PLoS ONE: metabolomiske Profilering afslører en rolle for Androgen i Aktivering Amino Acid Metabolism og Methylering i Prostata Cancer Cells

Abstrakt

Prostatakræft er den næststørste årsag til kræft dødsfald i amerikanske mænd. Udvikling og progression af klinisk lokaliseret prostatacancer er meget afhængig af androgen signalering. Metastatiske tumorer indledningsvist responderer på anti-androgen terapi, dog bliver resistente over for denne kur ved progression. Genomiske og proteomiske undersøgelser har impliceret en rolle for androgen i regulering metaboliske processer i prostatacancer. Imidlertid har der ikke været nogen metabolomiske profilering undersøgelser hidtil der har undersøgt androgen-regulerede biokemiske processer i prostatacancer. Her har vi brugt fordomsfri metabolomiske profilering kombineret med berigelse-baserede bioproces mapping for at få indsigt i de biokemiske ændringer medieret af androgen i prostata cancer cellelinjer. Vores resultater viser, at androgen eksponering resulterer i elevation aminosyre metabolisme og ændring af potentiel methylering i prostata kræftceller. Endvidere metaboliske fænotypebestemmelse undersøgelser bekræfter højere flux gennem pathways associeret med aminosyremetabolismen i prostatacancerceller behandlet med androgen. Disse resultater giver indsigt i de potentielle biokemiske processer reguleres af androgen signalering i prostatakræft. Klinisk, hvis de er valideret, disse veje kunne udnyttes til at udvikle terapeutiske strategier, der supplerer nuværende androgen ablative behandlinger, mens de observerede androgen-regulerede metaboliske signaturer kan anvendes som biomarkører, der varsler udvikling af kastrationsniveau-resistent prostatacancer.

Henvisning: Putluri N, Shojaie A, Vasu VT, Nalluri S, Vareed SK, Putluri V, et al. (2011) metabolomiske Profilering lancerer en rolle for Androgen i Aktivering Amino Acid Metabolism og Methylering i prostata cancer celler. PLoS ONE 6 (7): e21417. doi: 10,1371 /journal.pone.0021417

Redaktør: Jean-Marc Vanacker, Institut de Génomique fonctionnelle de Lyon, Frankrig

Modtaget: December 10, 2010; Accepteret: 1 Juni 2011; Udgivet: 18 Juli 2011

Copyright: © 2011 Putluri et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde understøttes delvist af National Cancer Institute giver RO1CA133458-04 (AS), en R03 CA139489-01 (AS) og RCA145444A (AS), den Doris Duke Foundation og Molekylær fænotype Core og DK089503 (alle til SP). AS er støttet af Georgia Cancer Research Distinguished Scientist award. Projektet blev også støttet af Agilent Technologies, der har givet vejledning om metodologi. TS og SF er ansat med Agilent Technologies. Ingen yderligere eksterne midler modtaget for denne undersøgelse

Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Prostatakræft (PCA) er den hyppigste fast. orgel malignitet diagnosticeret hos mænd i USA og er den næststørste årsag til kræft dødsfald i amerikanske mænd [1]. Androgen og androgen receptor (AR) spiller en vigtig rolle i udviklingen og progressionen af ​​PCa, og androgen ablation er en af ​​de vigtigste terapeutiske muligheder for behandling af lokalt fremskreden eller metastatisk PCa [2]. Næsten 90% af alle patienter med metastatisk prostatacancer oprindeligt reagere på kastration-induceret androgen tilbagetrækning; men denne behandling er ofte effektive i mindre end 2 år og derefter udvikler sig til en kastrationsresistent tilstand (kastrere resistent prostatacancer, CRPC). CRPC er en dødelig sygdom. [3]. På trods af sin klinisk resistens over for androgen deprivation terapi, CRPC udtrykker AR [4] og udviser aktiv androgen signalering gennem ikke-traditionel aktivering af androgenreceptoren signalering akse [5]. Dette illustreres bedst ved observation af stigende niveauer af serum prostata specifikt antigen (PSA), som er en androgen reguleret protein og i øjeblikket anvendes som en markør for biokemisk tilbagefald af tumor, til trods for udviklingen af ​​CRPC [6]. Det er stadig diskuteres, om denne AR-aktivitet i CRPC medieres af højaffinitetsreceptorer, som er følsomme over for lave niveauer af cirkulerende androgener eller, om receptor gevinster evnen til promiskuøst interagere med andre steroidhormoner [4], [7], [8]. Sidstnævnte understøttes af undersøgelser, der har beskrevet en hyppig mutation (T877A) inden for hormon-bindende domæne af AR, der gør det eftergivende for bindende andre steroidhormoner og derved overvinde et specifikt krav for androgener [9], [10], [11 ]. Vigtigere men der er ingen markører øjeblikket er til rådighed, for at forudsige, om svulsten vil udvikle sig til en kastrat resistent tilstand. Således en forståelse af de molekylære ændringer, der skyldes androgen virkning i prostatacancer er afgørende. Flere grupper har afhørt androgen-regulerede ændringer på transkriptomet og proteomanalyse niveauer i PCA-cellelinjer, ved hjælp af genekspression arrays og massespektrometri [12], [13], [14], [15], [16], [17], [18]. En sådan skelsættende forsøg med Affymetrix oligonucleotid arrays fremhævet sammenslutningen af ​​androgen signalering i PCA celler med metaboliske processer, der er forbundet med stressreaktioner [19]. Endvidere androgen-drevet proliferation af PCA-celler er blevet vist, at involvere aktiveringen af ​​mammalian target of rapamycin (m-TOR) [20], [21], [22], [23] der i sig selv er følsom for metaboliske forstyrrelser i tumor [24], [25]. På trods af denne forening, der er begrænset indsigt i de biokemiske forandringer fremkaldt af androgen indsats på PCA celler. Brug af integrativ analyse af matchede genekspression og proteom data, tidligere vi havde forudsagt aktiveringen af ​​aminosyremetabolismen i androgen-behandlede LNCaP (androgen følsomme) prostatacancerceller [26]. Denne forventning blev yderligere styrket af metabolomiske profilering af PCA væv, der afslørede aminosyremetabolismen som værende et af kendetegnene for tidlig tumor udvikling [27]. Her beskæftiger vi massespektrometri-baseret profilering af metabolomet af androgen-behandlede PCA celler, udpege ændrede metabolitter, identificere og validere biokemiske veje og vurdere hormonet tilhørende signatur i patient-afledte væv. Vores resultater indikerer androgen-induceret forøgelse af aminosyremetabolismen og ændring af potentiel methylering i PCA-celler, som begge bekræfte vores tidligere fund under anvendelse patient-afledt lokaliserede og metastatiske PCA væv [27].

Metoder

cellelinjer

Prostata cellelinier (Immortaliserede benign – RWPE, androgen-ikke-responsive – PC3, DU145 og androgen-responsive – VCap, og LNCaP) blev indkøbt fra American Type Culture Collection (ATCC , Manassas, VA). RWPE celler blev dyrket i keratinocyt-SFM medium (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA) suppleret med 5 ng /ml epidermal vækstfaktor (EGF) og 50 ug /ml bovint pitutary ekstrakt (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA). VCap celler blev dyrket i DMEM-Glutamax medium (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS; Hyclone Labs, Thermo Scientific, Rockford, IL) og 1% penicillin-streptomycin (Hyclone Labs, Thermo Scientific , Rockford, IL). DU145 celler blev dyrket i Minimum Essential Media (MEM) (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA) suppleret med 10% FBS (Hyclone Labs, Thermo Scientific, Rockford, IL), 1% penicillin-streptomycin (Hyclone Labs, Thermo Scientific, Rockford , IL) og 1% HEPES (Hyclone Labs, Thermo Scientific, Rockford, IL). PC3 og LNCaP-celler blev dyrket i RPMI-1640-medier (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA) tilsat 10% føtalt bovint serum (FBS; Hyclone Labs, Thermo Scientific, Rockford, IL) og 1% penicillin-streptomycin (Hyclone Labs , Thermo Scientific, Rockford, IL) .. Alle celler blev holdt ved 37 ° C og 5% CO

2.

