PLoS ONE: Identifikation af Novel terapeutiske mål i mikrodissekeres Clear Cell ovariecancer

Abstrakt

Ryd celle kræft i æggestokkene er en epitelial kræft i æggestokkene histotype der er mindre lydhøre over for kemoterapi og bærer dårligere prognose end serøse og endometrioide histotypes. På trods af dette, er patienter med disse tumorer behandlet på samme måde som alle andre ovariecancere. Forrige genomisk analyse har foreslået, at klare celle kræft udgør en unik tumor undertype. Her genererede vi den første hele genomiske udtryk profilering ved hjælp af epitelial komponent af klare celle kræft i æggestokkene og normale æggestokkene overflade prøver isoleret ved laser capture mikrodissektion. Alle arrayene blev analyseret ved anvendelse BRB ArrayTools og PathwayStudio software til at identificere de signalveje. Identificerede veje valideret ved hjælp af serøse, klare celle cancer cellelinjer og RNAi teknologi.

In vivo

valideringer foretages ud fra en ortotopisk musemodel og liposomindkapslet siRNA. Patient-afledte klar celle og serøse ovarietumorer blev podet under nyrekapslen af ​​NOD-SCID-mus for at evaluere det terapeutiske potentiale af det identificerede pathway. Vi identificerede store aktiverede veje i klare celler involverer i hypoksisk cellevækst, angiogenese, og glukosemetabolismen ikke set i andre histotypes. Knockdown af centrale gener i disse veje sensibiliserede clear cell æggestokkene cancercellelinier på hypoxi /glucosemangel.

In vivo

forsøg med patient afledte tumorer demonstrerer, at klare celletumorer er udsøgt følsomme over for angiogenese terapi (dvs. sunitinib) sammenlignet med serøse tumorer. Vi genererede en histotype specifik, gen signatur associeret med klar celle kræft i æggestokkene, der identificerer vigtige aktiverede veje kritisk for deres clinicopathologic karakteristika. Disse resultater giver et rationelt grundlag for en radikalt anderledes behandling for æggestokkene klare celle patienter

Henvisning:. Stany MP, Vathipadiekal V, Ozbun L, Stone RL, Mok SC, Xue H, et al. (2011) Identifikation af nye terapeutiske mål i mikrodissekeres Klare Cell ovariecancer. PLoS ONE 6 (7): e21121. doi: 10,1371 /journal.pone.0021121

Redaktør: Chad Creighton, Baylor College of Medicine, USA

Modtaget: Februar 2, 2011; Accepteret: 19 maj 2011; Udgivet: Juli 6, 2011

Dette er en åben-adgang artiklen, fri for alle ophavsrettigheder, og kan frit gengives, distribueres, overføres, ændres, bygget på, eller på anden måde bruges af alle til ethvert lovligt formål. Værket gøres tilgængeligt under Creative Commons CC0 public domain dedikation

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet delvist af Intramural Research Program af National Cancer Institute ved National Institutes of Health (MJB) og OvCaRe (et initiativ fra Vancouver General Hospital og University of BC Hospital Foundation og BC Cancer Foundation) (YZW), BC Cancer Foundation og Pfizer Canada (Investigator-initieret projekt, SLE og YZW). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet. Ingen yderligere ekstern finansiering blev modtaget til denne undersøgelse

Konkurrerende interesser:. Pfizer Canada er en lægemiddelvirksomhed. SLE og YZW modtog Investigator-initieret projektstøtte fra Pfizer Canada. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle de PLoS ONE politikker på datadeling og materialer.

Introduktion

Ryd celle ovariecancer (CCOC) blev oprindeligt beskrevet som en mesonephroma ovarii i 1939 af Schiller grundet dens lignende udseende til renalcellecarcinom [1]. Yderligere undersøgelser siden da, har vist, at disse tumorer er af æggestokkene oprindelse [2], [3], [4], [5], [6] CCOC udgør 4-14% af alle epitelial kræft i æggestokkene og dets kliniske adfærd adskiller sig fra de andre epiteliale histotypes [4], [6], [7]. Patienter med stadium I CCOC har en 27% risiko for recidiv [8] med en fem år overlevelsesrater for 60% sammenlignet med 80%, for serøse tumorer [8]. Patienter med sent stadium sygdom har også en dårligere prognose sammenlignet med patienter med fremskreden stadie serøs æggestokkræft [8]. Dette afspejler sandsynligvis CCOC s lavere reaktion på den traditionelle platin /taxan kemoterapi, rapporteres at være mellem 11-45% i løbet af første-linie behandling [8], [9]. CCOC patienter har også højere tromboemboliske hændelser sammenlignet med patienter med andre epitelial ovariecancer histotypes [10].

