PLoS ONE: XIAP Er en Predictor af cisplatin kemoterapi respons og Prognose for patienter med fremskreden hoved- og hals Cancer

Abstrakt

Baggrund

Ca. 60-80% af patienter med fremskreden hoved og hals pladecellekræft (HNSCC) dø inden for fem år efter diagnosen. Cisplatin kemoterapi er den mest almindeligt anvendte palliativ behandling for disse patienter. For at evaluere den prognostiske værdi af X-bundet inhibitor af apoptose (XIAP) niveau som en potentiel biomarkør hos disse patienter, undersøgte vi forholdet mellem XIAP ekspression og cisplatin respons af disse patienter og deres prognose.

Metode /Principal resultaterne

Sixty patienter med fremskreden HNSCC blev rekrutteret i denne undersøgelse. Ekspression af XIAP blev undersøgt både før og efter kemoterapi og blev korreleret med kemoterapi respons, clinicopathology parametre og kliniske resultater af patienterne. Vi fandt, at XIAP blev udtrykt i 17 (20,83%) af de 60 avancerede HNSCC prøver og ekspressionen var signifikant associeret med cisplatin resistens (P = 0,036) og dårlig klinisk resultat (P = 0,025). Cisplatin kemoterapi-induceret XIAP udtryk i disse post-kemoterapi prøver (P = 0,011), blev yderligere forbundet med dårligere klinisk resultat (P = 0,029). Multivariat analyse viste, at kun alkoholforbrug, lymfeknudemetastase og XIAP niveau blev uafhængigt associeret med prognosen af ​​avancerede HNSCC patienter. Inhibering XIAP-ekspression med siRNA i XIAP overudtrykt HNSCC celler bemærkelsesværdigt øget deres følsomhed over for cisplatin behandling til næsten en 3 fold forskel.

Konklusioner /Signifikans

Vores resultater viser, at XIAP overekspression spiller en vigtig rolle i sygdomsforløbet og cisplatin-modstand af avanceret HNSCC. XIAP er en værdifuld indikator for cisplatin-respons og prognose for patienter med fremskreden hoved- og halscancer. Nedregulering af XIAP kunne være en lovende adjuverende behandling for de patienter af avanceret HNSCC

Henvisning:. Yang X-H, Feng Z-E, Yan M, Hanada S, Zuo H, Yang C-Z, et al. (2012) XIAP Er en Predictor af cisplatin kemoterapi respons og Prognose for patienter med fremskreden hoved- og halscancer. PLoS ONE 7 (3): e31601. doi: 10,1371 /journal.pone.0031601

Redaktør: Torbjørn Ramqvist, Karolinska Institutet, Sverige

Modtaget: September 1, 2011; Accepteret: 10. januar, 2012; Udgivet: Marts 5, 2012 |

Copyright: © 2012 Yang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af Projekt for National Natural Science Foundation of China (Grant nr 30.772.433), Projekt for Videnskab og Teknologi Kommissionen for Shanghai kommune (Grant nr 07QA14038), og Shanghai førende akademisk disciplin Project (projekt nr S30206). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Hoved og hals pladecellekræft (HNSCC) er den femte mest almindelige kræftform i verden og er den mest almindelige neoplasme i Centralasien [1]. Selvom tidlige fase HNSCC har høje hærdningshastigheder, op til 50% af patienter til stede med fremskreden [2] sygdom. Blandt disse avancerede stadie HNSCC patienter, vil 60-80% dør inden 5 år efter diagnosen [3]. Øjeblikket, cisplatin kemoterapi er den mest almindeligt anvendte palliativ behandling for disse patienter. Men i klinikken kun et begrænset antal patienter drage fordel af cisplatin kemoterapi; andre patienter er resistente over for denne terapi og nogle vil dø på grund af behandlingsrelaterede toksicitet [4]. Derfor er det vigtigt at kigge efter prædiktorer eller potentielle biomarkører, der kan hjælpe til at identificere de patienter, der kan have gavn af cisplatin kemoterapi.