Androgen (R1881) behandling

Samme antal VCap celler udpladet og dyrket til 60% sammenflydning i DMEM-Glutamax medium som beskrevet ovenfor. Medium blev derefter erstattet i to dage ved phenol-rød frit RPMI-1640 medium suppleret med 10% trækul-strippet FBS og 1% penicillin-streptomycin (Hyclone Labs, Thermo Scientific, Rockford, IL). Et sæt celler blev behandlet med 10 nM syntetisk androgen, methyltrienolone (R1881, Perkin Elmer, Waltham, MA), i enten 24 eller 48 timer, hvorimod vehikelbehandlede celler (behandlet med ethanol) tjente som kontroller. Ved afslutningen af ​​behandlingen blev celler, trypsiniseret, pelleteret, vasket med 50 mM phosphatpufret saltopløsning (PBS, pH 7,4) og opbevaret ved -140 ° C indtil yderligere analyser.

Prøveforberedelse for masse spectrometry- baseret undersøgelse af metabolomet i cellelinjer

Massespektrometri-baserede metabolomics profilering blev udført på frosne prostata cellepellets (~ 10 millioner celler). Processen med metabolit ekstraktion involverede indføring af ækvimolær blanding af 11 faste forbindelser opløst i methanol (Epibrassinolide, [D

3] Testosteron, [

15N] Anthranilsyre, Zeatine, Jasmonsyre, Gibberelic carboxylsyre, [D

4] estron, [

15N] -tryptophan, [D

4] thymin, [

13C] Kreatinin og [

15N] Arginin) efterfulgt af homogenisering af cellerne. Homogenatet blev derefter underkastet ekstraktion med sekventiel anvendelse af vandig (kølet vand) og organiske (kølede methanol og chloroform) opløsningsmidler i følgende forhold 1:4:3:1 (water:methanol:chloroform:water) [28]. De resulterende ekstrakter blev de-proteinized anvendelse af en 3 KDa molekylær filter (Amicon Ultracel -3K Membrane, Millipore Corporation, Billerica, MA), og filtratet indeholdende metabolitter blev tørret under vakuum (Genevec EZ-2

plus, Gardiner, NY) . Før massespektrometri-analyse blev det tørrede ekstrakt resuspenderet i samme volumen af ​​injektion opløsningsmiddel sammensat af water:methanol (50:50) med 0,2% eddikesyre og underkastedes væskekromatografi (LC) massespektrometri. Som yderligere kontroller til at overvåge profilering proces, en ækvimolær blanding af 11 standard forbindelser (Epibrassinolide, [D

3] Testosteron, [

15N] Anthranilsyre, Zeatine, Jasmonsyre, Gibberelic syre, [D

4] østron, (

15N) tryptophan, [D

4] thymin, [

13C] kreatinin, og [

15N] Arginin) og en karakteriseret pulje af muselever (udvundet i tandem med cellelinjer) blev analyseret sammen med cellelinien prøver. Hver af disse kontroller, blev inkluderet flere gange i randomisering ordning, at prøverne forberedelse og analytisk variation kunne overvåges konstant. Endvidere analyse af hver cellelinje blev efterfulgt af mindst to tomme kørsler, for at forhindre enhver fremførsel af metabolitter mellem prøver. Figur S1 illustrerer reproducerbarheden i profileringsprocessen følges under standard blanding beskrevet ovenfor. Navnlig CV for hele profileringsprocessen målt ved anvendelse fem uafhængige gentagelser af museleveren ekstrakt nævnt ovenfor var mindre end 5%.

væskekromatografi /massespektrometri (LC /MS)

LC /MS delen af ​​saglig profilering platformen er baseret på en 1200 SL hurtig opløsning LC og en 6520 Quadrapole Time of Flight (Q-TOF) massespektrometer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Prøverne blev uafhængigt undersøgt i både positive og negative ionisering tilstande under anvendelse af en dobbelt elektrosprayionisering (ESI) kilde. Tidstro masse korrektion under massespektrometri blev opnået ved infusion af en standardblanding af referencematerialer ioner under anvendelse af en uafhængig 1200 SL Rapid resolution LC isokratisk pumpe udstyret med 100:1 splitter til output en strømningshastighed på 5 ul /min. Denne henvisning blanding leveret af sælger indeholdt ioner med