Histologisk CCOC celler er “klar” på grund af den høje cytoplasmatiske glykogen indhold, der er en artefakt af H E farvning [11], [12]. CCOC har vist sig at have ultrastrukturelle lighed for at rydde cellecarcinom i vagina og endometrium. Denne ultrastrukturelle lighed bærer over til genetisk lighed så godt. Zorn et al. fundet lignende genekspressionsprofiler af klare celletumorer i æggestokkene, endometrium, og nyre med anvendelse af et 11.000 probeset array [13]. Denne genetiske overlap, dog ikke strække sig til sammenligningen af ​​serøse og endometrioide histotypes af æggestokkene og endometrie oprindelse. En anden genekspressionsprofilen af ​​CCOC under anvendelse af en 7,129 probe sæt arrayet påvist at være meget forskellig fra de andre histotypes [14]. Disse undersøgelser tyder på, at der er lignende veje, der fører til den klare celle histotype uanset orglet oprindelseslandet.

I denne undersøgelse præsenterer vi resultaterne af den første hele genom udtryk profilering af Mikrodissekterede CCOC prøver. Gene ontologi og sti analyse identificeret store aktiverede involverede veje i hypoksisk cellevækst, angiogenese, og glukosemetabolismen. Vi antager, at disse veje kan give en mekanisme for aggressive kliniske karakter af CCOC. Vi demonstrerer, at klare celle kræft cellelinjer overlever bedre end serøse cellelinjer under hypoxi og glucose berøvet betingelser, og det er til dels på grund af disse aktiverede veje involverer HIF1 α og enolase.

In vivo

forsøg med patient afledte væv demonstrerer, at klare celle tumorxenoplantater er udsøgt følsomme over for angiogenese terapi (sunitinib) sammenlignet med serøse tumorer. Kombinationsbehandling af sunitinib og RNAi til HIF1α og enolase demonstrerer synergistisk anti tumor aktivitet. Disse resultater giver et rationelt grundlag for specifik terapi i disse patienter.

Materialer og metoder

Etik Statement

Ovariecancer vævsprøver blev opnået med informeret skriftligt samtykke fra patienter, der gennemgår bilateral salpingoophorectomy på Vancouver General Hospital efter en protokol godkendt af University of British Columbia Clinical Research Ethics Board, Canada. Prøver, der anvendes til profilering blev indsamlet under de protokoller, der er godkendt af de institutionelle anmeldelse bestyrelserne for Brigham og kvinders Hospital (Boston, MA, USA) og blev opnået med informeret skriftligt samtykke fra patienterne. Animal pleje og eksperimenter blev udført i overensstemmelse med de retningslinjer og godkendelse ved University of British Columbia – British Columbia Cancer Agency Research Ethics Board (UBC BCCA REB) (nummer: H04-60131) og MD Anderson Cancer Center Institutional Animal Care og brug Udvalg, USA (IACUC Nummer: 12-02-18233).

Vævsprøver, mikrodissektion, RNA isolering og forstærkning

Ti klare celle kræft i æggestokkene prøver blev indhentet fra de primære tumorer i tidligere ubehandlet æggestokkene kræftpatienter på Brigham and Women ‘s Hospital (Boston, MA). Et sæt af 10 normale ovarie overfladeepitelet (OSE) cytobrushing prøver blev også opnået fra de normale ovarier fra patienter på tidspunktet for kirurgi for godartede indikationer. Frosne snit (7 um) blev anbragt på FRAME slides (Leica, Wetzlar, Tyskland), faste i 70% alkohol i 30 sekunder, farves med 1% methyl grøn, skylles i demineraliseret vand, og lufttørret. Mikrodissektion blev udført under anvendelse af en MD LMD laser microdissecting mikroskop (Leica). Tumorceller (~5,000) blev dissekeret i hvert tilfælde. RNA blev isoleret, ekstraheret og oprenset som tidligere beskrevet [15]. For at skabe tilstrækkelig cRNA til microarray analyse blev en to-cyklus forstærkning protokol (Affymetrix) udnyttet, der tidligere er blevet beskrevet [16].

