PLoS ONE: Cell Fri DNA af Tumor Origin inducerer en “Metastatisk” Expression profil i HT-29 Cancer Cell Linje

Abstrakt

Baggrund

Epitelceller i maligne tilstande frigive DNA i det ekstracellulære rum. Cell fri DNA tumor oprindelse kan virke som en ligand af DNA sensing mekanismer og mægle ændringer i epitel-stromale interaktioner.

Mål

For at vurdere og sammenligne de potentielle autokrine og parakrine regulerende virkning af normal og malign epitelcelle-relaterede DNA på TLR9 og sting medierede pathways i HT-29 humane colorektale adenocarcinoma-celler og normale fibroblaster.

Materialer og metoder Salg

DNA isoleret fra normale og tumorform colon epiteler af fersk frosne kirurgisk fjernede vævsprøver blev anvendt til 24 og 6 timer behandling af HT-29 colon carcinoma og HDF-a fibroblastceller. Hele genomet mRNA-ekspression analyse og QRT-PCR blev udført for elementerne /medlemmer af TLR9-signalvejen. Immuncytokemi blev udført for epitel markører (dvs. CK20 og E-cadherin), DNA methyltransferase 3a (DNMT3a) og NFKB (for behandlede HDFα celler).

Resultater

Administration af tumor afledt DNA på HT29 celler resulterede i signifikant (p 0,05) mRNA niveau ændring i 118 gener (logFc≥1, p ≤ 0,05), herunder overekspression af metallothionein gener (dvs.

MT1H

,

MT1X

,

MT1P2

,

MT2A

), metastase-associerede gener (dvs.

TACSTD2

,

MACC1

,

MALAT1

), tumor biomarkør (CEACAM5 ), metaboliske gener (dvs.

INSIG1

,

LIPG

), messenger molekyle gener (dvs.

DAI

,

CREB3L2

).

Øget

proteinniveauer af CK20, E-cadherin, og DNMT3a blev observeret efter tumor-DNA behandling i HT-29-celler. Sund DNA behandling påvirkede mRNA ekspressionen af ​​613 gener (logFc≥1, p ≤ 0,05), herunder øget udtryk af centrale adaptor molekyler af TLR9 vej (f.eks

MyD88

,

IRAK2

,

NFKB

,

IL8

,

IL-1β

), STING vejen (ADAR, IRF7, CXCL10, CASP1) og

FGF2

gen.

konklusioner Salg

DNA fra tumorøse colon epitel, men ikke fra de normale epitelceller fungerer som en pro-metastatisk faktor til HT-29 celler gennem overekspressionen af ​​pro-metastatiske gener gennem TLR9 /MyD88 uafhængig vej. I modsætning hertil DNA stammer fra sunde tyktarmsepitel induceret TLR9 og STING signalvejen i normale fibroblaster

Henvisning:. Furi I, Kalmar A, Wichmann B, Spisak S, Schöller A, Bartak B, et al. (2015) Cell Fri DNA af Tumor Origin inducerer en “Metastatisk” Expression profil i HT-29 Cancer Cell Line. PLoS ONE 10 (7): e0131699. doi: 10,1371 /journal.pone.0131699

Redaktør: Javier S. Castresana, Navarra Universitet, SPANIEN

Modtaget: April 8, 2015; Accepteret: 5 juni 2015; Udgivet: 2 juli 2015

Copyright: © 2015 Furi et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er tilgængelige via genekspression Omnibus (GEO) under tiltrædelsen nummer GSE67557

Finansiering:. Denne undersøgelse blev finansieret af forsknings- og Teknologi Innovation Fund, Ungarn, KMR_12-1-2012-0216 til BM og ungarsk videnskabelig forskning Fund (OTKA-K111743 tilskud) til ZT. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Altered epitel-stromale interaktioner er fundamental i formation kræft. Blandt de kendte regulatoriske ligander (f.eks vækstfaktorer, cytokiner, kemokiner, kønshormoner) tumorvæv afledt DNA også involveret i denne kommunikation via cellulære receptorer sensing DNA [1] Ifølge flere undersøgelser [2-4] DNA-fragmenterne tumor oprindelse (dvs. 21 til 500 baser korte sekvenser af human oprindelse) spiller en rolle i dannelsen af ​​en tumor støttende mikromiljø (dvs. fremme tumorinvasion og unddragelse af immunovervågning) [5-8] cellen frit DNA stammer fra nekrotisk /apoptotiske tumorceller og kan aktivt frigivet af levende celler til det intercellulære rum [9-12]. Denne tumor væv stammer DNA kan påvises i plasma og serum og kunne tjene en nyttig biomarkør for kræft afsløring [11]. Den indeholder en række kræftformer specifikke enheder, herunder onkogener, tumorsuppressorgener, afvigende mikrosatellitter, afvigende methylering af DNA-gener, og omlejrede kromosomalt DNA [12]. Nylige undersøgelser bekræftede optagelse og fastholdelse af onkogener stimulerende celleproliferation i ikke-maligne celler efter integration (oncometastasis) ind modtagerne cellens genom [13].