m /z

121.050873, 922.009798 og 119,03632, 966,000725 for masse korrektion i den positive (+) og negative (-) ionisering modes hhv. En masse interval mellem 50-1000 m /z var ansat for hele fordomsfri profilering processen. Købet af data under analysen blev styret ved hjælp af Mass Hunter erhvervelse arbejdsstation data software. De parametre, der anvendes under den massespektrometri omfattede følgende: 1) Kilde betingelser: kapillær spænding, 4000 V (negativ tilstand 3500 V), 2) kilde temperatur var 325 ° C, 3) tørring gas blev anvendt ved 10 l /min 4) , nebulizer trykket blev holdt ved 45 psig (anmodning ion forstøver 10 psig), 5) fragmentor spænding blev fastsat til 140, og 6) skimmer spænding blev holdt ved 65 V. for hele analysen, blev ultrahøj rent nitrogen anvendes som forstøver og kollision gas. For kollision induceret dissociation (CID) forsøg blev precursor ion valgt med kvadrupol analysatoren indstillet til højopløsningstilstand mens produkt ioner blev analyseret af TOF-analysatoren. De kollisionsenergier i alle forsøgene blev indstillet mellem 10-40 eV medmindre andet er angivet. Spektrene for de analyserede i denne undersøgelse prøver blev registreret under identiske eksperimentelle betingelser. LC opløsningsmidler anvendt til hele undersøgelsen blev købt hos Burdick Jackson (Muskegon, MI), og anvendt uden yderligere oprensning.

omvendt fase (RP) kromatografisk separation på LC-QTOF ansat en gradient under anvendelse af vand (opløsningsmiddel A) og methanol (MeOH, opløsningsmiddel B) ( begge opløsningsmidler blev modificeret ved tilsætning af 0,2% eddikesyre). Den binære pumpe Strømningshastigheden var 0,6 ml /min med en indledende sammensætning af 2% B. Gradienten blev drevet fra 2% B til 98% B i løbet af en 13 minutters periode opløsningsmiddel efterfulgt af 98% B i 6 minutter og 5 minutter efter (analysen) tid. En søjle system bestående af en forkolonne Zorbax SB-C8 (2,1 x 30 mm, 3,5 um) og analytisk søjle Zorbax SB-AQ (Agilent Technologies, CA) (2,1 x 50 mm, 1,8 um,) blev anvendt til at udføre omvendt fase separation. Kolonnen Temperaturen blev holdt ved 60 ° C under hele den kromatografiske proces. Endvidere blev alle prøver holdt ved 4 ° C forud for deres massespektrometri-baserede metabolomiske analyse. Mass spektrale data blev erhvervet i både geometriske tyngdepunkt og profil modes. At overvåge enhver kørsel til kørsel variabilitet, de gennemstrømningshastigheder og tryk kurver for hver af LC-associerede pumper blev opsamlet og opbevaret.

LC koblet tripel kvadrupol-massespektrometri (QQQ Agilent Technologies, Santa Clara CA) blev bruges til målrettet vurdering af forbindelser ved anvendelse af Single Reaction Monitoring (SRM) strategi. De operationelle parametre for denne massespektrometer inkluderet 1) kilde betingelser kapillær spænding på 3000 V og kilde temperatur på 350 ° C, 2) tørregas opretholdt ved 10 l /min, 3) forstøver tryk indstillet på 35 psig og 4) fragmentor spænding sæt ved 70 V. kollisionsenergier der anvendes til fragmentering blev fastsat til 10-40 eV medmindre andet er angivet.

omvendt fase (RP) kromatografisk separation på LC-QQQ ansat en gradient indeholdende vand (opløsningsmiddel a) og acetonitril (ACN, opløsningsmiddel B) (begge opløsningsmidler blev modificeret ved tilsætning af 0,2% eddikesyre og 0,1% myresyre). Kromatografisk separation blev udført på en Zorbax Eclipse XDB-C18-søjle (Agilent Technologies, CA) (50 x 4,6 mm i.d .; 1,8 um) holdt ved 37 ° C og en strømningshastighed på 0,2 ml /min. Opløsningsmidlet ved starten af ​​gradienten var 2% B, som var derefter gradvist øges til 30% B i 6,5 minutter efterfulgt af en stigning til 90% B i løbet af de næste 0,5 minutter, 95% B i yderligere 5 minutter og nedtrappet til 2% B i en periode på 8 minutter. Dette blev efterfulgt af en post-prøve ækvilibrering i yderligere 5 minutter. Især blev søjlen vasket og istandsat efter hver 50 injektioner