microarray analyse

Alle vifte data Mindste Information om en Microarray Experiment (MIAME) kompatibel og de rå data er blevet deponeret i en MIAME kompatibel database (GEO, tiltrædelse nummer: GSE29450)

data normalisering

Global normalisering på en målværdi på. 500 blev anvendt på alle 20 af de arrays under overvejelse hjælp Gene Chip Operating Software (Affymetrix). Normaliserede data blev uploadet til National Cancer Institute microarray analyse Database (MADB) til kvalitetskontrol screening og sammenstilling før downstream analyser (https://nciarray.nci.nih.gov/index.shtml). Biometrisk Research Branch (BRB) ArrayTools udgave 3.2.2 software udviklet af Drs. Richard Simon og Amy Peng Lam af Biometrics Research Branch af National Cancer Institute blev brugt til at filtrere og færdiggøre den statistiske analyse af array data. BRB-ArrayTools er et multifunktionelt Excel-tilføjelsesprogram, der indeholder værktøjer til bearbejdning og analyse af microarray data ved hjælp af R-version 2.0.1 miljø (R Development Core Team, 2004). Hybridisering kontrol probe sæt og probe sæt scoret som fraværende på α1 = 0,05 eller marginal (M) ved α2 = 0,065 blev udelukket. Desuden blev kun de transkripter til stede i mere end 50% af grupperingerne og visning en varians i den øverste 50-percentilen evalueret.

Class sammenligning gen ontologi, og pathway-analyse.

A flerdimensional permutation test i BRB ArrayTools blev anvendt til at identificere differentielt udtrykte gener. En liste over probesets indeholder 10% falsk positive ved en tillid på 95% blev opnået efter i alt 2.000 permutationer. Differential udtryk blev betragtet signifikant på en p-værdi på 0,001. En tilfældig varians

t

test og global vurdering blev udført som tidligere beskrevet [16].

For at identificere særlige funktionelle kategorier af gener, der var stærkt beriget med CCOC, vi identificeret genet ontologi ( GO) kategorier, der var statistisk signifikant på listen over differentielt regulerede gener. En Hotelling T-square test blev udført for at identificere væsentlige GO kategorier. For at identificere signalveje involveret i CCOC blev genet liste, der blev genereret fra microarray analyse importeres til PathwayStudio software (Ariadne Inc, Rockville, MD).

Kvantitativ RT-PCR

kvantitativ real-time PCR blev udført for de 10 clear cell ovariecancer prøver og de 10 OSE prøver. 50 ng af dobbelt-forstærkede produkt blev brugt fra alle 20 prøver ved hjælp af primer sætter specifikke for 12 udvalgte gener og husholdning generne GAPDH, GUSB, og cyclophillin. En iCycler iQ Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad, Hercules, CA) blev anvendt i forbindelse med One-Step QRT-PCR med SYBR Green kit (Invitrogen Life Technologies, Inc., Carlsbad, CA) ifølge tidligere beskrevet cykelforhold [17]. For at beregne den relative ekspression for hvert gen, blev 2

-ΔΔCT metode gennemsnittet af C

T værdier for de tre husholdning gener.

cellelinjer og dyrkningsbetingelser

de humane klar celle ovariecancer cellelinier ES-2, blev TOV21G, og RMG1, og de serøse cellelinier OVCA 420 og OVCA 432 holdes i en 01:01 blanding af medium 199 (Invitrogen Life Technologies, Inc. Carlsbad, CA) og medium 105 (Sigma, St. Louis, MO) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% L-glutamin. De humane serøse ovariecancer cellelinier SK-OV-3 og OVCAR-3 blev opretholdt i RPMI 1640 (Invitrogen Life Technologies) suppleret med 10% FBS og 1% L-glutamin. CaOV3 og OVCA 429 celler blev holdt i DMEM (Invitrogen Life Technologies) suppleret med 10% FBS og 1% L-glutamin. ES-2, blev TOV21G, SKOV3, OVCAR3 CaOV3 og RMG1 cellelinjer købt fra American Type Culture Collection og japansk Indsamling af Research Bioressourcer. OVCAR 420, OVCAR 432 og OVCA 429 blev opnået fra Laboratoriet for Gynækologisk onkologi på Brigham and Women ‘s Hospital [18].

