PLoS ONE: Transkriptomet profilering Caco-2 Kræft cellelinje efter Behandling med Uddrag fra Jod-Biofortified Salat (Lactuca sativa L.)

Abstrakt

Selvom iodization af salt er den mest almindelige metode til at opnå jod-berigede fødevarer, jodmangel lidelser er stadig et globalt sundhedsproblem og dybt påvirke kvaliteten af ​​menneskers liv. Jod er nødvendig for syntesen af ​​skjoldbruskkirtelhormoner, som er afgørende regulatorer af menneskelige stofskifte, cellevækst, proliferation, apoptose og er blevet rapporteret at være involveret i carcinogenese. I denne undersøgelse, for første gang, vi evaluerede effekten af ​​jod biofortified salat på transkriptom profil Caco-2 cancer cellelinje ved at anvende den Whole Human Genome Microarray assay. Vi viste 1326 differentielt udtrykt Caco-2 udskrifter efter behandling med jod biofortified (BFL) og ikke-berigede (NFL) ekstrakter salat. Vi analyserede veje, molekylære funktioner, biologiske processer og protein klasser baseret på sammenligning mellem BFL og NFL specifikke gener. Iod, som forventedes at fungere som en fri ion (KI-NFL) eller i det mindste delvist skal indarbejdes i salat makromolekyler (BFL), forskelligt regulerede veje for talrige transkriptionsfaktorer, der fører til forskellige cellulære virkninger. I denne undersøgelse viste vi inhiberingen af ​​Caco-2 celler proliferation efter behandling med BFL, men ikke kaliumiodid (KI), og BFL-medieret induktion af mitokondriel apoptose og /eller celledifferentiering. Vores resultater viste, at jod-biofortified planter kan bruges effektivt af celler, som en alternativ kilde til denne sporstoffet. Desuden kan de observerede forskelle i virkningen af ​​både jod kilder antyder et potentiale på BFL i kræftbehandlingen

Henvisning:. Koronowicz AA, Kopec A, Master A, Smolen S, Piątkowska E, Bieżanowska-Kopec R, et al. (2016) Transkriptomet Profilering af Caco-2 Kræft cellelinje efter Behandling med Uddrag fra Jod-Biofortified Salat (

Lactuca sativa

L.). PLoS ONE 11 (1): e0147336. doi: 10,1371 /journal.pone.0147336

Redaktør: Maria Cristina Vinci, Centro Cardiologico Monzino, ITALIEN

Modtaget: Juli 30, 2015; Accepteret: December 31, 2015; Udgivet: 22 Jan 2016

Copyright: © 2016 Koronowicz et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Data tilgængelig fra Gene Expression Omnibus. Det GEO nummer er: GSE7160

Finansiering:. Dette arbejde blev finansieret af 2012-2015 polske National Science Center, give no. Dec-2011/03 /D /NZ9 /05560: “Jeg og Se bioforstærkning af udvalgte grøntsager, herunder indflydelsen af ​​disse mikroelementer på kvalitet udbytte samt evaluering af jod absorption og udvalgte biokemiske parametre i rotter fodret med grøntsager biofortified med jod. “

konkurrerende interesser: forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Utilstrækkelig indtagelse af kosten jod kan resultere i jodmangel, som kan forårsage mange sundhedsskadelige. virkninger [1, 2, 3, 4]. På nuværende tidspunkt er den mest effektive måde at kontrollere jod mangler er en udbredt iodization bordsalt. Men i de fleste industrialiserede lande for stort salt bliver en risikofaktor for kardiovaskulære sygdomme, osteoporose eller endda mavekræft [5, 6]. Desuden bør det overvejes, at visse mængder af jod kan gå tabt under fremstilling og forarbejdning af fødevarer, for eksempel på grund af brugen af ​​høje temperaturer [7]. Uorganisk iod er flygtigt, og det er vanskeligt at styre sit tab under lagring og transport, såvel som madlavning, især med anvendelse af højtemperatur-olier. I denne sammenhæng bioforstærkning af grøntsager med jod under deres dyrkning er en betydelig måde at øge forbruget iod, især fordi jod til stede i fødevarer kan nemt assimileret [8] og næsten udelukkende absorberes [7]. Bioforstærkning af planter er velkendt og realiseret gennem nogle bioteknologiske eller agronomiske metoder [9, 8, 10, 11, 12]. Gulerødder, tomater, kartofler og salat forbruges dagligt i de fleste familier. Derfor styrkende disse grøntsager med iod er et fordelagtigt måde at forbedre iod ernæringstilstand forbrugerne uden risiko for dens overdrevne indtag. Salat er en grøn grøntsag, som normalt spises rå uden risiko for jod tab, derfor er det en god afgrøde til jod-bioforstærkning undersøgelse [13].