Den vandige normal fase (ANP) kromatografisk separation på LC-QQQ ansat en gradient indeholdende Acetonitirle (ACN, opløsningsmiddel A):. Vand (opløsningsmiddel B) med begge opløsningsmidler modificeret ved tilsætning af 0,2% eddikesyre og 0,1% myresyre. Strømningshastigheden blev indstillet til 0,4 ml /min. Den oprindelige opløsningsmiddel var 95% A med en gradient fra 95% A til 90% A i løbet af 3 minutter, 90% A-80% A i 2 minutter, efterfulgt af 80% A-75% A i 1 min, 75% A -55% A i 2 min, 55% A-40% A i 2 min, 40% A-30% A i 2 min, 30% A-20% A i 2 min, 20% A-95% A i 1 min og 95% A i 5 min. Søjlen blev derefter istandsat tilbage til startbetingelser. En Diamond Hydride søjle (MicroSolv Technology, Eatontown, NJ) (4 um, 100A 2,1 × 150 mm) blev opretholdt i temperaturregulerede kammer (37 ° C) og anvendt for forbindelse separation. Under den fordomsfri og målrettet metabolomiske profilering proces et par forbindelser er redundant visualiseret på tværs af flere platforme. Med den forståelse, at følsomheden og linearitet er meget forskellige fra grænsefladen til interface, er disse afskedigelser anvendes som en del af kvalitetskontrollen. Desuden streng kvalitetskontrol vedtaget i denne undersøgelse omfattede en kromatografisk separation, der havde mindre end 0,1 minutter variation i retentionstiden af ​​detekterede forbindelser mellem eksperimenter (figur S1). Derudover har vi også anvendt interne standarder indeholdende ækvimolær blanding af rene forbindelser samt en karakteriseret pulje af lever- prøve til styring proces-associeret variation. Begge disse kontroller blev gentagne gange analyseret i tandem med celle line prøver. Også for at sikre ensartethed i profileringsprocessen blev alle kolonner og opløsningsmidler købes fra en enkelt producents parti ved starten af ​​disse forsøg.

Ud over den unbiased profilering ovenfor beskrevne evaluering af alanin og sarcosin var udføres under anvendelse af isotop-fortynding gaskromatografi koblet massespektrometri. Her blev restvand fjernes fra prøverne ved at danne en azeotrop med 100 pi dimethylformamid (DMF), og tørring af suspensionen under vakuum. Alle prøverne blev injiceret under anvendelse af en Injektoren og en Agilent 6890N gaskromatograf udstyret med en 15 m DB-5 kapillarsøjle (indre diameter, 0,2 mm, filmtykkelse, 0,33 mikron; J W Scientific Folsom, CA) interface med en Agilent 5975 MSD massedetektor.

t

butyl- dimethylsilyl derivater af sarcosin blev kvantificeret ved måling af udvalgte ioner (SIM), ved hjælp af isotop fortynding elektron-impact ionisering GC /MS. Niveauerne af alanin og sarcosin der elueres ved 3,8 og 4,07 minutter henholdsvis blev kvantificeret ved hjælp af deres respektive forhold mellem ion af

m

/

z

232 stammer fra indfødte metabolit ([MO-

t

butyl-dimethylsilyl]

-) og ioner af

m

/

z

233 og 235 for henholdsvis alanin og sarcosin, afledt af isotopmærkede deutererede intern standard [

2H

3] for sarcosin. Detektionsgrænsen (signal /støj 10) var -0,1 picomol til sarcosin hjælp isotop-GC /MS

metabolomiske fænotypebestemmelse Microarrays

Den metaboliske fænotypebestemmelse blev udført ved hjælp af 96-brønds plader indeholdende. forskellige metabolitter som eneste substrater næringsstoffer. Det næringsstof holdige plader blev opnået fra Biolog Inc (Hayward, CA) og assayet blev udført i henhold til fabrikantens anvisninger. I alt 88 sukkerarter, 5 nukleotider og 29 aminosyrer blev undersøgt som substrater på to plader med 96 brønde, mærket M1 og M2 af fabrikanten. Væsentlige, assayet måler udnyttelsen af ​​disse metabolitter ved de voksende celler som funktion af NADH flux som igen målt ved omfanget af reduktion af tetrazolium farvestof. Sidstnævnte kvantificeres spektrofotometrisk ved 590 nm, mens enhver ikke-specifik baggrund aktivitet vurderes ved 790 nm. For de metaboliske fænotypebestemmelse undersøgelserne blev VCap celler sultet i 96 timer og podet i brøndene i 96-brønds plade med en tæthed på 20.000 celler /brønd. Navnlig blev VCAP cellerne enten behandlet med 10 nM R1881 eller vehikel (ethanol) på tidspunktet for podning. Cellerne blev derefter lov at vokse i 24 timer ved 37 C ved 5% CO

