PLoS ONE: Inflammation og Kræft: Rolle Annexin A1 og FPR2 /ALX i Proliferation og Metastase i Human Laryngeal pladecellecarcinom

abstrakt

Den antiinflammatoriske protein annexin A1 (ANXA1) er blevet forbundet med cancer progression og metastase, hvilket antyder dens rolle i reguleringen af ​​tumorcelleproliferation. Vi undersøgte mekanismen for ANXA1 interaktion med formylerede peptid receptor 2 (FPR2 /ALX) i kontrol, peritumorale og tumor larynx vævsprøver fra 20 patienter, at kvantificere neutrofiler og mastceller, og vurdere proteinekspression og co-lokalisering af ANXA1 /FPR2 i disse inflammatoriske celler og larynx pladeceller af immuncytokemi. Desuden har vi udført in vitro-forsøg for yderligere at undersøge den funktionelle rolle ANXA1 /FPR2 i spredning og metastaser af Hep-2-celler, en cellelinje fra strubehoved epidermoid karcinom, efter behandling med ANXA1

2-26 (annexin A1 N-terminal-peptid), Boc2 (antagonist af FPR) og /eller dexamethason. Under disse behandlinger, blev niveauet af Hep-2-celleproliferation, pro-inflammatoriske cytokiner, ANXA1 /FPR2 co-lokalisering, og prostaglandin signalering analyseret under anvendelse af ELISA, immunocytokemi og real-time PCR. En tilstrømning af neutrofiler og degranulerede mastceller blev påvist i tumorprøver. I disse inflammatoriske celler af peritumorale og tumorprøver blev ANXA1 /FPR2 ekspression markant forværret imidlertid i larynx carcinomceller, denne ekspression blev nedreguleret. ANXA1

2-26 behandling reducerede udbredelsen af ​​de Hep-2-celler, en effekt, der blev blokeret af Boc2, og opreguleret ANXA1 /FPR2 udtryk. ANXA1

2-26 behandling reducerede også niveauerne af pro-inflammatoriske cytokiner og påvirkede udtryk for metalloproteinaser og EP-receptorer, der er involveret i prostaglandin signalering. Samlet set denne undersøgelse identificerede potentielle roller for den molekylære mekanisme i ANXA1 /FPR2 interaktion i larynx cancer, herunder forholdet til prostaglandin vej, giver lovende udgangspunkter for fremtidig forskning. ANXA1 kan bidrage til regulering af tumorvækst og metastase gennem paracrine mekanismer, som er formidlet af FPR2 /ALX. Disse data kan føre til nye biologiske mål for terapeutisk intervention i human larynxcancer

Henvisning:. Gastardelo TS, Cunha BR, Raposo LS, Maniglia JV, Cury PM, Lisoni FCR, et al. (2014) Inflammation og Kræft: Rolle Annexin A1 og FPR2 /ALX i Proliferation og Metastase i Human Laryngeal pladecellecarcinom. PLoS ONE 9 (12): e111317. doi: 10,1371 /journal.pone.0111317

Redaktør: Hiroshi Miyazaki, Virginia Commonwealth University, USA

Modtaget: December 6, 2013; Accepteret: September 30, 2014; Udgivet: 9. december 2014

Copyright: © 2014 Gastardelo et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo – FAPESP (tilskud 2008 /08187-4 til SMO og 2008 /01.655-2 til GTS) og Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico – CNPq (tilskud 302.768 /2010- 6 til SMO). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Laryngeal kræft er en af ​​de mest almindelige typer af hoved og hals tumorer, der har en høj dødelighed og en dårlig [1] prognose. Mere end 12.500 nye tilfælde af larynx cancer diagnosticeres årligt og 3.560 årlige dødsfald [2]. Udviklingen af ​​bedre behandling samt bedre diagnostiske og forebyggende tilgange kræver en bedre forståelse af den komplekse proces larynx tumorigenese.