I vores tidligere undersøgelser viste vi høj effektivitet af jod bioforstærkning af salat ved jordens gødskning med kaliumiodid (KI). Desuden har vi også observeret koncentration øget jod i urin samt i udvalgte væv af eksperimentelle rotter, som et resultat af at supplere deres kost med sådan jod biofortified salat [14].

Tilgængelig litteratur viser, at jodmangel stiger risikoen for thyreoidea [15, 7], mave [16, 17], bryst [18, 19] og prostata [20] cancer. Antitumorvirkninger af iod kan skyldes dens antioxidant, anti-proliferative, anti-inflamatory, samt pro-apoptotiske og pro-differentierende [21, 22, 23] virkninger. I aktuelle undersøgelse, vi fastslået, at ekstrakter fra jod-biofortified salat (BFL) reducerede spredning af tyktarmskræft cellelinje. Vi formoder, at det kan være relateret til ændringen i ekspression af gener involveret i proliferation og cellecyklus.

For bedre at forstå underliggende molekylære mekanisme BFL handling vi anvendte, for første gang, en hel genom microarray analyse af den transkriptionelle profil af humane Caco-2-celler. Vi sammenlignede forskelligt regulerede gener i celler behandlet med ekstrakter fra enten jod biofortified eller ikke-berigede salat. Endelig har vi bestemt og analyseret potentielt berørte cellulære veje, biologiske processer, molekylære funktioner og protein klasser.

Materialer og metoder

Udarbejdelse af ekstrakter fra biofortified

salat

Salat ‘Melodion ‘cv. blev dyrket og gødet med KI som beskrevet af Kopec et al. [14]. Koncentrationen af ​​iod var 0,50 mg /100 g tørvægt (D.M.) for biofortified salat og 0,12 mg /100 g D.M. til styring salat [14]. Frisk salat (10 g) blev knust under anvendelse af en homogenisator (CAT type X 120, USA) og næste overført til Erlenmaier kolbe med vand i temperatur 90-100 ° C. Salat materialer blev ekstraheret ved omrystning (Elpan, vandbadryster typen 357, Polen) ved 100 ° C temp. i 2 timer, og næste opløsning blev centrifugeret (Centrifuge typen MPW-340, Polen). Så den del af ekstrakterne blev anvendt til jod måling og andre dele blev opbevaret ved -80 ° C i studier af cellekulturer.

Bestemmelse af ekstraktet iodkoncentration

Fordøjelse af 10 cm

3 prøver af ekstrakt salat i blandingen af ​​10 cm

3 65% HNO

3 (superpure, Merck, Whitehouse Station, NJ, USA) og 0,8 cm

3 70% HClO

4 ( superpure, POCH, Gliwice, Polen) blev gennemført i mikrobølgeovnen systemet CEM MARS-5 Xpress. Indholdet af jod (I

-) blev analyseret ved kold damp generation teknik med brug af høj-dispersion ICP-OES (induktivt koblet plasma Optical emissionsspektrometri) Prodigy spektrometer-Leeman Labs, New Hampshire, Massachusetts, USA [24 , 25]

betingelser for cellekultur

human colon-cellelinie Caco-2 (colorektal adenocarcinom; HTB-37). blev erhvervet fra American Type Culture Collections (ATCC, Manassas, VA, USA). Celler blev dyrket i en inkubator, under kontrollerede forhold (temp, 37 ° C,. Luft, 95%; CO

2, 5%), i Eagles Minimum Essential Medium (Sigma, Saint Louis, MO, USA), med føtalt bovint serum (FBS) (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) til en endelig koncentration på 20%, ifølge ATCC procedure.