Hypoxi /glucose afsavn betingelser

Cells fra klar celle og serøse æggestokkene oprindelser blev udpladet og anbragt under betingelserne for normoxi med DMEM, 10% FBS, 1% L-glutamin eller hypoxi med glucose DMEM, 10% FBS, 1% L-glutamin (Invitrogen Life Technologies). Hypoxi blev frembragt ved at skylle en inkubator (Thermo Forma serie II, Thermo Fischer Scientific, Inc., Waltham, MA) med nitrogen til opnåelse af en blanding af 1% O

2, 5% CO

2, og 94% nitrogen. Inkubatoren blev holdt ved 37 ° C.

celleproliferation assays

cancercellelinier blev podet i plader med 96 brønde i 8 gentagelser (ES-2, TOV21G, OVCA 420, SK- OV-3, OVCAR-3, OVCA-420, OVCA-429: 5 × 10

2 celler per brønd, CaOV3, OVCA-432, RMG1: 1 × 10

3 celler /brønd) og anbringes i enten betingelser for normoxi med medier indeholdende normal glukose (NN) eller hypoxi /glucose deprivation (HG) i 24, 48 og 72 timer. Efter disse perioder blev relative antal af levedygtige celler målt ved anvendelse af fluorometriske, resazurin-baserede Cell Titer Blå assay (Promega, Madison, WI) ifølge producentens instruktioner ved 560

Ex /590

Em nm i et Victor3 multi-label counter (PerkinElmer, Tyskland). Fordobling tider for hver cellelinje under hver betingelse blev beregnet under anvendelse Prism 4,02 Software (Graph Pad, San Diego, USA). Fold ændring i fordoblingstid på hypoxi /glucose deprivation sammenlignet med normale betingelser blev beregnet, og gennemsnittet for hver cellelinie over to eksperimenter. Gennemsnitlig fold ændring blev beregnet for de serøse cellelinjer og klare cellelinier og sammenlignet.

Cell cykling assay

Status cellecyklus af ES-2 og OVCA 420 celler blev sammenlignet i de betingelser, af normoxi og hypoxi /glucosemangel ved flowcytometri. Kort beskrevet 7,5 × 10

4 ES2 celler og 2,0 x 10

5 OVCA420 celler blev podet i 60 mm

2 plader i tre eksemplarer og fik lov at inkubere natten over. Mediet blev ændret på den næste dag, og cellerne blev anbragt under de ovennævnte betingelser. Efter 48 timers inkubation (normoxi ved 37 ° C eller hypoxi /glucose deprivation ved 37 ° C), blev medierne og adhærente celler opsamlet og centrifugeret ved 1500 χg i 5 minutter. Pelleten blev vasket i 2 ml phosphatpufret saltvand (PBS) og centrifugeret ved 1500 χg i 5 minutter. Cellerne blev resuspenderet i 200 pi kold PBS. 2 ml iskold 70% ethanol blev tilsat, og cellerne blev inkuberet på is i 30 minutter for at permeabilisere. Cellerne blev derefter centrifugeret ved 1500 χg i 10 minutter. Supernatanten blev dekanteret og 900 pi stuetemperatur PBS blev anvendt til at resuspendere cellerne. 100 pi RNAse A (10 mg /ml, Worthington Biochemical Corp., Lakewood, NJ) og 10 pi propidiumiodid (1 mg /ml, Sigma) blev tilsat, og rørene blev derefter inkuberet ved 37 ° C i 30 minutter , undgå lys. DNA-indhold blev bestemt ved flowcytometri (FACSCalibur, Becton, Dickinson, og Company, Franklin Lakes, NJ) og histogrammer for DNA indhold blev analyseret ved hjælp FlowJo 7.2 (Tree stjerne, Inc., Ashland, OR) til at karakterisere befolkningen fraktioner i hver fase af cellecyklussen.

caspase-3-assay

de direkte målinger af caspase 3-aktivitet blev foretaget under anvendelse af et caspase-3 fluorometrisk-kit (Invitrogen Life Technologies). Kort fortalt, 2,0 × 10