Kun 5% til 10% af alle kræfttilfælde skyldes arv af muterede gener, hvorimod de resterende 90% til 95% af tilfældene har været knyttet til genetiske og epigenetiske ændringer forårsaget af livsstil og miljømæssige faktorer, såsom rygning og alkohol brug [3], [4]. Det er nu velkendt, at inflammation er en risikofaktor for de fleste typer cancer, herunder larynx carcinomer [5], [6]. Kronisk inflammation er blevet forbundet med forskellige trin i tumorigenese, herunder cellulær transformation, promotion, proliferation, invasion, angiogenese og metastase [7], [8]. Hanahan og Weinberg, i deres seneste revision [9], anerkendt betændelse som en ny kendetegnende for kræft, der fremmer flere tumor funktioner.

Inflammatoriske celler udskiller mange cytokiner, kemokiner og vækstfaktorer, der kan stimulere proliferation, hæmme apoptose, inducerer morfogenese og generere DNA-skadelige reaktive oxygenarter [7], hvilket letter genomisk ustabilitet [10]. Desuden er disse celler syntetiserer vaskulær endotel vækstfaktor (VEGF), angiopoetin, metalloproteinaser og andre proteiner, som kan stimulere vaskulær endotelcelle mitose og ekstracellulær matrix remodellering [11]. Derfor betændelse genererer ikke kun ændringer i mikromiljø for at fremme kræft, men også ændringer, der stimulerer neoplastisk progression.

Det er blevet påvist, at mastceller og neutrofiler kan rekrutteres ved tumorceller. Øget antal mastceller er blevet rapporteret i brystkirtler [12] og lungecarcinomer [13], blandt andre tumorer. Eksperimentel dokumentation har vist, at aktiverede mastceller frigiver angiogene vækstfaktorer og regulatorer, prostaglandin, metalloproteinaser og cytokiner [14], og kan spille en dobbelt rolle i at fremme eller hæmme tumorvækst afhængig af de lokale stromale forhold [15], [16]. Af de celletyper, der er bosiddende i tumor mikromiljø, har tumorassocierede neutrofiler (Tans) fået lidt opmærksomhed [17]. Selv om der er tegn antyder en rolle for neutrofiler i forbedret sygdomsprogression i specifikke humane tumorer, forholdet mellem neutrofil infiltration og prognose i human cancer er ikke systematisk undersøgt [18]. Rollen af ​​neutrofiler i tumorudvikling forbliver kontroversiel [19] hovedsagelig fordi disse celler har både tumorfremmende og tumordræbende funktioner afhængig af tilstedeværelsen af ​​transformerende vækstfaktor beta (TGF-β) [20], [21].

Ud fra disse undersøgelser er det klart, at forskellige inflammatoriske mediatorer differentielt udtrykt i flere kræftformer og kan stimulere sygdomsprogression [22]. Midler, der undertrykker disse inflammatoriske mediatorer repræsenterer potentielle mål for behandling af cancer. Den antiinflammatoriske protein annexin 1 (ANXA1), en 37-kDa medlem af annexin superfamilien, er et steroid-reguleret protein, er impliceret i mediering nogle af de gavnlige aktiviteter af glucocorticoider [23], herunder reguleringen af ​​celleproliferation [ ,,,0],24], differentiering [25] og metastase [26].

dysregulering af ANXA1 er blevet rapporteret i flere neoplasmer, hvilket antyder, at dette protein kan spille vigtige roller i tumorudvikling og progression [27]. ANXA1 er overudtrykt i brystkræft [28] og hepatocellulært carcinom [29], men er markant nedreguleret i esophageal [30], [31] og hoved og hals karcinomer [32]. Men de molekylære mekanismer, som ANXA1 modulerer cellulært respons er ikke fuldt fastlagt.

Fremskridt på dette område har vist en funktionel forbindelse mellem de anti-inflammatoriske egenskaber af ANXA1 og receptor for formyl-Met-Leu-Phe (fMLP) FPR [33], en bestemt klasse af G-protein-koblede 7-transmembrane receptorer [34]. Hos mennesker har tre familiemedlemmer blevet identificeret, FPR1, FPR2 /ALX (FPRL1) og FPR3 (FPRL2) [35]. Nogle af effekterne af eksogene ANXA1 kan dæmpes ved Boc2, en antagonist af både FPR1 og FPR2 [33]. For nylig er det blevet vist, at ANXA1 N-terminale peptid, ANXA1

2-26, fremmer migreringen af ​​WS1 humane hudfibroblaster [36], og invasivitet af SKCO-15 colorektale adenocarcinomceller [24] gennem interaktion med FPRs. Men er ingen tilgængelige data vedrørende rolle ANXA1 og FPRs i larynx pladecellekræft.