I det omfang de er forstået, DNA sensing mekanismer i målcellerne omfatter to primære adapter veje, dvs. toll-like receptor (TLR9) og stimulator af interferon gener (STING) baner. [14] Cytoplasmisk TLR9 genkender endogene ligander, såsom fare-associeret molekylære mønstre (dæmper) ligesom umethylerede DNA-sekvenser [7, 8, 15] den totale mængde af ikke-methylerede DNA stigninger i parallelt med global DNA hypometylering i tumorvæv sammenlignet med det normale væv [16]. Den forøgede ekspression af TLR9 blev påvist i flere tumortyper. [1, 17-20] Forøget TLR9 ekspression i carcinomceller blev forbundet med højere metastatisk potentiale, mens højere TLR9 ekspression ved fibroblastlignende celler var forbundet med en lav sandsynlighed for metastase [ ,,,0],21]

STING signalvejen er en adapter til DNA via binding af cykliske dinukleotider genereret af enzymet cyklisk GMP-AMP (cGAMP) syntase (cGAS). [22-24]

Stærk synergisme er blevet observeret blandt samarbejde STING og TLR9 signalering. Disse to signalveje er forskelligt reguleret af afgørende adapter molekyler (IRF3 /7, Sting, og MyD88) [25]. Endvidere Deng et al. (2014) og Woo et al. (2014) fremlagt beviser tyder dendritiske celler registrerer DNA fra tumorceller via STING-medierede, cytosolisk DNA sensing vej. [22, 26, 27]

Baseret på vores tidligere resultater, HT-29 human colon adenocarcinomceller afspejlede ændret DNA-methylering (via forhøjet DNMT3a methyltranferase aktivitet) og CK20 epitel markør ekspression efter gentagen administration af selv-DNA . [28] i den foreliggende undersøgelse analyserede vi den autokrine og parakrine virkninger af DNA fra tumor og sundt væv på HT-29 cancerceller og fibroblaster ved hele genomisk mRNA-ekspression analyse og QRT-PCR til validering af gener fra TLR9 pathway. Desuden blev udført immuncytokemisk analyse for udvalgte differentiering markører, celle- adhæsionsmolekyler og methyltransferaser, til verifikation på proteinniveauet efter behandling med DNA fra raske og tumorvæv.

Materialer og metoder

HT -29 cellekultur

HT-29 human colon adenocarcinoma celler blev indkøbt fra LGC STANDARDS (kat. nr ATCC HTB-38) og dyrket i et specifikt patogen-fri cellekultur laboratorium ved 37 ° C i 5% CO

2. HT-29 celler blev holdt i McCoys 5a Medium Modified (katalog nr M8403-500 ml Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) suppleret med 10% (vol /vol) føtalt bovint serum (FBS; standardkvalitet; PAA Laboratories GmbH, Pasching, Østrig), 160 pg /ml gentamycin (Sandoz Sandoz GmbH, Østrig), og 125 pg /ml amphotericin B (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA).

HDFα cellekultur

HDFα celler blev indkøbt fra Life Technologies (kat. nr C0135C) og dyrket i et specifikt patogen-fri cellekultur laboratorium ved 37 ° C i 5% CO2. HDFα celler blev holdt i medium 106 (Life Technologies Corporation, Carlsbad, USA) suppleret med LSGS (Life Technologies Corporation, Carlsbad, USA) og amphotericin B (Sigma). 160 ug /m gentamycin (Sandoz Sandoz GmbH, Østrig).