inhibitorer af apoptose proteiner (IAP) repræsenterer et sæt af potente endogene modulatorer af apoptose i pattedyrceller, som består af otte medlemmer: XIAP, cIAP1, cIAP2, survivin, NIAP, Bruce, ML-IAP og ILP-2 [5]. Disse proteiner medierer flere biologiske funktioner, der omfatter binding til og inhibering af caspaser, reguleringen af ​​cellecyklusprogression, og modulerende receptormedieret signaltransduktion [6]. Blandt dem, X-bundet inhibitor af apoptose (XIAP) er en af ​​de mest kraftigt virkende inhibitor af caspaser og apoptose. XIAP kan direkte binde sig til og hæmme både initiativtager og effektor caspaser og hæmmer både mitokondrie-afhængige og -uafhængige apoptotiske veje [7], [8], [9]. Nylige resultater har vist

in vitro

kan XIAP forårsage resistens blandt tumorceller når de udsættes for en bred vifte af apoptotiske stimuli, herunder kemoterapi [10], [11]. Imidlertid vides det ikke, hvis XIAP ekspressionsniveauet kunne anvendes til at forudsige cisplatin respons af avanceret HNSCC. Derfor er formålet med vores undersøgelse var at undersøge ekspressionen af ​​XIAP i avanceret HNSCC og dets forhold til cisplatin respons og prognose af disse patienter.

Resultater

XIAP udtryk niveau er forbundet med en dårlig kliniske resultat af avancerede HNSCC patienter

XIAP var primært lokaliseret i cytoplasmaet af tumorceller (figur 1), med meget varierende positiv rate fra 1% -85%. Nucleus farvning blev lejlighedsvis observeret i nogle post-kemoterapi prøver. Patienter, hvis tumorer udtrykte høje niveauer af XIAP generelt haft en dårligere prognose end de patienter, hvis tumorer udtrykte lave niveauer af XIAP i pre-kemoterapi kræft væv (samlet overlevelse

P

= 0,025, log rank test, figur 2). XIAP udtryk rate blev ikke korreleret med TNM stadie, patologisk klasse, rygning og alkohol historie af disse patienter med fremskreden HNSCC (tabel 1). I multivariat analyse, lymfeknude metastaser, alkoholforbrug og XIAP udtryk (pre-kemoterapi) var uafhængige risikofaktorer for patienternes prognose (tabel 2)

A:. Negativ kontrol med PBS i stedet for første antistof; B: Lav ekspression af XIAP (procentdelen af ​​positive sats 25%); C:. Høj udtryk for XIAP (procentdelen af ​​positive sats 25%)

A: Samlet overlevelse ved XIAP scoringer. Patienter, hvis tumorer udtrykte høje niveauer af XIAP generelt havde en dårligere prognose end de patienter, hvis tumorer udtrykte lave niveauer af XIAP i præ-kemoterapi kræftvæv; B: Samlet overlevelse ved chemoresponse. Patienter med tumorer blev der reagerer på kemoterapi havde generelt en bedre prognose end de patienter, hvis tumor var resistent over for kemoterapi; C: XIAP snesevis af post-kemoterapi prøver. XIAP niveauer i post-kemoterapi prøver blev også signifikant relateret til patienten samlede overlevelse. Vejviser

XIAP ekspressionsniveauet var forbundet med kemoterapi respons af patienter med fremskreden HNSCC

Alle disse avancerede HNSCC patienter havde afsluttet en cyklus af kemoterapi. Blandt dem, 34 tilfælde var komplet respons (CR) og partielt respons (PR) til kemoterapi og 26 tilfælde var progressiv sygdom (PD) og stabil sygdom (SD). De patienter, hvis tumorer udtrykte høje niveauer af XIAP var signifikant mere resistente over for cisplatin kemoterapi og generelt havde dårligere kemoterapi reaktioner (

P

= 0,005, tabel 1). XIAP ekspressionsniveauerne blev stærkt forøget i de post-kemoterapi HNSCC væv sammenlignet med de pre-kemoterapi prøver (

P

= 0,011, tabel 3). XIAP niveauer i post-kemoterapi prøver blev også signifikant relateret til de overordnede overlevelse satser for disse patienter (

P

= 0,029) (figur 2), men i multivariat analyse, var det ikke en selvstændig faktor for patienterne ‘resultater.