Flere signalveje mægle inflammation-associerede tumorigenese. For eksempel er cyclooxygenase-2 (COX-2), et enzym involveret i omdannelsen af ​​arachidonsyre til prostaglandiner, anses for at spille en vigtig rolle i udviklingen af ​​kræft ved at modulere celleproliferation og andre vigtige biologiske processer via deres metabolitter, G-protein-koblede receptorer og nedstrøms effektorer [37]. COX-2 opreguleres i flere maligniteter [38] – [40], herunder hoved og hals-carcinomer [41]. Faktisk Abrahao et al. (2010) har vist, at pro-inflammatoriske COX-2 metabolit prostaglandin E2 og dens EP3 receptor kan aktivere hoved og hals-carcinomceller at proliferere og er et potentielt mål for forebyggende tiltag. I betragtning af at glucocorticoider er yderst effektive inhibitorer af COX-2-ekspression [42], steroid-regulerede protein annexin A1, som er impliceret i mediering nogle af aktiviteterne af glucocorticoider, kan også være involveret i den inflammatoriske netværk forbundet med COX-2.

i betragtning af den potentielle rolle for ANXA1 i flere neoplasmer såsom regulering af celledeling, differentiering og metastase, vi fokuseret på de molekylære mekanismer, som ANXA1 modulerer disse cellulære responser. I denne rapport, viste vi, at ANXA1 protein nedreguleres i human larynx karcinom og kan regulere tumorvækst i en parakrin måde, der er medieret af receptoren FPR2 /ALX. Denne undersøgelse viser potentialet betydning af denne ANXA1 /FPR2 interaktion i tumorigenese. Samlet set denne undersøgelse identificerede potentielle roller for den molekylære mekanisme af dette protein interaktion i larynx cancer, herunder forholdet til prostaglandin pathway, der beviser for potentialet i ANXA1 som terapeutisk target og lovende udgangspunkter for fremtidig forskning.

Materialer og metoder

vævsprøver

Humane invasive larynx cancer væv blev opnået fra 20 patienter med larynx planocellulært karcinom, der blev behandlet på Hospital de Base i São José do Rio Preto, Brasilien . Patienterne var mænd, alkoholiske rygere, deres alder varierede fra 50 til 80 år, og ingen af ​​dem havde fået strålebehandling eller kemoterapi før intervention. I hver patient (n = 20) blev de kirurgiske tumorprøver indsamlet fra centrum af larynx tumor blev peritumorale prøver indsamlet fra tumoren periferi, og kontrolprøverne blev indsamlet fra region fri af tumorceller. På grund af den høje heterogenitet larynx karcinom blev tumorvæv dissekeret og gennemgået af en ledende patolog og blev karakteriseret som moderat differentierede, invasive karcinomer. Disse vævsprøver blev anvendt i en tidligere undersøgelse, der blev udført i vores laboratorium, og antallet af patienter var tilstrækkelig til at opnå statistisk signifikante data [32]. Undersøgelsen protokol Den blev godkendt af udvalget for etik i forskning af Federal University of São Paulo, School of Medicine, Brasilien (CEP-0300/08), og skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle de involverede patienter.

Cell Culture

Hep-2-cellelinien, som oprindeligt blev etableret fra en epidermoid carcinom i larynx, blev anvendt i den foreliggende undersøgelse (ATCC, Rockville, Maryland, USA). Cell line godkendelse blev udført ved hjælp af AmpFLSTR Identifiler PCR Amplification Kit (Life Technologies) på særlige teknikker Laboratory, Sygehus Israelita Albert Einstein (LATE -HIAE), Sao Paulo. Vi fandt 100% identitet vores cellelinje sammenlignet med databasen American Type Culture Collection (ATCC). Cellerne blev podet ved en densitet på 2 x 10

6 celler i en 75 cm

2 dyrkningskolbe (Corning, NY, USA) og inkuberet i MEM-Earles medium (Cultilab, Campinas, SP, Brasilien) , pH 7,5, suppleret med 20% føtalt kalveserum (Cultilab), 1% ikke-essentielle aminosyrer, og 0,1% antibiotikum /antimykotisk opløsning (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USA), ved 37 ° C i en fugtig atmosfære af 5% CO

2 [43].