Cell behandlinger

Celler blev podet i 96-brønds dyrkningsplader (Becton, Dickinson and Company, Warszawa, Polen) for cellernes levedygtighed og spredning eller 6-brønds dyrkningsplader (Becton, Dickinson and Company, Warszawa, Polen) til RNA isolering i 24 timer, i henhold til protokollen af ​​Roche (Basel , Schweiz) og A A Bioteknologi (Gdynia, Polen), hhv. Efter den tid blev vækstmedium erstattet med medium, der indeholder a) ekstrakt fra ikke-berigede salat (kontrol salat, NFL) med jod indhold 27,6 pg /dm

3, b) ekstrakt fra jod-biofortifed salat (BFL) med jod indhold 186,7 pg /dm

3, c) kaliumiodid tilføjet til NFL (KI-NFL) i koncentrationen af ​​186,7 mg /dm

3. En endelig koncentration jod i dyrkningsmedier var 107,33 nmol /dm

3 for NFL og 441,37 nmol /dm

3 for BFL. En slutkoncentration iod i KI-NFL gruppe var den samme som i BFL gruppe. I alle undersøgelser blev mindst 4 brønde undersøges per behandling. Forsøg blev gentaget 3 gange.

Cellelevedygtighed og proliferation

Cellelevedygtighed blev målt ved anvendelse Cytotoksicitet Detection Kit (LDH) (Roche, Basel, Schweiz) ifølge fabrikantens protokol. Cytotoksicitet blev vurderet til uddrag af BFL med endelige koncentrationer af jod svarende til 147,12; 294,25 og 441,37 nmol ved tidsintervaller på 24, 48 og 72 timer og beregnes efter formlen:

Cell proliferation blev bestemt ved anvendelse af 5′-brom-2′-deoxy-uridin Mærkning og Detection Kit III ( Roche, Basel, Schweiz), ifølge producentens anvisninger. Proliferation blev standardiseret til 100% af kontrollen. Analysen af ​​prøver blev udført tredobbelt og i tre uafhængige forsøg. Statistisk analyse blev udført under anvendelse af en to-halet t-test.

RNA-isolering, validering, mærkning og hybridisering

Totalt RNA blev isoleret fra cellerne ved anvendelse af RNA isolation kit fra cellekulturer ( A A Bioteknologi, Gdynia, Polen). RNA mængde blev målt med NanoDrop (NanoDrop Technologies, USA). Analysen af ​​den endelige RNA kvalitet og integritet blev udført med en Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). For at sikre optimal datakvalitet, blev der kun prøver med RNA integritet nummer (RIN) ≥8.0 inkluderet i analysen. Analysen af ​​gen-ekspression profil blev udført ved anvendelse SurePrint G3 Human Gene Expression 8x60K v2 Microarray (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). Hver slide indeholdt 8 mikroarrays repræsenterer ca. 50000 probe sæt. Low Input Quick Amp Labeling Kit, to-farvet (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) blev anvendt til at amplificere og mærke mål-RNA til dannelse komplementært RNA (cRNA) for oligo-microarrays anvendes i genekspression profilering. Eksperimenter blev udført ved hjælp af en fælles reference design, hvor fælles reference var en pulje af lige mængder af RNA fra kontrol celler.

På hver af to-farve microarrays, vi hybridiseret 300 ng cRNA fra puljen (mærket Cy3) og 300 ng cRNA (mærket Cy5). I alt kørte vi 12 mikroarrays-tre for hver forsøgsgruppe. Microarray hybridisering blev udført med Gene Expression Hybridisering Kit (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA), ifølge fabrikantens protokoller. RNA Spike I Kit (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) blev anvendt som en intern kontrol. Erhvervelse og analyse af hybridisering intensiteter blev udført ved hjælp af Agilent mikromatrice scanner (G2565CA, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA).