5 OVCA420 celler blev podet i 60 mm

2 plader og fik lov at inkubere natten over. På dag 0 blev mediet udskiftet, og pladerne blev derefter anbragt i betingelserne for normoxi /normal glukose eller hypoxi /glucosemangel. Celler blev opsamlet ved 24, 48 og 72 timer. Cellerne blev opsamlet, pelleteret, resuspenderet i 50 pi kølet Cell Lysis Buffer, og inkuberet på is i 10 minutter. Proteinkoncentrationen blev bestemt ved BCA-proteinassay (Pierce, Rockford, IL). 50 pi 2 x Reaction Buffer og 10 mM DTT blev tilsat til hver 50 pi alikvot af cellelysat. 5 pi af 1 mM DEVD-AFC substrat blev derefter tilsat til hver prøve og samtidig undgå lyset. Prøverne blev derefter inkuberet ved 37 ° C i 1 time i mørke. MEF celler (60 mm plade, 80% konfluente) behandlet med 10 pi cycloheximid og 30 ng TNFa blev anvendt som en positiv kontrol. Fluorescens blev derefter vurderet i en Victor3 multi-label counter (PerkinElmer, Tyskland) med 405

Ex /535

Em nm filtre. Stigningen fold i Casase-3-aktivitet blev bestemt ved relativ fluorescens pr ug protein.

Nekrose assay

For at analysere for tilstedeværelsen af ​​nekrose, den CytoTox-ONE ™ homogen membran integritet assay blev anvendt som anbefalet af producenten (Promega). Denne analyse måler frigivelse af LDH fra celler med beskadigede membraner. Kort fortalt, 5 × 10

3 OVCA-420 celler blev udpladet i en plade i tre eksemplarer 96. Mediet blev ændret den næste dag, og cellerne blev anbragt i betingelserne i enten normal oxygen /normal glukose eller hypoxi /glucose deprivation. 48 timer senere blev pladerne fjernet fra inkubatoren og ækvilibreret til 22 ° C. For at generere en Maximum LDH-frigivelse kontrol blev 2 pi lyseopløsning tilsat til kontrolbrøndene anbragt i normal oxygen /normal glukose. 100 pi CytoTox-ONE ™ Reagent blev tilsat til hver brønd. Efter 10 minutters inkubering ved 22 ° C blev 50 pi Stop Solution tilsat til hver brønd. Pladerne blev rystet i 10 sekunder. Fra hver brønd blev 100 pi overført til en uigennemsigtig plade og fluorescens blev registreret ved 560

Ex /590

Em nm i et Victor3 multi-label counter (PerkinElmer, Tyskland). Efter fratrækning dyrkningsmediet baggrund blev procent cytotoksicitet beregnet af dividere den eksperimentelle fluorescens ved Maximum LDH Slip fluorescens.

Behandling af cellelinjer med siRNA oligonukleotider

Knockdown af HIF1 α og Enolase 1 blev udført under anvendelse siRNA oligonukleotider (Qiagen, Inc.). En omvendt transfektionsprotokol blev udført under anvendelse Oligofectamine (Invitrogen Life Technologies, Inc) som anbefalet af fabrikanten i en 96-brønds pladeformat. For hver brønd blev 50 nM siRNA og 0,5 pi Oligofectamine transfektionsreagens fortyndet i 50 pi serum-frit DMEM og fik lov til at inkubere ved stuetemperatur i 30 minutter. ES-2-celler, TOV-21G-celler og RMG-1-celler blev podet i en 96-brønds plade ved 1,0 × 10

4-celler, 2,0 x 10

4-celler og 5,0 x 10

4 brønd hhv. Scrambled siRNA blev anvendt som en negativ kontrol. 48 timer efter transfektion blev mediet erstattet med glucose-DMEM, og cellerne blev anbragt under betingelserne for hypoxi. Væksten blev vurderet ved 0 og 24 timer af Cell Titer Blå assay (Promega). Spredning assays for ES2 og TOV21G cellelinjer blev udført med 75 nM siRNA for 24, 48 og 72 timer efter transfektion.

