med intracellulær kolesterol har også en indvirkning på Tf endocytose. For yderligere at bekræfte en mulig forbindelse mellem CD133 og clathrin-afhængige endocytose pathway, indvirkning CD133 knockdown på optagelsen af ​​syntetiske nanopartikler (LNC), der tidligere blev beskrevet at bruge clathrin pathway på rute til det intracellulære rum af Caco-2-celler [ ,,,0],21] blev undersøgt. Interessant som for fluorescerende Tf, optagelse af fluorescens mærkede LNC (NR-LNC) var signifikant højere i CD133

lave Caco-2 celler (kontrol siRNA) sammenlignet med CD133

høje Caco-2 celler (CD133 siRNA) (figur 3B).

A) Følger af CD133-specifikke siRNA knockdown for effektiviteten af ​​kemiske modulatorer af kendte endocytiske veje i modulering Tf optagelse af ikke-opdelte Caco-2-celler. Efter behandling med enten køretøj alene (kontrol), filipin, chlorpromazin, DMA eller MβCD tilføjet med lovastatin (MβCD), CD133

høje (kontrol siRNA) og CD133

lav (CD133 siRNA) ikke-opdelte Caco-2 celler blev eksponeret for 5 ug /mL Tf-Alexa 488. Cellular internalisering af Tf-Alexa 488 blev derefter monitoreret ved flowcytometri. Resultater udtrykkes i% af Tf-Alexa 488 beløb, der blev internaliseret i køretøjet behandlet kontrol. Bemærk fraværet af effekten af ​​CD133-siRNA knockdown på de store hæmning af Tf-optagelse forårsaget af chlorpromazin. Bemærk også den reducerede op regulerende virkning af kolesterol udvinding i CD133 lav situation (MβCD). Data repræsenteret middelværdi ± S.E.M. af en tredobbelt indhentet fra et repræsentativt eksperiment, der blev gengivet to gange. Sammenligninger med kontrol: Dunnetts test, * p 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001; sammenligning mellem kontrol siRNA og CD133 siRNA: Dunnetts test: p 0,05. B) Specifik siRNA-medieret knockdown af CD133 i ikke-opdelte Caco-2-celler førte til en stigning i LNC intracellulær akkumulering. Flowcytometrisk analyse af intracellulær optagelse af NR-LNC inden CD133

høj (kontrol siRNA) og CD133

lav (CD133 siRNA) Caco-2-celler efter 1 times inkubation ved 37 ° C /5% CO

2. Resultater er udtrykt som procentdel af kontrol, hvilket afspejler GEOMEAN fluorescens intensitet niveauer opnået for celler behandlet med vehikel alene. Data repræsenteret middelværdi ± S.E.M. opnået fra tre uafhængige forsøg. Dunnetts test:. ** P 0,01

Behandling af ikke-opdelte Caco-2 celler med AC133 antistof, der genkender det ekstracellulære domæne af CD133 resulterede i en reduktion i Tf optagelse

efter at have konstateret, at CD133 ekspressionen kvantitativt påvirket Tf endocytose, vi så mente, at en direkte interaktion mellem CD133 protein og Tf endocytiske maskiner ville være blevet påvirket af ekstracellulær ligand binding til CD133. Som ekstracellulær ligand CD133 var endnu ikke blevet identificeret, og da monoklonale antistoffer er allerede blevet anvendt som aktiverende eller som funktion blokerende immunoglobuliner, for eksempel i interaktioner mellem integriner og ekstracellulære matrix [42], AC133 antistof, som genkender en ekstracellulær glycosylering epitop af CD133 [43], blev derefter testet som CD133 ligand på levende Caco-2-celler. Interessant, mens behandling af ikke-opdelte Caco-2-celler med en IgG1ĸ isotypekontrol immunoglobulin havde ingen effekt på den intracellulære akkumulering af Tf-Alexa 488 evalueret med flowcytometri (figur 4A), behandling med AC133 antistof resulterede i en væsentlig reduktion i Tf optagelse af 38 ± 8% og 75 ± 1% ved 5 og 10 ug /mL (figur 4A). Disse data, der er etableret, at AC133 effektivt kan udøve funktionelle virkninger på levende celler her tilskrives et samspil mellem CD133 selv og Tf endocytiske maskiner i ikke-opdelte Caco-2 celler.

A) AC133 antistofbehandling hæmmede Tf uptake.