DNA isolation

Genomisk DNA blev isoleret fra makroskopisk normale områder nær tarmkræft (CRC) og fra tumorform væv områder af kirurgisk fjernet macrodissected friske frosne CRC prøver (fase II, moderat differentierede tumorer fra sigmoid tyktarm og endetarm (25-50 mg væv) ved High Pure PCR skabelon forberedelse kit (Roche GmbH, Tyskland). Disse CRC patienter blev alle bekræftet af definitiv histologisk diagnose og modtog ingen præoperative kemoterapi eller strålebehandling. Det isolerede, protein-frit DNA blev behandlet med 20 pi RNase A /T1 Mix ved 37 ° C i 1 time (Thermo Scientific, Tyskland). koncentrationen af ​​isoleret og oprenset DNA blev bestemt ved Nanodrop- 1000 spektrofotometer (Thermo Scientific, Tyskland).

Etik erklæring

undersøgelsen blev udført i overensstemmelse med Helsinki-deklarationen og godkendt af Semmelweis University etiske komité, og den statslige regionale og institutionelle Udvalg for Videnskab og Forskning Etik (TUKEB), Nr: 23.970-2 /2011). Skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle patienter inkluderet i undersøgelsen.

DNA behandling af HT-29 og HDFα celler

HT-29 og HDFα celler blev podet (ved en tæthed på 0.5×10

6 og 0.1×10

6) i 6 brønd Corning Cellbind cellekultur flerbrøndsplader i RPMI 1640 suppleret med gentamycin, amphotericin B og FBS. Når monolag nåede 80-90% konfluens, 15 ug normale eller tumor-DNA (opløst i 200 pi sterilt phosphatbufret saltvand (PBS) blev tilsat til brøndene. Den negative kontrol bestod passende volumener PBS. Cellerne blev inkuberet ved 37 ° C i en 5% CO2 atmosfære og 95% fugtighed.

Isolering af totalt RNA til Affymetrix HGU133 Plus 2.0 microarray og QRT-PCR-genekspression analyser

efter 24 timer blev cellerne vasket to gange i 5 ml sterilt PBS. efter den anden vask blev cellerne resuspenderet i 5 ml PBS. 2,5 ml cellesuspension blev anvendt til total RNA-isolering. totalt RNA fra de isolerede HT-29-celler blev ekstraheret med RNeasy Mini kit (Qiagen, USA) i overensstemmelse med producentens anvisninger. den isolerede RNA blev opbevaret ved -80 ° C.

mRNA udtryk microarray analyse

mængden og kvaliteten af ​​det isolerede RNA blev testet ved at måle absorbansen og ved kapillær gelelektroforese hjælp af 2100 Bioanalyzer og RNA 6000 Pico Kit (Agilent Inc, Santa Clara, USA). Biotinyleret cRNA prober blev syntetiseret fra 4,82 ± 0,60 ug total RNA og fragmenteret ved hjælp af One-Cycle Target mærkning og kontrol Kit i henhold til Affymetrix beskrivelsen. Ti ug af hver fragmenterede cRNA prøve blev hybridiseret i HGU133 Plus2.0 array (Affymetrix) ved 45 ° C i 16 timer. Mikroarrays blev vasket og farvet under anvendelse Fluidik Station 450 (Affymetrix) og et antistof amplificering farvning fremgangsmåde ifølge producentens instruktioner. De fluorescerende signaler blev opdaget af en GeneChip Scanner 3000 (Affymetrix).

Statistisk vurdering af mRNA-ekspression profiler

Pre-forarbejdning og kvalitetskontrol analyser blev udført i overensstemmelse med forslagene fra The Tumor Analysis Bedste Practices arbejdsgruppe (Tumor Analyse Best Practices arbejdsgruppe, 2004). Scannede billeder blev inspiceret for artefakter; procentdelen af ​​tilstedeværende opkald ( 25%) og graden af ​​RNA-nedbrydning blev vurderet. På grundlag af evalueringskriterier, alle målinger opfyldte de minimale kvalitetskrav. I tilfælde af HT29 og HDFα celle eksperimenter blev ligheden mellem de 2-2 biologiske replikater angivet ved hjælp af den euklidiske afstand metoden. Affymetrix udtryk arrays blev forbehandlet ved gcRMA med fraktil normalisering og median polsk sammendrag.