Drug Treatment

For de farmakologiske eksperimenter blev Hep-2-celler seedet som tidligere beskrevet. Fireogtyve timer senere, efter at cellerne havde allerede klæbet, blev de inkuberet i serumfrit medium for at synkronisere cellecyklussen. Efter yderligere 24 timer blev mediet erstattet med komplet vækstmedium indeholdende følgende: (a) 1 uM ANXA1

2-26 peptid (Ac-AMVSEFLKQAWFIENEEQEYVQTVK) (Invitrogen); (B) 1 uM ANXA1

2-26 peptid og 10 uM Boc2, et ikke-selektivt FPR antagonist (N-t-BOC-MET-Leu-Phe) (MP Biomedicals, Aurora, OH); (C) 0,01 uM dexamethason (et glucocorticoid; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA); (D) 0,01 uM dexamethason og 10 pM Boc2; eller (e) 10 uM Boc2 alene. Lægemidlerne blev først opløst i små mængder dimethylsulfoxid (DMSO) og derefter fortyndet i medium (slutkoncentrationen af ​​DMSO oversteg aldrig 1%). Koncentrationerne af lægemidler blev valgt på basis af indledende forsøg og litteraturdata [32], [44]. Kontrolsekvenserne celler blev behandlet med komplet medium med den samme koncentration af DMSO anvendes til at fortynde lægemidlerne. Hver 2 dage, blev mediet erstattet med frisk medium indeholdende lægemidlerne med samme dosis; cellemorfologien blev observeret hver dag [43]. Efter 6, 24, 48, 72 og 96 timer, kontrol og behandlede celler blev høstet og talt ved anvendelse af Grevinde Automated Cell Counter (Invitrogen).

Fiksering, Processing, og Integrering for lys- og elektronmikroskopi

Larynx prøver og Hep-2-celler blev fikseret i 4% paraformaldehyd, 0,5% glutaraldehyd og 0,1 mol /l natriumcacodylat-buffer (pH 7,4) i 24 timer ved 4 ° C, vasket i natriumcacodylat, dehydrerede gennem graduerede procenter ethanol, og indlejret i LRGold (London Resin Co, Reading, UK). For histopatologiske og morfologiske analyser blev vævssnit (0,5-um tyk) skåret på en ultramikrotom (Reichert Ultracut, Leica, Østrig), farvet med 1% toluidinblåt i 1% borax løsning (TAAB Laboratories, Aldermaston, UK) og undersøgt ved hjælp af en Axioskop 2-Mot Plus ZEISS mikroskop (Carl Zeiss, Jena, Tyskland). For elektronmikroskopi, sektioner (-90 nm) blev skåret på en ultramikrotom og placeret på nikkel tavler til immunguld mærkning [45].

immunoguld Mærkning af Post-indlejrede væv

Immuncytokemi reaktion (dobbelt mærkning) blev anvendt til at detektere ekspression og co-lokalisering af ANXA1 og FPR2 /ALX i mastceller, neutrofiler, og kontrol- og tumorceller fra larynx væv og Hep-2-celler.