2. Efter 24 h inkubation blev NADH flux målt ved at overvåge den optiske densitet ved 590 nm ved anvendelse af et spektrofotometer. Samtidig blev også taget aflæsninger ved 790 nm for at vurdere baggrunden aktivitet. Førstebehandlingen blev taget ved 24 timer efter androgen tilsætning og efterfølgende aflæsninger blev taget ved 1 h intervaller op til 30

th time, efterfulgt af yderligere tre aflæsninger på 34

th, 42

nd og 48

th timer efter androgen tilsætning. Dataene blev opstillet i et Excel ark og analyseret som beskrevet under statistiske metoder.

metabolomiske biblioteker

Metlin bibliotek (Agilent, Santa Clara, CA) blev anvendt til at søge i massespektraldata. Biblioteket blev oprettet ved hjælp cirka 1000 kommercielt tilgængelige forbindelser, hvis opholdstid blev defineret ved hjælp af RP og ANP kromatografiske metoder beskrevet ovenfor. Derudover blev massen og fragmentet ion oplysninger for hver af disse standard forbindelser også opnået i både positive og negative ionisering modes og indgår i Metlin biblioteket.

Statistisk analyse

metabolitter med mere end 60 % manglende værdier blev fjernet fra analysen. Den metaboliske data efterlades censureret grund tærskelværdiansættelse af massespektrometeret data. For at tage højde for forskelle i missingness mønstre på tværs af forskellige klasser, fordeling af andelen af ​​manglende værdier i androgen lydhør (ARD), androgen non-responsive (ARI) og godartet (Ben) prøver blev undersøgt og forbindelser med mere end 85% manglende værdier i hvert gruppe og mindre end 60% manglende værdier generelt blev anset for at have biologisk missingness. Androgen behandlede prøver og kontrolprøver blev behandlet på lignende måde. Manglende metabolit målinger for disse metabolitter blev erstattet (imputeret) med påvisning niveau (2000). De manglende foranstaltninger i resten af ​​metabolitter blev tilregnet ved hjælp af den nærmeste nabo algoritmen med k = 5 ved hjælp af R-pakken PAMR. Imputerede data blev derefter log2 forvandlet. Normalisering for Q-TOF-data blev udført ved hjælp af fraktil normalisering pr prøver ved hjælp af limma R-pakke. QQQ prøver blev normaliseret ved median centrering og IQR skalering.

Heatmaps, boxplots og Venn diagrammer blev trukket ved hjælp af R-pakker gplot, statistik og limma hhv. Data fra forskellige platforme blev derefter skaleret pr sammensatte og sammenlignes på tværs af prøver. Prøverne til duplikerede forbindelser blev kombineret ved gennemsnittet over prøver resulterede fra flere forekomster af de samme forbindelser. Hierarkisk klyngedannelse blev udført ved hjælp af komplet kobling med Pearsons korrelation. En to-sidet t-test blev anvendt til at vurdere sammenslutning af hver metabolit med androgen reaktionsevne status i en to-stikprøve-test. De resulterende p-værdier blev derefter justeret for multipel testning ved hjælp FDR med q * = 0,2, ved at beregne Q-værdier ved hjælp af R-pakken fdrtool [29].

Data fra metaboliske fænotypebestemmelse analyser blev først korrigeret for baggrundssignal, opnået fra aflæsninger af tomme brønde. Dataene blev derefter indstillet ved at subtrahere middelværdier af tre negative kontrolbrønde fra alle andre prøver på hvert tidspunkt. Virkningen af ​​androgen behandling på prostatacancerceller dyrket i aminosyre- og sukker plader sammenlignet med kontrolceller blev sammenlignet under anvendelse heatmaps og boxplots. Desuden gensæt analyse (R-pakke GSA [30]) blev anvendt til at vurdere den samlede berigelse af aminosyre- og sukker veje, i de respektive plader, på hvert tidspunkt.