Yderligere analyser til at identificere differentielt udtrykte funktioner blev udført med betydning analyse af microarrays (SAM). Den nærmeste indskrumpet tyngdepunkt metode (forudsigelse analyse af microarrays = PAM) blev anvendt for prøve klassifikation fra genekspression data. Forudsigelse analyse af mikroarrays bruger blødt tærskling at frembringe en formindsket centroid, hvilket muliggør udvælgelse af karakteristiske gener med høj prædiktiv potentiale (Tibshirani et al, 2002). Pre-behandling, data mining og statistiske trin blev udført ved hjælp BioConductor biblioteker i R-miljø. Annotation og funktionel klassificering af diskriminerende gener blev udført ved hjælp af Affymetrix NetAffx systemet.

Reverse transskription og kvantitativ real time polymerasekædereaktion

Efter kvantitativ (NanoDrop) og kvalitativ analyse (Bioanalyzer RNA 6000 Pico Kit chip kit-RNA-program; RIN 8 i alle tilfælde), blev revers transkription udført ved anvendelse af 1 ug af total RNA (høj kapacitet cDNA Reverse transcription kit, Applied Biosystems, USA)

Kvantitativ real-time (QRT. ) PCR blev udført ved anvendelse af prober Master og SYBR green (Roche GmbH, Tyskland). Gene ekspressionsniveauerne for hver enkelt prøve blev normaliseret til GAPDH udtryk. Mean relative genekspression blev bestemt og forskelle blev beregnet under anvendelse af (t) fremgangsmåde 2-ΔC. Oligonukleotidprimere af TLR 9 (MyD88-afhængig) signalvejen er anført i tabel 1.

Cell levedygtighed assays

0.1×10

6 HT-29-celler blev podet ved en tæthed af 0.1×10

6 i Corning Cellbind cellekultur flerbrøndsplader i RPMI 1640, suppleret med gentamicin og FCS. Efter 24 timer blev mediet ændret; og, 15 ug tumor og normalt DNA [opløst i 200 pi sterilt phosphatbufret saltvand (PBS)] blev tilsat til brøndene. Den negative kontrol består af et passende volumen af ​​PBS. Cellerne blev inkuberet ved 37 ° C i en 5% CO2 atmosfære og 95% fugtighed i 72 timer.

Efter 72 timer behandling, blev cellerne høstet, vasket to gange i 0,5 ml sterilt PBS, resuspenderet i 1,0 ml iskold 70% ethanol og opbevaret ved -20 ° C. Måling blev udført i triplikater for hver behandlingsgruppe.

Prøver blev centrifugeret i 3 min ved 1300 rpm. Derefter blev cellerne resuspenderet i 300 μ1 ekstraktionsbuffer; og blev 3 pi RNAse (RNase A /T1 Mix, Thermo Fisher Scientific Baltikum UAB, Vilnius, Litauen) tilføjet. Efter 15 minutters inkubering ved stuetemperatur, 3 pi propidium jodide (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA;. Katalog nr 81.845) blev tilsat. FACS Målingen blev udført på BD FACScalibur (New Jersey, USA).

trypanblåteksklusion tests blev udført for at vurdere cellernes levedygtighed efter udsættelse for tumor og normal cellefri DNA. HT-29-cellens levedygtighed blev derefter kvantificeret ved at tælle antallet af levende og døde celler ved anvendelse af et hæmocytometer til tiden 72 timer efter tumor og normalt DNA administration.

Immuncytokemisk analyse

Fra HT-29 cellesuspension 2,5 ml blev anvendt til immuncytokemisk (ICC) analyser. HT-29 celler blev cyto-centrifugeret på et dækglas og fikseret i methanol ved -20 ° C i 10 minutter, og derefter inkuberet i TBS indeholdende 1% bovint serumalbumin, 10% normalt gedeserum, 0,3 M glycin og 0,1% Tween 20 , i 1 time for at permeabilisere cellerne og blokere ikke-specifikke protein-protein interaktioner.

2×10

5 HDFα fibroblaster blev podet til en Lab-Tek 8-brønds kammerobjektglas i 500 pi medier (Thermo Scientific, Rochester, NY) og dyrket indtil 80-90% sammenløb. Efter DNA behandling blev cellerne fikseret i iskold methanol ved -20 ° C i 10 minutter, og derefter inkuberet i PBS indeholdende 1% bovint serumalbumin, /10% normalt gedeserum, /0.3 M glycin og i 0,1% Tween 20, . TBS-Tween i 1 time for at permeabilisere cellerne og blokere ikke-specifikke protein-protein-interaktioner

i immunfarvning blev celler behandlet med muse-anti-humant monoklonalt anti-TLR9 IgG (1: 300; ab85860, Abcam, Cambridge, MA, USA), og anti-DNMT3a IgG (1: 300; ab13888, Abcam, Cambridge, MA, USA) ved 4 ° C natten over, under anvendelse af HeLa-celler som en positiv kontrol; anti-cytokeratin 20 (1: 200, klon: PCK-26, Dako, Glostrup, Danmark), E-cadherin (1: 2, klon: ECH6, Histopathology Ltd, Pecs, Ungarn) anvendelse af human colon mucosa som en positiv kontrol; og kanin-anti-NFKB IgG (1: 100, GTX102090, Genetex, San Antonio, Texas, USA) under anvendelse HepG2-celler som en positiv kontrol