Signal detektion og statistisk analyse

Data blev udtrukket og baggrund trækkes ved hjælp af de standardprocedurer, der er indeholdt i Agilent Feature Extraction (FE) Software version 10.7.3.1. FE udfører en Lowess normalisering. Statistisk analyse blev udført under anvendelse Gene Spring 12.6.1 software (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). Prøver undergik kvalitetskontrol og resultaterne viste, at hver prøve havde en lignende QC metrisk profil. Det næste skridt var at filtrere probe sæt med flag for at fjerne dårlig kvalitet prober (fraværende flag). Statistisk signifikans af forskellene blev vurderet ved anvendelse af en envejs-ANOVA og Tukeys HSD post hoc-test (p 0,05). En korrektion multiple test blev udført ved hjælp Benjamini og Hochberg Falsk Discovery Rate (FDR) 5%. Mikroarraydata blev deponeret hos Gene Expression Omnibus datalager under nummer GSE71605 og fulgte MIAME krav. At identificere signalveje og genfunktioner microarray data blev analyseret ved anvendelse Panther Classification System-en online database.

RT og Real-time PCR-analyse

Revers transkription blev udført under anvendelse af 1 ug af total RNA isoleret fra cellerne med Maxima første cDNA-syntese kit til RT-qPCR (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA). Kvantitativ kontrol af gener blev udført ved hjælp af CFX96 Touch

™ Real-Time PCR Detection System instrument (Bio Rad, Hercules, CA, USA), udnytte SYBR Green Precision Melt Supermix kit (Bio-Rad). Betingelser for individuelle PCR reaktioner blev optimeret til to givne oligonucleotidprimere (S1 Table, Støtte Information) på grundlag af forhold som følger: 95 ° C, 10 min; 45 PCR-cyklusser ved 95 ° C, 15 s; 59 ° C, 15 s; 72 ° C, 15 s, efterfulgt af smeltekurveanalyse (65-97 ° C med 0,11 ° C stigningsgrad og 5 erhvervelser pr 1 ° C). Resultaterne blev normaliseret ved hjælp af

GAPDH

,

ACTB

og

HPRT

reference- gener. Forskelle i genekspression mellem BFL og NFL grupper blev vurderet ved Students t-test.

Resultater

Cell levedygtighed og spredning

Vi bestemt, at jod biofortified ekstrakt salat undertrykte spredning af Caco-2 mere effektivt end ekstraktet fra ikke-berigede salat (figur 1). LDH cytotoksicitet test bekræftet, at observerede effekt ikke var forårsaget af nekrose. Vi fandt ingen signifikant LDH cytotoksicitet af BFL ekstrakt på Caco-2-cellelinje til enhver studerede iodkoncentration (data ikke vist). Celleproliferation blev ikke påvirket af KI Foruden NFL ekstrakt. Yderligere blev indflydelsen af ​​BFL og NFL på proliferation af normale FHC cellelinje undersøgt og blev observeret noget fald i celleproliferation (data ikke vist).

Værdierne er udtrykt som middelværdi ± SEM for n ≥ 9 , standardiseret til NC som 100%. Statistisk signifikans blev baseret på t-test * p 0,05 versus (vs). NC og ^ p 0,05 vs NFL.

Jod-biofortified salat specifikke gener i Caco-2-cellelinje

I alt 2603 udskrifter blev analyseret. Vi viste, at ca. 50% af transkripter (1326 af 2603) blev udtrykt differentielt mellem celler behandlet med BFL og NFL (tabel 1). Listen over BFL specifikke udskrifter præsenteres i Støtte Information (S2 Table, Støtte Information). Blandt dem, ved hjælp af en Pathway Studio program, vi bestemt (tabel 2) og visualiseres samspillet mellem gener og proteiner som reaktion på jod (fig 1 og 2). Vejviser