Resultater

metabolomiske profilering af prostata-afledte cellelinjer

i et forsøg på at profilere androgen-regulerede metabolomet i prostatakræft, brugte vi væskekromatografi kombineret med massespektrometri til at afhøre de relative niveauer af metabolitter tværs prostata-afledte celle linjer (Udødeliggjorte godartet – RWPE, androgen-ikke-responsive – PC3 og DU145 og androgen-responsive – VCAP, og LNCaP). Ud over at afgrænse prostata cancer-specifik (PCA) metaboliske profiler, undersøgte vi også metaboliske ændringer i androgen-responsive (ARD) vs ikke-responsive celler (ARI), såvel som dem, der direkte reguleres af androgen i VCap celler. Som skitseret i figur 1, den unbiased metabolomisk profilering platform, der anvendes i denne undersøgelse bestod af både omvendt fase og vandig normal fase-kromatografi koblet med 1) elektrosprayionisering (ESI) i positiv ion-mode (+) og 2) ESI i negativ ion tilstand (-). Desuden blev en målrettet vurdering af 57 forbindelser udført ved anvendelse Single reaktioner (SRM) på en tripel kvadrupol massespektrometer drives i (+) og (-) ion modes henholdsvis (figur 1). Cellelinien-afledte massespektrometri profiler blev underkastet forbehandling, der involverede data filtrering, godtgørelse, logaritmisk transformation og normalisering som illustreret i figur 1. De normaliserede data blev derefter forhørt i metabolitter, der adskiller 1) godartet prostata-cellelinje (Ben) af prostatakræft-cellelinier (PCA) 2) androgen lydhør prostata kræftceller (ARD) fra androgen uafhængige celler (ARI) og 3) androgen-behandlede prostatacancerceller fra ubehandlede kontroller. Endvidere blev de metabolitter, adskiller ARD og ARI cellelinjer evalueret i lokaliserede og metastatisk væv, ved hjælp af væv-afledte metabolomiske profiler, som var tidligere offentliggjort af vores gruppe [27]. Klassen-specifikke metaboliske underskrifter blev udsat for berigelse-baserede biologisk proces kortlægning efterfulgt af validering med in vitro metaboliske fænotypebestemmelse eksperimenter.

Illustration af de forskellige trin i metabolomiske profilering af prostata-cellelinjer. De vigtigste trin involveret metabolit ekstraktion og separation, massespektrometri-baseret detektion, spektralanalyse, data normalisering, afgrænsning af klasse-specifikke metabolitter og ændrede veje og deres funktionelle karakterisering. Variationen i prøveudtagning, separation og massespektrometri blev kontrolleret ved hjælp af spidse standarder og vurderet ved hjælp af forskellige kvalitetskontrol parametre (Figur S1).

blev fundet i alt 1553 forbindelser på tværs af de seks prostata cellelinjer hjælp de forskellige massespektrometriske metoder, der anvendes i denne undersøgelse (se ovenfor, figur 2A). Af disse blev opdaget 40 forbindelser kun i Ben mens 102 og 55 forbindelser henholdsvis blev set i ARI og ARD cellelinjer (figur 2B). Især dette kompendium indeholdt 72 navngivne metabolitter (figur 2C). En hierarkisk clustering profil baseret på forbindelser med betydelig forskellen udtryk perfekt afgrænser de prostata cellelinjer (figur 2D).

A) Heat kort repræsentation af hierarkisk klyngedannelse af 1.553 metabolitter tværs 5 prostata-cellelinjer. Prøve klasser er angivet med de farvede streger [godartet = grøn, androgen ikke-responsiv PCa (ARI): gul og androgen lydhør PCa (ARD): rød bar]. Kolonner repræsenterer individuelle cellelinier og rækker vedrører særskilte metabolitter. Nuancer af gul repræsenterer elevation af en metabolit og blå nuancer repræsenterer fald af en metabolit i forhold til den mediane metabolit niveauer (se farveskala). B) Venn-diagram, der repræsenterer fordelingen af ​​1.553 metabolitter målt over godartet (RWPE), ARI (DU145 og PC3) og ARD (LNCaP og VCAP) cellelinjer hjælp væskekromatografi koblet massespektrometri. C) samme som i (A), men for 72 navngivne forbindelser D) dendrogram repræsenterer hierarkisk gruppering af prostata-relaterede cellelinjer er beskrevet i B, ved anvendelse af forbindelser med betydelig forskellen udtryk.