Snit blev inkuberet i 30 minutter med peroxidase-mærkede polymer-peberrodsperoxidase. (HRP) konjugeret til gede-anti-muse /kanin immunoglobuliner (Envision + System-HRP-DAB, Dako, Glostrup, Danmark). Farvning blev afsluttet ved inkubation med 3,3’diaminobenzidine chromogenopløsning (chromogenopløsning er en del af Envision kit). Sektionerne blev modfarvet med hæmatoxylin.

ICC evaluering

Slides blev digitaliseret ved hjælp af en høj opløsning Panoramic Scan instrument (3DHistech Ltd., Ungarn) og analyseret med Panorama Viewer Histoquant Modul software (3DHistech Ltd ., Ungarn). 1000 celler /slide blev evalueret. I tilfælde af E-cadherin, CK20 blev cytoplasmatiske immunreaktioner scoret som negativ (-), svagt (+), moderat (++) og stærk (+++). NFKB, DNMT3a nukleare /cytoplasmatiske udtryk blev scoret som negativ (-), svag (+), moderat (++) og stærke (+++) immunreaktioner. Densiteten af ​​negative (-)., Svag (+), moderat (++) og stærkt positive (+++) pixels i immunreaktive celler blev evalueret

Resultater Salg

Virkning af normale og malign epitelcelle DNA til HT-29-celler

først vi behandlede HT-29-celler med DNA isoleret fra normalt eller tumorvæv. Begge behandlinger inducerede mRNA overekspression af metallothionein gener (dvs. MT1H, MT1G, MT1X, MT1P2 og MT2A) (metallothionein 1H, -1G, -1x, -1P2, -2A) (fig 1A og 1B). Tumorvæv afledt DNA behandling resulterede i signifikant overekspression af n = 118 gener (på mRNA-niveauet). Blandt disse gener, vi observerede metastase forbundne gener fx tumor biomarkør CEACAM5 (carcinoembryonisk antigen-relateret celleadhæsionsmolekyle 5), metaboliske gener fx INSIG1 (insulin induceret gen 1) LIPG (endotel lipase) og budbringermolekyle gener DAPP1 (dobbelt adapter af phosphotyrosin og 3-phosphoinositider), CREB3L2 (cAMP responsive element bindende protein 3-like 2) (tabel 2)

Heat kort repræsenterer RNA udtryk ændringer i kontrol HT-29 celler og HT-29 celler behandlet med DNA isoleret fra sunde (A) og tumorform (B) colon epitel.

En komplet liste over regulerede gener er tilgængelig på (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo) med tiltrædelse nummer GSE67557.

Analyse af 12 elementer i TLR9 vej i HT-29 celler ved QRT-PCR

HT-29-celler enten tumor og sundt kolon væv afledt DNA påvirkede signifikant ekspression af IL-1β-genet relateret til PBS-behandlede kontroller. Overekspression af dette gen var højere efter tumorvæv afledt DNA behandling (log Fc 2,33; p ≤ 0,05), end i prøver behandlet med normalt DNA (log Fc 1,59; p ≤ 0,05) relateret til ubehandlede kontroller (Fig 2A og 2B).

Expression ændringer i TLR9 MyD88 afhængig pathway gener på Affymetrix U 133 2.0 microarray i kontrol, normal og tumorform DNA behandlede prøver (A) Figur og q RT-PCR analyse af TLR9 MyD88 afhængige vej af HT-29 celler ( B).