In vivo

reduktion på ENO1 eller HIF1 α bruge siRNA-DOPC med eller uden sunitinib hæmmer CCOC tumor progression i athymiske nøgne mus

Kvindelige athymiske nøgne mus blev købt fra National Cancer Institute, Frederick Cancer Research og Development center (Frederick, MD). ES2 celler blev trypsiniseret, vasket og resuspenderet i Hanks balancerede saltopløsning (Gibco, Carlsbad, CA) og injiceret intraperitonealt i mus (1 x 10

6 celler /mus). For at nedregulere Enolase og HIF1 α in vivo, blev den respektive siRNA anvendes. Ikke-targeting, ikke-specifik sekvens 5′-ATT TCT CCG AAC GTG TCA CGT-3 ‘blev anvendt som kontrol, mens de humane-specifikke sekvenser blev anvendt til Enolase (5’-GCG CAT TGG AGC AGC AGA GGT TTA3 «) og HIF -1 α (5 ‘CAG TTG TCA CCA TTA GAA A-3’). Disse målspecifikke siRNA’er blev indkøbt fra Sigma-Aldrich og fremstillet som tidligere beskrevet [19], [20]. Det frysetørrede DOPC indarbejdet siRNA blev hydreret med PBS og injiceret intraperitonealt to gange om ugen efter vores tidligere offentliggjorte protokoller [21] på 5,0 mg siRNA /200 ml suspension. Det samme volumen af ​​PBS injicerede intraperitoneal blev anvendt som kontrol.

SU11248 /sunitinibmaleat (Sutent, Pfizer) blev suspenderet i carboxymethylcellulose køretøj formulering indeholdende natriumcarboxymethylcellulose (0,5% vægt /volumen), NaCl (1,8% vægt /volumen) Tween 80 (0,4% vægt /volumen), benzylalkohol (0,9% vægt /volumen), og omvendt osmose deioniseret vand (tilsat til slutvolumen) og indstillet til pH 6,0 som tidligere beskrevet [22]. Sunitinib struktur og aktivitet er tidligere blevet beskrevet [23]. Drug portioner blev forberedt en gang om ugen og holdt i mørke ved 4 ° C. Mus blev behandlet med 40 mg /kg i 200 pi køretøj ved tvangsfodring en gang dagligt. Daglig sondeernæring med vehikel alene blev anvendt som kontrol. Syv dage efter ES2 celle injektion blev musene tilfældigt inddelt og behandlet med kontrol, Enolase eller HIF1 α siRNA-DOPC ± sunitinib (n = 10 /gruppe). Behandling blev fortsat i 3 uger, på hvilket tidspunkt alle mus i eksperimentet blev aflivet og obduceret, og tumorer blev høstet. Tumorvægt og knuden optælling blev registreret. Tumorvæv blev frosset i optimal skæring temperatur (OLT) medier til at forberede frosne dias til efterfølgende CD31 farvning.

immunhistokemisk farvning for CD31

immunhistokemisk farvning for CD31-antigenet blev udført på frosne dias til at evaluere tumor mikrokar densitet (MVD). Objektglas blev fikseret i kold acetone i 10 minutter. Endogen peroxidase blev blokeret med 3% H

2O

2 i methanol og ikke-specifikke epitoper blev blokeret med 5% normalt hesteserum og 1% normalt gedeserum. Objektglas blev derefter inkuberet med anti-muse CD31 (1:800 fortynding, PharMingen San Diego, CA) ved 4 ° natten over. Efter vask med PBS, blev det passende HRP-konjugeret sekundært antistof i blokeringsopløsning tilsat i 1 time ved stuetemperatur. Objektglas blev fremkaldt med 3, 3 “-diaminobenzidine (DAB) chromogen (Invitrogen, Carlsbad, CA) og modfarvet med Gil No. 3 hematoxylin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). MVD blev beregnet ved at se 10 repræsentative 200 × felter pr dias i hver behandlingsgruppe og tælle antallet af mikrokar pr felt. En mikrokar blev defineret som en åben lysning med mindst en CD31-positiv celle umiddelbart ved siden af ​​den.