Hep-2-celler var inkuberes med kontrol medium, ANXA1

2-26 og ANXA1

2-26 + Boc2. Efter 48 timer blev kulturen høstet, og cellerne blev indlejret i LRGold harpiks til immuncytokemisk analyse. Ultratynde snit af larynx væv og Hep-2-celler blev inkuberet i en trin-for-trin måde under anvendelse af følgende reagenser og /eller betingelser ved stuetemperatur: 1) destilleret vand; 2) 0,1 mol /l phosphatbuffer indeholdende 1% æggealbumin (PBEA); 3) 0,1 mol /l PBS indeholdende 5% PBEA i 30 minutter; 4) får polyklonale antistof LCPS1, rejst mod det N-terminale segment af ANXA1 (1:500 i PBEA) og kanin polyklonale antistof FPR2 /ALX (Abcam, Cambridge, UK) (1:500 i PBEA) i 2 timer; normal får og kaninsera blev anvendt som kontrol (1:500); 5) tre vaske i PBEA indeholdende 0,01% Tween 20; 6), æsel-anti-får IgG (Fc-fragment-specifikke) antistof (1:100 i PBEA) konjugeret til 15 nm kolloidt guld (British Biocell, UK) blev tilsat til påvisning ANXA1, og gede-anti-kanin IgG (Fc-fragment -specifikt) antistof (1:100 i PBEA) konjugeret til 10 nm kolloidt guld (British Biocell) tilsat til påvisning FPR2 /ALX). Efter 1 time blev snittene vasket i PBEA indeholdende 0,01% Tween 20, og derefter i destilleret vand [46]. Sektioner blev farvet med uranylacetat og bly citrat før undersøgelse på en ZEISS LEO 906 elektronmikroskop (Carl Zeiss, Jena, Tyskland).

Multiplex assays

For at kvantificere de pro-inflammatoriske cytokiner interleukiner 6 (IL-6) og IL-8 samt monocytkemotaktisk protein-1 (MCP-1), i Hep-2 cellekultursupernatanter anvendte vi multiplex instrument LUMINEX xMAP MAGPIX (Millipore Corporation, Billerica, MA, USA) . Cellerne blev inkuberet med kontrol medium, ANXA1

2-26, ANXA1

2-26 + Boc2, Dexa, Dexa + Boc2 eller Boc2. Efter 48 timers behandling blev kultursupernatanterne fjernet, centrifugeret og opbevaret ved -20 ° C. Antistof perler, kontroller vaskebuffer, serum matrix og standarder blev fremstillet ved at følge producentens anvisninger (MILLIPLEX HCYTOMAG-60K kit). Dernæst blev 200 pi vaskebuffer tilsat til hver brønd af en magnetisk plade med 96 brønde og blandet på et rysteapparat i 10 minutter. Vaskebufferen blev dekanteret, og 25 pi standarder, kontroller og prøver blev tilsat til brøndene. Dernæst blev 25 pi assaybuffer tilsat til prøverne, og 25 pi serum matrix blev sat til standarderne. Endelig blev 25 pi magnetiske perler (overtrukket med en specifik capture-antistof) tilsat til alle brønde og inkuberet natten over ved 4 ° C på en ryster. Den næste dag blev pladen vasket med vaskebuffer og inkuberet med 25 pi detektionsantistoffer i 1 time på et rysteapparat. Dernæst blev 25 pi streptavidin-phycoerythrin tilsat til hver brønd og inkuberet i 30 minutter på et rysteapparat. Pladen blev vasket og inkuberet med 150 pi drivfluid i 5 minutter på et rysteapparat. Endelig blev pladen analyseret ved hjælp MAGPIX med xPONENT software [47].

Real-time PCR

Hep-2-celler blev inkuberet med kontrol medium, ANXA1

2-26 eller ANXA1

2-26 + Boc2 og høstet efter 48 timer. Totalt RNA blev ekstraheret under anvendelse af TRIzol Reagens (Invitrogen) ifølge producentens protokol. Det genomiske DNA blev fjernet ved DNase-behandling ifølge producentens beskrivelse (Promega). Aliquoter (2 mg) af totalt RNA fra kontrol og behandlede celler blev anvendt til dobbeltstrenget cDNA syntese under anvendelse af en høj kapacitet cDNA Archive Kit (Applied Biosystems) ifølge producentens instruktioner. Fire differentielt udtrykte gener (

EP3

eller

PTGER3

,

EP4

eller

PTGER4

,

MMP2

MMP9

) blev udvalgt til kvantitativ real-time PCR-forsøg i henhold til deres direkte eller indirekte involvering i inflammatoriske og metastatiske processer baseret på Gene ontologi database (https://www.geneonthology.org/). Real-time PCR blev udført tre gange ved anvendelse af en 7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems). Reaktionsblandingen bestod af en 20-pi totalvolumen opløsning indeholdende 10 pi Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems), en 1 pM opløsning af hver primer og 20 ng cDNA. PCR-betingelserne var 50 ° C i 2 minutter og 95 ° C i 10 minutter, efterfulgt af 40 cykler ved 95 ° C i 15 s og 60 ° C i 1 min. Smeltekurveanalyse blev udført for hvert gen til at kontrollere specificiteten og identiteten af ​​de RT-PCR-produkter. For hvert primersæt blev de real-time PCR effektivitet (E) målt i tre eksemplarer på serielle fortyndinger af den samme cDNA prøve under anvendelse af formlen E = [10 (-1 /hældning)]. De resulterende værdier varierede fra 1,96 til 2,02. Hver afskrift niveau blev normaliseret til den interne standard