Cell levedygtighed analyser

resultaterne af trypan udelukkelse test blå afspejles, at tumor celle fri DNA behandling signifikant øget levende celle nummer i forhold til kontrolgruppen (av. 54,22 ± 3,03 vs. 42.00 ± 3,78; p ≤ 0,05). Vi også detekteret signifikant nedsat antal levende celler i normalt DNA behandlede gruppe relateret til kontrolgruppen (av 28,67 ± 3,08 versus 42,00 ± 3,78;. P ≤ 0,05); (Fig 3A og 3B)

antallet af levende (A) og døde (B) HT-29-celler bestemt ved trypanblå eksklusion test.; PI-celle-cyklus analysen af ​​HT-29 coloncancer-celler (C).

PI cellecyklus-analyse viste signifikant højere levende celle population (G1 + S + G2 + M-fase) i tumor-DNA behandlet gruppe versus kontrolgruppen (av 39,11 ± 0,57 vs. 32,00 ± 2,50;. p ≤ 0,05). Normal DNA behandling ikke påvirket cellecyklus af optalte celler, men vi observeret en lavere celletal i normale DNA behandlede prøver (figur 3C).

Effekt af normal og malign epitelial DNA på fibroblastceller

Behandling af HDFα fibroblaster med normalt DNA resulterede i overekspression af mange gener i TLR9 MyD88 pathway, cytokiner, kemokiner, vækstfaktorer, apoptosis relaterede gener og prostaglandiner. I alt DNA fra normale colon væv resulterede i en signifikant udtryk ændring for n = 613 gener (Fig 4A). I modsætning hertil behandling med tumorvæv-afledt DNA påvirkede ekspressionen af ​​kun n = 12 gener (Fig 4B).

Heat kort repræsenterer RNA-ekspression ændringer i kontrol- HDFα celler og HDF-a-celler behandlet med DNA isoleret fra sund (A) og tumorform (B) tyktarmsepitelet.

Vigtige genekspression forandringer som følge af sundt væv stammer DNA behandling i HDFα celler er opsummeret i tabel 3. cellefrit DNA inducerede opregulering af kemokin ligander som kemotaktiske faktorer, prostaglandiner og receptorer for prostaglandiner ud over de DNA-sensing pathways.

Efter tumor-DNA behandling af HDFα fibroblaster, vi observeret nogen overekspression af elementerne i TLR9 pathway, kemokiner, vækstfaktorer , apoptose gener, prostaglandiner og receptorer for prostaglandiner.

En komplet liste over regulerede gener er tilgængelig på (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo) med tiltrædelse nummer GSE67557.

Analyse af 12 elementer af TLR9 pathway i fibroblaster fra QRT-PCR

Fem gener af kanonisk TLR9 pathway (IRAK2, MyD88, NFKB, IL-8, IL-1β) viste signifikant overekspression efter behandlingen med normalt væv afledt cellefri DNA relateret til kontrolceller. Tumorvæv afledt DNA behandling ikke påvirket generne af TLR9 MyD88 pathway. (Log Fc ≥1, p ≤ 0,05); (Fig 5A og 5B).

Expression ændringer i TLR9 MyD88 afhængige vej gener på Affymetrix U 133 2.0 microarray i kontrol, normal og tumorform DNA behandlede prøver (A) og q RT-PCR-analyse af TLR9 MyD88 afhængige vej på HDF alfa-celler (B).

ICC analyse af epitel differentiering, vedhæftning og methylering markører

Her er vi udvalgt tre epitel markører dvs CK20. E-cadherin, DNMT3a baseret på vores tidligere resultater. [28] PBS behandlede HT-29-celler udviste svag membran CK20 (Fig 6A), E-cadherin (fig 6D) og svag /moderat cytoplasmisk DNMT3a (Fig 6G) proteinekspression. Tumor-DNA behandling inducerede stigning i ekspression af CK20 stærk positiv (+++) pixels, (Fig 6C) E-cadherin svag (+) og moderat (++) positive pixels (Fig 6F) og DNMT3a svage (+) positive pixels ( fig 6I). (P ≤ 0,05). Tumor-DNA fremmes CK20 og E-cadherin-ekspression i de ikke-opdelte, HT-29 colon-adenocarcinom celler både mRNA og protein niveau (tabel 4, fig 6C og 6F) (p ≤ 0,05). DNMT3a proteinoverekspression korreleret med de tidligere resultater [28].

CK20 ekspression i HT-29 coloncancer-celler efter behandling med sterilt PBS (A), ved DNA fra normal colon epitel (B), ved DNA fra tumorøse colon epitel (C) E-cadherin ekspression efter behandling med sterilt PBS (D), ved DNA fra normal colon epitel (E), ved DNA fra tumorøse colon epitel (F) DNMT3a ekspression efter behandling med sterilt PBS (G) ved DNA fra normal colon epitel (h), ved hjælp af DNA fra tumorform colon epitel (i).