Gener specifikt reguleret af jod biofortified ekstrakt salat i Caco-2-cellelinje

Interaktioner af BFL specifikke gener (S2 Table, Støtte Information) som svar på jod (fig 2) blev genereret automatisk ved hjælp af en Pathway Studio program. Som vist i figur 2, jod påvirker:

IGF1

,

TG

,

PPARG

,

GPX1

,

FOS

,

SLC6A4

,

NOS2

, og

THRB

gennem up- /nedregulering af deres udtryk og /eller andre molekylære funktioner. Jod indirekte aktion afspejles hovedsageligt gennem thyroglobulin (TG), som tyrosinrester ioderes i syntesen vej af thyreoideahormon (TH). Således er TG direkte involveret i jod metabolisme og er blevet rapporteret at være associeret med talrige iodmangelsygdomme [26, 27]. Ifølge Pathway Studio Program, jod, er der kovalent bundet til TH og dens syntetisk analog (levothyroxin), kan påvirke ekspressionen eller aktiviteten af ​​

NOS2

,

HMOX1

,

NPPB

,

TXN

,

ABCB1

,

G6PD

,

MYLK

samt

THRB

koder thyroidhormonreceptor beta (TRβ1). På det genomiske niveau, TRβ1, som er et TH-ligand-transskriptionsfaktor, kan påvirke mRNA-niveauer af multiple gener, herunder reguleres positivt type 1 iodthyronin deiodinase

DIØ1

og reguleres negativt

E2F1

transkriptionsfaktor involveret i cellecyklusprogression (figur 2). Denne receptor menes også at være en mediator af ikke-genomisk virkning af TH, som er ansvarlig for aktivering af plasmamembran integrin avp3 efterfulgt af aktivering af downstream veje, der fører til phosphorylering af ERK1 /ERK2 og TRβ1 proteiner. Endvidere kan T3-medieret dannelse af cytoplasmatiske TRβ1 komplekser med p85-underenheden af ​​PI3K aktivere nedstrøms mTOR-afhængige veje, der kan forklare pleiotrope virkninger af TH [28]. Alle disse direkte og indirekte relationer mellem generne påvirket af jodholdige molekyler kan svare, i det mindste delvis, med vores resultater viser forskelle i virkningen af ​​iodid kaliumsalt (KI) og iod, der kan inkorporeres i makromolekyler af biofortified salat.

Derudover er indbyrdes forhold mellem BFL specifikke gener som reaktion på jod i Caco-2 celler (tabel 2), der præsenteres i figur 3.

Real-time PCR

Real-time PCR-analyse blev udført for nukleare receptorer af thyreoideahormon (TRS): thyreoideahormon receptor, alfa (

thrA

) kodning TRa proteinisoformer og skjoldbruskkirtel hormon receptor, beta (

THRB

), der koder TRp receptorer, såvel som for DIØ1, der er positivt reguleret af TRs og reguleres negativt E2F1. For at bestemme, om ændringer i genekspression i BFL kan være et resultat af iodidion (I

-) handling, KI i den samme koncentration som i BFL sattes til NFL. Som følge heraf blev niveauer af TRβ1 mRNA faldt i begge ekstrakter, og der var ingen væsentlige ændringer i TRa udskrifter. En væsentlig forøgelse af DIØ1 mRNA blev observeret i cellelinier behandlet med BFL og KI-NFL ekstrakter. Ekspression af E2F1 mRNA blev reduceret i BFL ekstrakt og steg i KI-NFL ekstrakt (tabel 3). Data fra med Real-Time PCR viste den samme tendens, kontrol af microarray resultater.

Gene ontologi molekylær komplet analyse

Dernæst undersøgte vi Gene Ontology (GO) for alle BFL vs . NFL forskelligt regulerede udskrifter (S2 Table, Støtte Information), ved hjælp af Panther Classification System. Resultater opnået ved analyse af de signalveje er præsenteret i tabel 4. GO biologiske processer, molekylære funktioner og protein klasser præsenteres i Støtte Information (S3-S5 Tables).