Hæmning XIAP udtryk sensibiliseret HNSCC cellelinjer til cisplatin behandling

for at undersøge den afslappede forhold XIAP udtryk og lægemiddelrespons af patienter, brugte vi siRNA til at hæmme XIAP udtryk i HNSCC cellelinie CAL27 og WSU-HN13. Tre siRNA’er blev designet til at inhibere ekspressionen af ​​XIAP i CAL27 og WSU-HN13-celler, og blandt dem, siRNA1 behandlingsgruppen opnået near70% reduktion af XIAP-mRNA-ekspression i begge celler (figur 3). Sammenlignet med den negative kontrolgruppe, cisplatin IC50 værdi i siRNA1 gruppe faldt fra 0,51 ug /ml til 0,20 ug /ml (

P

= 0,05, figur 4) i CAL27 og fra 4,32 til 1,82 ug /ml i WSU -HN13.

Inhibition effekt af siRNA-1, siRNA-2 og siRNA-3 på ekspressionen af ​​XIAP mRNA blev undersøgt i CAL27 celle (øvre) og WSU-HN13 celle (Lavere) med Real-time PCR . XIAP siRNA1 behandlingsgruppe opnået nær 70% reduktion af XIAP mRNA-ekspression i begge celler.

XIAP siRNA-1 hæmmede effektivt udtryk for XIAP protein i både CAL27 og WSU-HN13 celler (øvre) og nedsat cisplatin IC50 værdi fra 0,51 pg /ml til 0,20 pg /ml i CAL27 og fra 4,32 til 1,82 ug /ml i WSU-HN13 (lavere).

diskussion

cisplatin baseret neoadjuverende kemoterapi, kirurgi og strålebehandling bruges til at blive betragtet som standard ordning for avancerede HNSCC patienter i høj risiko; imidlertid de terapeutiske virkninger af neoadjuvansterapi forbliver usikkert på grund af mange randomiserede forsøg ikke at vise en overlevelsesfordel med brugen af ​​neoadjuverende kemoterapi [12], [13]. Selvom vilkårlige administration af neoadjuverende kemoterapi adresser nogen fordel for patienternes udfald (fem-årige overlevelsesrate var 38,33% i vores undersøgelse), fandt vi de patienter, der opnåede en klinisk respons havde en mere gunstig prognose (p = 0,001, log-rank test ), hvilket er i overensstemmelse med nogle tidligere rapporter [12], [13]. Ud fra dette synspunkt, evaluere, hvordan man selektivt vælger patienter, der ville positivt gavn af neoadjuverende kemoterapi var den afgørende faktor for en vellykket behandling [4].

I denne undersøgelse fandt vi en stærk sammenhæng mellem ekspressionsniveauet af XIAP og det kliniske respons og prognose af patienter med fremskreden HNSCC. Lav XIAP udtryk var tæt korreleret med kemoterapi respons og gunstig prognose, hvorimod høj XIAP udtryk kan forudsige kemoterapi fiasko og dårligt resultat. Resultaterne er i overensstemmelse med tidligere rapporter, der viser, at nedregulering af XIAP sensibiliserer kræftceller til terapeutiske lægemidler i lungekræft, prostatakræft, kræft i æggestokkene og kræft i bugspytkirtlen [14], [15], [16], [17], [ ,,,0],18], [19], [20]. Vigtigt er det, fandt vi, at cisplatin kemoterapi i høj grad inducerede ekspression af XIAP i avanceret HNSCC. Den højere XIAP niveau i post-kemoterapi prøver også forbundet med en dårligere prognose af patienterne. Vores resultater viser, at XIAP-ekspression er en primær årsag til mislykket behandling og kemoterapi-induceret XIAP ekspression førte til en dårlig prognose af disse lægemiddel-resistente patienter. Forudvalgt XIAP negative patienter kan have gavn af cisplatin-baserede neoadjuverende behandling. Vores