Specifikke metaboliske profiler skelne Ben fra PCa og ARD fra ARI

for at afgrænse de metabolomiske ændringer mellem Ben og PCA-cellelinjer, brugte vi en 2-stikprøve

t

-test. I alt 674/1553 forbindelser var forskellen på tværs af disse to klasser efter multipel justering sammenligning på en falsk opdagelse sats (FDR) på 20%. Inkluderet i denne liste var 29 navngivne metabolitter, hvis relative niveauer er vist i figur 3A. Denne ændrede metabolomiske signatur i PCA cellelinier indeholdt forhøjede niveauer af aminosyrer, såsom sarcosin, threonin, phenylalanin og alanin samt højere niveauer af forbindelser, der er forbundet med nitrogenmetabolisme ligesom kreatin, kreatinin, citrullin og N-acetyl spermin. På den anden side, niveauet af metabolitter tilhører tryptophan metabolisme nemlig tryptophan, 1-methyl tryptophan og kyneuric syre blev reduceret i PCa sammenlignet med Ben. Ligeledes blev 913/1553 forbindelser ændret mellem ARI og ARD PCA cellelinjer (figur 3B). Den ændrede liste omfattede 52 navngivne metabolitter blandt hvilke niveauer af spermin, N1-acetylspermine og aminosyrer, såsom serin, threonin, lysin, homocystein, asparagin, alanin, glutaminsyre osv, var forhøjet i ARD (figur 3B). Tværtimod blev niveauer af S-adenosylmethione (SAM, methylering valuta af cellen) reduceret i ARD-celler med en samtidig stigning i niveauet af dets nedbryde produktet, homocystein (figur 3B). Dette antyder øget methylering aktivitet i prostatakræft og er i overensstemmelse med vores tidligere resultater om avancerede prostatakræft væv [27].

A) Heat kort, der viser 29 navngivne differential metabolitter i prostata kræftceller i forhold til godartet celle linie (

s

0,05, FDR = 20%), beregnet ud fra en

t

-test kombineret med permutationer (

n

= 1000) til at bestemme

s

-værdier til at sammenligne grupperne. Varmen kort blev genereret efter log skalering og fraktil normalisering af dataene. Ordningen farve er den samme som i fig. 2A. B) samme som i (A), men for 52 navngivne differentielle metabolitter mellem ARI (gul bar) og ARD (rød bjælke) prostatacancerceller. C) Netværk visning af den molekylære koncept analyse for de metabolomiske profiler af vores “ændret i PCa cellelinje signatur” (grå node). Hvert knudepunkt repræsenterer et molekylært koncept eller et sæt af biologisk beslægtede gener. Knudepunktet størrelse er proportional med antallet af gener i konceptet. Hver kant repræsenterer en statistisk signifikant berigelse (FDR

q

-værdi 0,2). Berigede begreber, der beskriver “aminosyremetabolismen” er angivet med gule broer.

Integrativ Molekylær Concept Modellering af PCa-afledt metabolomet

Ved afgrænse de metabolomiske mønstre for Ben, ARD og ARI prostata cellelinjer, vi efterfølgende forfulgt vurdering af disse ændringer i forbindelse med biokemiske veje og afgrænsning af ændrede biokemiske processer under prostatakræft udvikling og progression holde i sammenhæng sit svar på androgen. At afgrænse de samlede biologiske processer, der er ændret i prostatacancercellelinjer, samt i androgen-responsive prostata cancerceller blev klassespecifikke koordineret udtryk profiler af metabolitter beskrevet ovenfor undersøges ved anvendelse Oncomine Concept Maps (OCM, www.oncomine. org) [31], [32]. Her en “molekylær koncept« defineres som et sæt af molekylære komponenter, der er relateret på en eller anden biologisk meningsfuld måde. Til denne analyse, vi brugte molekylære begreber to generelle typer: (1) gen og protein anmærkninger fra eksterne databaser og (2) beregningsmæssigt afledte regulatoriske netværk.