Diskussion

til vores bedste viden, vores undersøgelse er den første til at evaluere effekten af ​​jod biofortified salat, på transkriptom profil Caco-2-cellelinien. Det er også første til at vise hæmning af tyktarmskræft celler proliferation som respons på jod biofortified ekstrakt salat behandling (figur 1). Vi formoder, at reduktionen i cellelevedygtighed kan være forårsaget af tilstedeværelsen af ​​iod, som blev inkorporeret i plantens struktur. Tilsætningen af ​​KI til NFL ekstraktet påvirkede ikke reduktion af BrdU syntese. Dette kan tyde på, at i BFL, er jod kovalent bundet til lipider eller proteiner af chloroplast membraner [29,30,31,32], selv om der er behov for yderligere undersøgelser. Denne organiske form af jod kan påvirke veje fører til levedygtighed reduceret celler. Det er angivet, at jod behandlinger inhiberer celleproliferation ved at generere iod-lipider, herunder 6-iod-5-hydroxy-8,11,14-eicosatriensyre (et ioderet arachidonsyre) og iodohexadecanal [33, 34]. er blevet påvist disse forbindelser efter iod (I

2) tilskud, og det formodes, at de kan være potente aktivatorer af peroxisomproliferatoraktiveret receptor typen gamma (PPARy) [35]. I vores undersøgelse, vi observerede faldt af PPARy-mRNA efter behandling med BFL, såvel som den samme tendens PPARy målgener (fedtsyrebindende protein 4,

FABP4;

Frakobling protein 1,

UCP- 1

, Glycerol-kinase,

GK

) (S2 Table, Støtte information). Derfor kan observeres reduktion af celleproliferation være forårsaget af induktion af apoptose (PPARy-uafhængige) og /eller differentiering [36, 37, 38]. Derudover ifølge andre forfattere, bioaktive forbindelser med salat har evnen til at inhibere DNA beskadigelse i N2A muse-neuroblastomceller [39]. I vores forskning har vi ikke undersøger indflydelse BFL på genetiske skader. under hensyntagen til den observerede reduktion i Caco-2-celleproliferation efter BFL behandling kan vi antage sin positive virkning på mekanismerne for genotoksicitet.

I denne undersøgelse som de første, vi viste imidlertid, Caco-2 udskrifter specifikt reguleret af ekstrakter af jod biofortified salat (S2 Table, supplerende oplysninger). Baseret på disse transkripter, vi peger nogle karakteristiske veje, herunder apoptose signalering (tabel 3). Analysere ekspressionen af ​​apoptose markører, differentielt reguleret som respons på BFL vs. NFL ekstrakter identificerede vi mitokondrie apoptose som den mest sandsynlige signalvej. Det blev indikeret ved forøget ekspression af pro-apoptotisk Casp2 og Ripk1 domæne indeholdende Adaptor Med Døden Domain (CRADD) og nedsat anti-apoptotiske X-Linked hæmmer af Apoptose (XIAP) og Bcl2-Associated Athanogene 3 (BAG3). Caspase-2 i indgreb med en mitochondria-afhængig apoptotiske vej, ved at inducere mitokondrielle proteiner dvs. Bcl-2 og Bcl-XL (som blokerer caspase-2), CRADD, som inducerer celledød [40]. XIAP er en direkte inhibitor af caspase-aktivitet [41], mens forøget ekspression af BAG3 i cancere er forbundet med opretholdelsen af ​​celleoverlevelse, behandling resistens og forøget metastase [42]. Vores resultater er i overensstemmelse med rapporter fra andre forfattere, (dvs. på prostata- og brystcancerceller), der viser induktionen af ​​mitokondrisk apoptosecyklus ved en direkte antioxidant /oxidationsmiddel mitokondriel virkning af iodid (I

-) og iod (I

2) [35, 43] eller indirekte dannelse af iod-lipider [33, 34]. I MCF-7 brystcancer-cellelinie I

2 blev taget op af en lettere diffusion system, og kovalent bundet til lipider, som på sin side inhiberede proliferation. Den samme undersøgelse viste, at kun I

2 og 6-iod-5-hydroxy-8,11,14-eicosatriensyre, men ingen KI, havde de antiproliferative egenskaber [44]. Disse observationer er i overensstemmelse med vores resultater, der viser hæmning af Caco-2 spredning, der blev noteret efter behandling med BFL, men ingen KI-NFL (figur 1).