Differentiel virkning af sunitinib på transplanterbare patient-afledt ovariecancer tumorer

Seks til otte uge gamle kvindelige NOD-SCID mus blev opdrættet af BC Cancer Research Centre Animal Resource Centre, BC Cancer Agency, Vancouver, Canada. Mus blev huset under specifikke, patogenfrie betingelser i sterile filter-top bure i højeffektiv partikler luft-filtrerede ventilerede stativer, og modtog sterilt gnaverfoder og vand. Kræft i æggestokkene vævsprøver blev opnået med informeret samtykke fra patienter, der gennemgår bilateral salpingoophorectomy på Vancouver General Hospital. Kort fortalt, for at udvikle transplanterbare cancer væv linjer, blev friske vævsprøver skæres i små stykker og podet ind i subrenal kapsel-stedet i NOD-SCID-mus for efterfølgende seriel transplantation og karakterisering som beskrevet tidligere [24], [25]. Et panel af æggestokkene kræft væv xenograftmodeller, dvs. tre serøse carcinom væv linjer (LTL237, 247 og 259) og en klar celle karcinom væv linje (LTL175) (https://livingtumorlab.com/PDC_Ovarian.html), blev anvendt.

for sunitinib effektstudier, 96 stykker af væv (4 × 2 × 1 mm

3) fra xenografter af hver etablerede tumorvæv linje blev podet under renale kapsler af 24 kvindelige NOD-SCID-mus, som tidligere beskrevet [25]. Hvornår blev veletableret implantaterne, og nåede en gennemsnitlig volumen på omkring 20 til 50 mm

3 [24], [25], dyrene blev sorteret i fire grupper (6 mus /gruppe, 2 grafts per nyre). Behandling opgaver var at sunitinib eller inaktiv køretøj (negativ kontrol). Sunitinib blev administreret som en 0,5% carboxymethylcellulose suspension under anvendelse af en dosis på 40 mg /kg legemsvægt (oralt, én gang dagligt i to uger) fundet effektive til en række forskellige muse xenograftmodeller, som beskrevet andetsteds [26]. Musene blev forsynet med foder og vand

ad libitum

og overvåget dagligt for ændringer i generelle sundhed og tegn på stress, herunder vægttab, diarré, ændringer i mad /vandindtagelse, udseende (krum stilling, sunkne øje , besværet vejrtrækning) og adfærd (sløvhed). Virkninger på tumorvækst blev vurderet ved måling af tumorvolumen ved obduktion hjælp skydelærer og formlen: Volumen (mm

3) = 0,52 x længde x bredde x højde (i mm), som tidligere beskrevet [25] og ved histokemisk analyse af tumor vævssnit (se nedenfor).

Måling af tyrosinphosphorylering af VEGFR2 og PDGFRβ i xenotransplantater via Western blotting

Inden 2 timer af den sidste administration af sunitinib i de ovennævnte undersøgelser af effekten, xenografter fra behandlede og kontrolmus blev lynfrosset i flydende nitrogen og opbevaret ved -80 C til efterfølgende anvendelse. Lysater blev fremstillet ved homogenisering af væv med kold lysepuffer (50 mM HEPES pH 7,5, 150 mM NaCl, 1,5 nM MgCl

2, 10% v /v glycerol, 1% Triton X-100, 1% natriumorthovanadat, 2 mM NaF, 2 ug /ml aprotinin, 2 ug /ml leupeptin og 2 ug /ml pepstatin-A) som beskrevet andetsteds [26]. For immunopræcipitation blev proteinmængder justeret til 500 ug. Proteiner blev afrenset med protein A-Sepharose (katalog nr. 16-125, Upstate Biotechnology Inc., Lake Placid, NY) i 15 minutter ved 4C. Supernatanter (1 ml) blev inkuberet med 4 ug kanin-anti-VEGFR2 (katalog nr. 07-716) eller anti-PDGFRβ (katalog nr. 05-825) antistoffer (Upstate Biotechnology Inc.) i 90 minutter ved 4C og, efter tilsætning af 25 pi 50% (v /v) Protein A-Sepharose, yderligere inkuberet i 60 minutter ved 4C. Antigen-antistof-perle-komplekser blev vasket mindst tre gange med lyseringsbuffer efterfulgt af tilsætning af 25 pi loading buffer og kogning i 1 min for proteineluering. Proteiner blev adskilt ved 5% SDS-PAGE-gel og derefter overført på PVDF membran til detektion af phosphoryleret tyrosin anvendelse af et monoklonalt muse-antistof til phosphotyrosin (katalog nr. Sc-7020, Santa Cruz Biotechnology Inc.). Membraner blev efterfølgende strippet og testet igen til detektion af total VEGFR2 og PDGFRβ anvendelse af de samme antistofpræparater anvendes til immunopræcipitation.