in vitro

data foreslås endvidere en potentiel værdi på hæmme XIAP udtryk at øge effektiviteten af ​​kemoterapi.

Det skal bemærkes, at i modsætning til de fleste undersøgelser, vi observerede en positiv sammenhæng mellem alkoholforbrug og samlet overlevelse af avancerede HNSCC patienterne i denne undersøgelse. Interessant, et lignende resultat er blevet offentliggjort for nylig, som foreslog forskellene i vores data og kulturel tradition kan være forårsaget af forskellige drikkevaner: avancerede HNSCC patienter fra Kina ofte drak spiritus med meget høj koncentration af alkohol (normalt 50%) , mens vesterlændinge normalt forbruge drikkevarer med meget lavere koncentration af alkohol. Sådanne høje koncentrationer af alkohol kan stimulere mundslimhinden og ødelægge bakterier balance, påvirke sygdomsforløbet af avancerede HNSCCC [21]. Vi kan ikke udelukke muligheden for begrænset stikprøvestørrelse og /eller andre faktorer, der kan have bidraget til denne observation.

Denne undersøgelse var en retrospektiv case-kontrol studie og havde nogle begrænsninger. I den foreliggende undersøgelse valgte vi IHC at evaluere XIAP udtryk i stedet for nogle kvantitative metoder primære grund af den manglende adgang til friske biopsi væv. Selvom IHC er en semi-kvantitativ metode, er det nu den mest anvendte, enkleste og mest omkostningseffektive protokol i kliniske arbejde [22]. Også antallet af høje XIAP udtryk i præ-kemoterapi prøver var kun 20,83%, mens den kemoterapi responsrate (CR + PR) af patienterne var 43,34%. Det er mere end sandsynligt, at mange faktorer kan bidrage til den samlede lægemiddelrespons i avanceret HNSCC; XIAP udtryk kan bare være en af ​​mange faktorer involveret.

Resultaterne fra den aktuelle undersøgelse har potentielt vigtige kliniske implikationer. Først viste vores undersøgelse, for første gang, at XIAP-ekspression er associeret med kemoterapi respons og kan anvendes som en biomarkør til at forudsige kliniske resultater af avancerede HNSCC patienter, især dem, der har haft cisplatinbaseret kemoterapeutisk behandling. For det andet kan XIAP udtryk være et nyttigt biomarkør for at vælge patienter, der har den største chance for at drage fordel af cisplatin-baserede neoadjuverende kemoterapi. Endelig årsagssammenhængen mellem XIAP ekspressionsniveauet og kemoterapi svar viser, at nedregulering af XIAP kunne være en lovende adjuverende behandling for avancerede HNSCC patienter.

Materialer og metoder

Etik erklæring

Denne undersøgelse blev godkendt af den etiske komité i niende Folkets Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine og udføres i overensstemmelse med anbefalingerne fra Helsinki-deklarationen. Ingen informeret samtykke (skriftlig eller mundtlig) blev opnået for brug af retrospektive vævsprøver fra patienterne i denne undersøgelse, hvoraf mange blev afdøde, da den etiske komité, der frafaldes behovet for samtykke, ikke har fundet det nødvendigt. Alle prøver var anonyme.