I denne undersøgelse har vi observeret forhøjede niveauer af NOTCH3 og faldt ekspression af c-myc-mRNA i BFL ekstrakter (S2 Table, Hjælpeoplysninger). Pro-differentierende rolle NOTCH familien, herunder NOTCH3 er for nylig blevet beskrevet i forhold til murine fibroblaster og humane neuroner henholdsvis [45, 46]. Omend, regulering af c-myc udtryk synes at spille en vigtig rolle i cellecyklusprogression og cellulær differentiering. Det er blevet vist, at T3-induceret neuronal differentiering og vækststandsning af neuroblastom N2A-B-celler har været et forudgående fald i c-myc-genekspression [47]. I et sådant tilfælde kunne dette forklare inhiberingen af ​​Caco-2 celler proliferation efter BFL ekstrakter observeret i vores undersøgelse; dog yderligere forskning er påkrævet.

I dette arbejde præsenterer vi en liste over BFL vs NFL specifikke gener som reaktion på jod (tabel 2 og figur 2) og mulige forbindelser mellem de gener /proteiner (figur 3) . Deres funktioner, baseret på Panther Classification System database, er knyttet til jod metabolisme og omsætning i organismer. En interessant forøgelse thyroglobulin (TG) mRNA, observeret i vores undersøgelse, kan formodentlig forbundet med aktiveringen af ​​syntesevejen, der kunne føre til dannelsen af ​​jodholdige-proteiner, der ligner TG, produceret i humane og animalske celler i skjoldbruskkirtlen. Alligevel har vi ikke observere en øget ekspression af TPO peroxidase, som er ansvarlig for jod inkorporering i tyrosinrester af proteinet. På den anden side er det blevet vist, at iod kan bindes til aminosyrer for vegetabilske proteiner [29, 30, 31, 32], men der er mangel på oplysninger om deres metabolisme, nedbrydning og biologisk funktion, der kunne efterligne den ioderede tyrosiner frigivet fra TG proteiner som thyreoideahormoner (tHS). Thyroxin (T4) er en af ​​disse pro-hormoner, der omdannes til aktive hormon-triiodthyronin (T3) i perifere celler. Ved tilstedeværelse af T3, thyroideahormonreceptorer (TRS), herunder TRβ1 (

THRB

) og TRa (

thrA

) kan ændre udtryk for mange gener ved at binde til DNA-elementer betegnes Thyroid hormon respons elementer (TRE), og dermed fungerer som transkriptionsfaktorer [28]. Selvom vi observeret reducerede niveauer af den TRβ1 mRNA i respons på jod biofortified salat (tabel 3), viste vores studier forøget ekspression af positivt reguleret DIØ1 og nedsatte niveauer af E2F1 transkript, som er negativt reguleret af TRβ1 proteiner (tabel 3). Desuden har vi observeret ændringer i ekspressionen af ​​andre TR-regulerede gener, f.eks forhøjede mRNA niveauer af β-amyloid precursor protein APPBP) og nedsat ekspression af MYC, CCND1, PPARG (S2 Table, Hjælpeoplysninger). DIØ1 proteinet fungerer som et enzym deiodinating thyroxin (T4) til aktiv thyroideahormon-T3 og dets overekspression kan korreleres med højt indhold af jod omsætning i cellerne. E2F1 er kendt for at være en positiv regulator af celleproliferation [48, 49] og dens udtryk er vist at være understøttet af både MYC og CCND1 [50] Faktisk viste vores forskning, at reduktionen af ​​E2F1 udtryk samt MYC og CCND1, positivt korreleret med reduceret proliferation af Caco-2-celler (Fig 1). Den tilsyneladende modsætning mellem lavere mRNA-niveauer af TRβ1 og niveauet for dets målgener kan forklares ved en øget aktivitet af TRβ1 protein som en T3-afhængig transskription faktor (tabel 3). Denne forklaring kunne understøttes af tidligere rapporteret manglende sammenhæng mellem TRβ1 protein /aktivitet og dens mRNA-niveauer [51]. Således kan vore resultater antyder, at jod-biofortified salat, som var i stand til nedregulere TRβ1 transkription, kunne også levere et molekyle styrke TRβ1 aktivitet; men denne hypotese har behov for yderligere undersøgelser. Selv supplerende tiltag af TRa receptorer kunne være en anden forklaring på observerede resultater, vores microarrays ikke nogen væsentlig ændring af TRa mRNA-niveauer. På den anden side, er en stigning i DIØ1 udtryk efter KI-NFL (tabel 3) ikke udelukke en direkte påvirkning af iodid ion (I