Apoptose detektion

Paraffin vævssnit (5 um tykke) blev undersøgt ved TUNEL assay (ApopTag® Apoptose Detection Kit, Chemicon, Temecula, CA) som tidligere beskrevet (26). Kort fortalt blev snit inkuberet i 15 minutter med 20 ug /ml proteinase K ved stuetemperatur og derefter vasket grundigt i destilleret vand. DNA-fragmenter fremstillet ved den apoptotiske proces blev tagget med digoxigenin nukleotider via en 60 minutters inkubation ved 37 ° C med terminal deoxynucleotidyltransferase (TdT) i et fugtigt kammer. Snittene blev derefter skyllet og inkuberet i 30 minutter ved stuetemperatur med anti-digoxigenin konjugeret med fluorescein. Efter modfarvning med 4′-6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) blev objektglassene undersøgt for procentdelen af ​​fluorescein-mærkede celler under anvendelse af et Zeiss Axioplan-2 fluorescensmikroskop.

Histologi, immunhistokemi, og mikrokar densitet estimering

Fremstilling af paraffinindlejrede vævssnit, deres farvning og immunohistokemiske analyser blev udført som tidligere beskrevet (23, 24). Anti-von Willebrand-faktor VIII-antistof (katalog nr. A0082, DAKO Diagnostics Canada Inc .; 1:200) blev anvendt til identifikation af mikrokar. Alle vævssnit blev let modfarvet med 5% (w /v) Harris hematoxylin (H 0,05, undtagen for microarray analyse, hvor signifikans blev sat til p 0,001

Resultater

hele genomet ekspressionsprofiler af mikrodissekeret CCOC identificerer differentielt udtrykte gener

de genekspression mønstre af RNA isoleret fra epitel komponent i 10 klare celle kræft i æggestokkene prøver isoleret ved laser capture mikrodissektion blev sammenlignet med tilsvarende isoleret RNA fra 10 normale æggestokkene overflade epitel prøver vha Affymetrix U133 plus 2 arrays. Efter normalisering og indledende analyse, 16,013 informative probesets passerede filtrering kriterier. Ved hjælp af en flerdimensional permutationstest leverer 95% sikkerhed, at antallet af falske opdagelser ikke oversteg 10%, 3.288 probesets for 2.559 gener fandtes at være differentielt reguleret, defineret af en 1,5-fold eller større forskel i ekspression med en statistisk signifikans på p & lt 0,001. Grafisk repræsentation af denne differentiel genekspression kan ses i figur 1a. For at validere microarray data blev 12 gener, der blev differentielt udtrykte tilfældigt udvalgt for QRT-PCR-analyse. Ti af de 12 gener blev differentielt udtrykt på QRT-PCR, hvilket giver en samlet microarray validering på 83% (figur 1b, c og tabel S1).

(a) Grafisk repræsentation af hele genomet ekspression profilering af Clear celle kræft i æggestokkene Specimen (CCOC) og æggestokkene overfladeepitelet (OSE). (B) og (c) Sammenligning af QRT-PCR-data og microarray data for de seks overudtrykt og fire underexpressed gener anvendes til validering (d) Pathway analyse af differentielt regulerede gener identificeret i den klare celle ovariecancer microarray. Gener der indgår i analysen skulle have en fold ændring ≥1.5. Multiple probesæt blev midlet til hvert gen.

Red

, gen opreguleret.

Blå

, gen nedreguleres.

Identifikation af aktiverede veje i CCOC

For at identificere aktiverede veje til stede i CCOC, funktionelle kategorier af differentielt udtrykt gener blev identificeret under anvendelse gen ontologi (GO) analyse. Statistisk signifikante kategorier demonstrerer et stort antal gener involveret i kulhydratmetabolismen, glucosemetabolisme, glycolyse, og udvikling af blodkar (tabel 1). De 3.288 probesets og deres tilhørende relative udtryk data sammenlignet med OSE blev importeret til PathwayStudio 6.0 software. Veje er involveret i angiogenese, koagulation, glukosemetabolismen, celledeling, og celle motilitet var tydelige (figur 1d). For eksempel HSPCA, som har vist sig at stabilisere HIF1α (27), viste sig at være overudtrykt.