Cell Culture

Menneskelig HNSCC cellelinie CAL27, som var resistent over for behandling med cisplatin, blev opnået fra American Tissue Cell Collection (Manassas, VA, USA) og dyrket i DMEM (Gibco, USA) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS), 1% glutamin og 1% penicillin-streptomycin. WSU-HN13 cellelinje [23] var begavet fra University of Maryland Dental School (Baltimore, MD, USA) og også dyrket i DMEM (Gibco, USA) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS), 1% glutamin og 1 % penicillin-streptomycin

patienter og Tumor Prøver

Sixty patienter med fremskreden HNSCC. (klinisk fase III /Iva;.. UICC /AJCC 7 ed, 2010) blev rekrutteret i denne undersøgelse. Alle patienter har accepteret cisplatin-baseret neoadjuverende kemoterapi efterfulgt af radikal tumor resektion inden for to til tre uger efter afslutningen kemoterapi på Institut for Kæbekirurgi, Niende Folkets Hospital, Shanghai Jiao Tong University fra januar 1999 til december 2004.

Den kliniske respons af kemoterapi blev vurderet ikke mindre end 2 uger efter patienter afsluttet kemoterapi efter respons evalueringskriterier i solide tumorer (RECIST) [24]. En CR blev defineret som den fuldstændig forsvinden af ​​alle målelige læsioner, uden forekomst af nye læsioner. En PR blev defineret som en reduktion i bi-dimensionelt målelige læsioner med mindst 50 procent af summen af ​​produkterne af deres største vinkelrette diametre og et fravær af progression i andre læsioner, uden forekomst af nye læsioner. SD [9] blev defineret som en reduktion i tumorvolumen på mindre end 50 procent eller en stigning i mængden af ​​et eller flere målbare læsioner af mindre end 25 procent, uden forekomst af nye læsioner. PD blev defineret som en stigning i størrelsen af ​​mindst en bi-dimensionelt målbar læsion med mindst 25 procent og fremkomsten af ​​nye læsioner. Patienternes clinicopathologic oplysninger præsenteres i tabel 4. Alle patienter blev behandlet med standard helbredende operationer med negativ resektion margin. Alle patienter fik postoperativ strålebehandling inden for to-seks uger efter afsluttet operation. Samlet dosis for primær tumor område og hals positive lymfeknuder var 6000cGy og for primær tumor og hals af negative noder var 5000 cGy.

Western blot analyse

Samlet protein blev lyseret i 2 × lysis buffer indeholdende 125 mM Tris-HCl (pH 6,8), 5% vægt /vol SDS og 24,75% glycerol. 40 ug proteiner blev separeret anvendelse af 12% SDS-PAGE og derefter overført til PVDF-membraner. Efter inkubation natten over med monoklonalt muse-anti-human XIAP (BD, USA) i en fortynding på 1:4000 og én times inkubering med IRDye 800CW ged anti-mus sekundært antistof (LI-COR, USA), blev signalet scannet og analyseret ved hjælp af Odyssey Infrared Imaging System (LI-COR Biosciences, USA). β-actin (Sigma-Aldrich, USA) blev anvendt som en intern kontrol.

Real-time PCR

Det totale RNA blev isoleret under anvendelse af TRIzol-reagens (Invitrogen, USA). 1 ug totalt RNA wasreverse transkriberet til cDNA under anvendelse af oligo-dT primer og PrimeScript II RTase (Takara, Japan) ifølge producentens instruktioner. Real-time PCR blev udført med termisk cykliseringsapparat terninger Real Time System (Takara, Japan). Primere til PCR blev udformet med Primer Express® software v3.0 (Applied Biosystem, USA). Primersekvenserne af XIAP var: 5′-CCGGCTGTCCTGGCGCGAAA-3 ‘og 5′-GCTCGTGCCAGTGTTGATGCTGA-3’. Primersekvenserne af β-actin var: 5′-CCTGGCACCCAGCACAAT-3 ‘og 5′-GGGCCGGACTCGTCATACT-3′, og primersekvenserne af GAPDH var: 5’- AATTGAGCCCGCAGCCTCCC 3 ‘og 5′-ACCAGGCGCCCAATACGACC-3’. Alle primere blev adskilt med mindst ét ​​intron på den tilsvarende genomiske DNA. Dissociationskurve analyse blev inkluderet i alle reaktioner for at udelukke ikke-specifik amplificering. Den relative mængde XIAP mRNA-niveau blev beregnet på grundlag af de standard ΔΔCT metoder [25]. Både β-actin og GAPDH blev anvendt som intern kontrol.