ICC analyse af transkriptionsfaktorer og methylering markører i fibroblaster

NF-KB (p65 subunit) afspejlede svage cytoplasmisk /nucleolic ekspression i PBS-behandlede kontrol-fibroblaster (fig 7D). I kraft af normalt væv DNA (Fig 7E), men ikke tumorvæv stammer DNA, (Fig 7F) fibroblasterne afspejles stigning i ekspression af NFKB svagt positive pixels (+).

DNMT3a ekspression i HDF alfa fibroblaster efter behandlingen med sterilt PBS (A), ved DNA fra normal colon epitel (B), ved DNA fra tumorøse colon epitel (C), NFKB ekspression efter behandling med sterilt PBS (D), ved DNA fra normal colon epitel (E ), ved hjælp af DNA fra tumorform colon epitel (F).

Det cytoplasmatiske DNMT3a udtryk var på en svag (+), moderat (++) niveau i normale fibroblaster (fig 7A). Forholdet mellem svage (+) positive pixels blev let øget efter normal og tumor-DNA behandling (fig 7B og 7C).

Vores immuncytokemiske resultater på HT-29-celler og HDFα fibroblaster er opsummeret i fig 8A, 8B , 8C, 8D og 8E.

ICC evaluering af CK20 (A), E-cadherin (B) og DNMT3a (C) på HT-29 coloncancer-celler og NFKB (D) og DNMT3a (E) i HDF alfa fibroblaster.

diskussion

Hovedformålet med vores arbejde var at undersøge ændringer i genekspression efter indgivelse af celle fri DNA isoleret fra sunde og tumorøst colon væv på HT-29 epitelceller og fibroblaster. Vi er ikke bekendt med nogen undersøgelser, der har undersøgt udtryk ændringer i de to forskellige celletyper der samarbejder under tumorigenese eller effekten af ​​celle fri DNA fra forskellige oprindelser. Ifølge de seneste offentliggjorte undersøgelser, bakterielt DNA aktiverer DNA sensing receptorer, muligvis på grund af frekvensen af ​​umethylerede CpG-sekvenser i bakterielle genom, der er 20 gange højere end hos hvirveldyr ‘genom. [35] Fra yderligere undersøgelser stod det klart, at DNA fra patogene bakterier opregulere TLR9 udtryk [15], i nærværende undersøgelse har vi undersøgt genekspression forandringer som følge af DNA af tumor oprindelse i kræftceller, ved hele genomet array. Denne fremgangsmåde er den samme som rapporteret af Lee et. al. (2014), som viste optagelsen, inkorporering og effekt af denne tumor væv opstod DNA på celleproliferation. [13]

Vores genekspression resultater bekræftes align med observationer i de seneste publikationer, der viste, at intakt tumor DNA binder som en ligand til TLR9 men resulterer ikke i nedstrøms aktivering af TLR9 pathway [36]. I vores undersøgelse, vores hele genom array-resultater fremlagt beviser, at tumorform DNA fungerer som en pro-metastatisk faktor uafhængigt af de TLR9 og sting veje ved at inducere overekspression af metastase-associerede gener (MACC1, MALAT1, TACSTD2), tumor markør (CEA) , metaboliske gener (INSIG1, LIPG) og messenger molekyle gener (DAI, CREB3L2). MACC1 er et vigtigt pro-metastatisk faktor, der viste signifikant overekspression efter behandling med tumor-DNA. Dette gen er tæt forbundet med de ændringer af udtryk for celle cycle- og invasion-relaterede proteiner. [37] Vores resultater afspejler overekspression af andre vigtige pro-metastatiske gener (MACC1, MALAT1, TACSTD2) bekræftes af tidligere data, der afspejler den store rolle af disse gener i metastase og deres sammenslutning med dårlig prognose i forskellige humane epiteliale cancere. [29, 37, 38]

Tumor væv afledt DNA behandling påvirkes INSIG 1 og LIPG ekspression. Disse to nøgleelementer i endothelial lipidmetabolisme er også kendt for at være forbundet med cancer progression. [31, 32] blev Øget LIPG udtryk rapporteret som en mulig urin kræft biomarkører. [32] Undersøgelser beskrevet forøget ekspression af sekundære messenger molekyler (DAI, CREB3L2) i tyktarmskræft med væksten og invasion af tyktarmskræft celler via PI3K /AKT-vejen aktivering. [33]