-) i mekanismer, der regulerer den observerede DIØ1 trans-aktivering

Afslutningsvis vores forskning viser, at jod biofortified salat regulerer transkription af gener forbundet med cellecyklus og apoptotisk proces, der fører til reduceret Caco-2 celler spredning. Selv blev fundet udtryk for nogle gener, der skal ændres af både: BFL og NFL jod former, vi identificerede også flere gener differentielt regulerede, hvilket tyder divergerende virkningsmekanismer af jod inkorporeret i makromolekyler salat løbet biofortificaton proces og jod tilføjet som KI salt til ikke befæstet salat. Dette kan også være et argument for tilstedeværelsen i BFL de kovalent bundet jod former, der er blevet indberettet af andre forskere til at udøve specifik hormon-lignende handling. Her viser vi, at jod biofortified salat kan være en attraktiv måde at forebygge jodmangel lidelser. Selv om de ovennævnte resultater kræver en bekræftelse på protein niveauer, der præsenteres mikroarrays er en værdifuld og mangesidet informationskilde, især for fremtidige undersøgelser af potentialet i denne jod form kræftbehandling.

Støtte Information

S1 tabel. Nukleotidsekvenser af primere

thrA

, thyroidhormonreceptor, alpha.;

THRB

, thyroidhormonreceptor, beta;

DIØ1

, deiodinase, iodotyronine, type I;

E2F1

, E2F transskription faktor 1;

ACTB

, actin, beta;

GAPDH

, glyceraldehyd-3-fosfat dehydrogenase;

HPRT1

, hypoxanthin phosphoribosyltransferase 1.

doi: 10,1371 /journal.pone.0147336.s001

(DOCX)

S2 Table. Jod-biofortyficated salat specifikke udskrifter

Statistisk signifikans af behandling: s. 0.05

doi:. 10,1371 /journal.pone.0147336.s002

(DOCX)

S3 Table. GO biologiske processer baseret på BFL vs NFL specifikke gener forskelligt reguleret i Caco-2-cellelinje

Statistisk signifikans af behandling: s. 0.05

doi:. 10,1371 /journal.pone.0147336.s003

(DOCX)

S4 Table. GO molekylære funktioner baseret på BFL vs NFL specifikke gener forskelligt reguleret i Caco-2-cellelinje

Statistisk signifikans af behandling: s. 0.05

doi:. 10,1371 /journal.pone.0147336.s004

(DOCX)

S5 Table. Proteinklasser baseret på BFL vs. NFL specifikke gener forskelligt reguleret i Caco-2-cellelinje

Statistisk signifikans af behandlingen: p. 0.05

doi:. 10,1371 /journal.pone.0147336.s005

(DOCX)

Tak

Dette arbejde blev finansieret af 2012-2015 polske National Science Center-tilskud ingen. Dec-2011/03 /D /NZ9 /05560 “Jeg og Se bioforstærkning af udvalgte grøntsager, herunder indflydelsen af ​​disse mikroelementer på kvalitet udbytte samt evaluering af jod absorption og udvalgte biokemiske parametre i rotter fodret med grøntsager biofortified med jod”.