siRNA Knockdown

Tre anti-XIAP siRNAs hver rettet mod de to splejsningsvarianter af XIAP og en FAM-mærket negativ kontrol siRNA (ikke- målsekvens), blev syntetiseret ved GenePharma (Shanghai, Kina). Sekvenserne var: siRNA1: GGUCAGUACAAAGUUGAAATT, siRNA2: GCAGGUUGUAGAUAUAUCATT, siRNA3: CCGGAAUCUUAAUAUUCGATT og negativ kontrol: AAUUCUCCGAACGUGUCACGU. Transfektion blev udført ved hjælp af lipofectamin 2000 (Invitrogen, USA) efter producentens protokol.

Immunhistokemi

før og efter kemoterapi repræsentativt væv paraffinblokke blev skåret i 5 um sektioner for standard immunhistokemisk farvning (IHC ). Efter varmeinduceret antigen hentning i citronsyre-buffer (pH 7,0) i 20 min og blokering i 5% gedeserum i 30 min blev objektglassene inkuberet med monoklonalt muse-anti-humant XIAP (BD, USA) ved en fortynding på 1: 100 ved 4 ° C natten over. Udeladelsen af ​​det primære antistof fungerede som negativ kontrol. Bundet antistof blev påvist ved en Super Sensitive IHC Detection System (Biogenex, USA), ifølge fabrikantens protokol. Snittene blev visualiseret med diaminobenzidintetrahydrochlorid (Sigma, USA) opløsning og modfarvet med Harris hematoxylin. Farvningen resultat blev bestemt ved tælling 1000 tumorceller i tre 100 × forstørrelse felter af to uafhængige patologer og yderligere klassificeret som lav ekspression (procentdelen af ​​positive sats 25%) og høj ekspression (procentdelen af ​​positive rate ≥25%) .

Drug Sensitivity Assay

celler blev udpladet i 96-brønds plader ved en densitet på 4 x 10

3 celler /brønd og inkuberet yderligere i 24 timer. 6 timer efter transfektion med negativ kontrol eller siRNA blev mediet fjernet og erstattet med frisk medium containingone af serielle fortyndinger af DDP i yderligere 72 timer, herunder en negativ kontrol uden DDP. Derefter, 20 pi sterilt MTT farvestof (3- [4,5-dimethylthiazol-2-yl] -2,5-di-phenyltetrazolium bromid, 5 mg opløst i 1 ml phosphatbufret saltvand; Sigma, USA) blev tilsat til dyrkningsmedium til en endelig koncentration på 0,5 mg /ml og inkuberet ved 37 ° C i 4 timer. Efterfølgende blev formazankrystaller solubiliseret med 150 pi dimethylsulfoxid i 10 min. Spektrometrisk absorbans ved 490 nm blev målt med en mikropladelæser. Hvert forsøg blev udført tre gange.

Statistisk analyse

SPSS 17,0 softwarepakke blev brugt til statistisk analyse. Frekvenser blev sammenlignet med Fishers eksakte test, × 2 kontingenstest, eller ikke-parametriske relevante test. Vi estimerede overlevelse og time-to-progression kurver under anvendelse af Kaplan-Meier-metoden og sammenlignede dem ved anvendelse af en tosidet log-rank test. Flere logistiske regressioner, der brugte en Cox proportionel risiko model blev brugt til at bestemme, om de molekylære karakteristika tumorer uafhængigt forudsagt overlevelse i vores kohorte af avancerede HNSCC patienter. P 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

.