Vi observerede, at behandling med tumor-DNA også resulterer i overekspression af cytokeratin 20 og E-cadherin som blev valideret både på RNA (tabel 4) og proteinniveauet (fig 6C og 6F ). E-cadherin som en meget vigtig faktor, der regulerer celle-celle interaktion viste også højere ekspression i HT-29 celler behandlet med tumor-DNA. E-cadherin overekspression fører til undertrykkelse af β-catenin-Tcf /Lef-afhængig transskription og sandsynligvis hæmmer celle apoptose. [39]

DNA methylering ændringer medieret af DNMT3a er karakteristiske for tyktarmskræft. Re-udtryk faktorer målrettet DNMT3a udtryk signifikant nedsat tumorvækst. DNMT3a overekspression efter behandling med tumor-DNA udleder en potentiel forbindelse mellem status for methylering af tumorvæv afledt DNA og virkningsmekanismen af ​​tumor- væv afledt DNA-sekvenser, der virker gennem DNA sensing receptorer. Tidligere undersøgelser fremhæver en afgørende rolle af dette enzym i kolorektal cancer formation. [40]

Tyktarmskræft væv er ikke isoleret, men med sin cellulære miljø gennem kemokiner, cytokiner, vækst og apoptose signaler kommunikerer med andre væv. Undersøgelser har undersøgt den rolle, de normale og cancer associeret fibroblaster (CAFS) i kolorektal cancer og viste, at CAF co-dyrket med epitelceller øger tumorvækst [41], men de kan ikke fastlægge den rolle, normale fibroblaster separat i tumorigenese. Vores mål var at bestemme reaktion af normale fibroblaster omkring epiteliale krypter til den frigjorte DNA og til at screene de veje der indgår i denne proces.

I normal fibroblast behandling med DNA fra normalt væv forårsaget aktivering af TLR9 kanonisk pathway som QRT-PCR viste overekspression af mange gener involveret i TLR9 MyD88 afhængige vej (MyD88, IRAK2, NFKB, IL-8, IL-1β).

fra hele genomet microarray analyseresultater vi kan konkludere, at sunde DNA i fibroblast er ikke kun anerkendt af TLR9 MYD 88 afhængige vej, men vi fandt, at de elementer af STING-afhængige cytosoliske vej viste også signifikant overekspression, som starter IFN produktion. Brug af Kegg pathway kortet (https://www.genome.jp/kegg-bin/show_pathway?hsa04623+340061) 4 gener (Adar, IRF7, CXCL10, CASP1) fra STING vej viste signifikant overekspression efter behandlingen med sund DNA i HDF-a fibroblaster. Dette aktiverede cGAS /STING-afhængige DNA sensing pathway induceret overekspression af interferon regulatoriske faktorer IRF1, IRF2, IRF7, IRF9. og induceret forøget ekspression af interferon-receptorgener (IFNAR2, IFNGR2). (Log FC≥1, p ≤ 0,05) Den overekspression af CASP1 og NLRC 5 tyder NLRC5-afhængig aktivering af inflammasome. Davis et. al. offentliggjort, at NLRC5 samarbejder med NLRP3and RNA-interferens-medieret knockdown af NLRC5 næsten elimineret caspase en aktivitet. [42]

NFKB som en regulatorisk transkriptionsfaktor viste signifikant overekspression i fibroblaster behandlet med normalt DNA. (Fig 7E) Det viser, at cellefri DNA induceret NFKB translokation regulerer frigivelsen af ​​proinflammatoriske cytokiner og vækstfaktorer.

hele genomet microarray analyse viste en markant anderledes antal gener der regulerer sundt og tumor væv afledt DNA administration (613 og 12 gener, henholdsvis). Mens sund DNA aktiveret DNA sensing systemer og opreguleret mange gener for cytokiner, kemokiner, vækstfaktorer, apoptose gener, prostaglandiner, tumor-DNA berørte kun få gener, der ikke involverer i denne regulerende processer. Vi mener, at normale fibroblaster ikke reagerer på tumor-DNA og en langsigtet kræft-fibroblast interaktion kunne indlede en transformation af normale fibroblaster til carcinoma-associerede fibroblaster understøtter “metastatisk” fænotype.

Vores undersøgelse peger den mulige metastaser