GAPDH

, og værdierne var log2-transformerede (y-aksen), således at alle værdier under -1 angivet nedregulering i genekspression, mens værdier over 1 repræsenteret opregulering sammenlignet med kontrol- celler [43].

Statistisk analyse

de værdier vedrørende kvantificering af mastceller og neutrofiler i in vivo vævsprøver blev udtrykt som middelværdien ± SEM af antallet af celler pr mm

2 i tre sektioner af 0,5 um (med et mellemrum på 40 pm mellem hver sektion) for hver patient (n = 20 patienter).

Hep-2-celler blev talt under anvendelse af grevinde Automated Cell Counter (Invitrogen). Koncentrationen af ​​cytokinerne blev bestemt under anvendelse MAGPIX Xponent software (Millipore Corporation). In vitro analyser blev gentaget mindst tre gange.

ultrastrukturelle og immuncytokemi ekspression af ANXA1 og FPR2 blev bestemt ved anvendelse ti celler for hver undersøgt gruppe. Arealet af hver celle rum blev bestemt ved anvendelse Axiovision imaging software (Zeiss). I kernen og cytoplasmaet, blev massefylden af ​​kolloide guldpartikler beregnet som middelværdien ± SEM af antallet af partikler pr um

2. I plasmamembranen, var tætheden af ​​kolloide guldpartikler beregnet som middelværdien ± SEM af antallet af partikler pr um.

De væsentlige forskelle mellem de midler blev bestemt ved anvendelse af variansanalyse. Denne test blev efterfulgt af Bonferroni post-hoc test på udvalgte forsøgsgrupper hjælp Graph-Pad Prism 4.0 (Graph-Pad, San Diego, CA, USA). En sandsynlighed værdi mindre end 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant.

Resultater

Tilstedeværelsen af ​​degranulerede mastceller og en tilstrømning af neutrofiler Angiver Betændelse i Tumor mikromiljø

Til verificere interaktionen af ​​inflammatoriske celler med larynx tumorceller, udførte vi histologisk analyse i strubehovedet vævsprøver at kvantificere mastceller og neutrofiler, vigtige celler i inflammatoriske respons. I kontrolprøver, vi observerede intakte mastceller med metakromatisk granulat i umiddelbar nærhed af blodkar (Fig. 1A). I peritumoral og tumor stroma, verificerede vi tilstedeværelsen af ​​degranulerede mastceller (fig. 1, B og C). Derudover observerede vi neutrofiler, der var transmigrated i tumor sektioner (fig. 1D).

(A-D) repræsentativt udvalg (oprindelig forstørrelse, × 63) af toluidinblåt-farvede vævssnit fra larynx prøver. (A) Kontrollen larynx prøve viser intakte mastceller (kurve pile) nær blodkarrene. Peritumoral (B) og tumor (C) prøver med degranulerede mastceller (åben kurve pile). (D) Tumorceller med mitotisk aktivitet (åben pil) og inflammatoriske celler, som ekstravaskulære neutrofiler (pile). (E) Samlet antal mastceller. (F) Intakte og degranulerede mastceller. (G) Samlet antal neutrofiler. (H) Ekstra og intravaskulære neutrofiler. Data udtrykkes som middelværdien ± SEM af celletallet pr mm

2 (n = 20 patienter per gruppe). Envejs ANOVA efterfulgt af Bonferroni test afslørede en signifikant forskel mellem grupperne. ***

P

0,001

vs

kontrol, ###

P

. . 0.001

vs

peritumoral. Scale barer:. 5 um

Statistisk analyse viste, at der var et stort antal mastceller i kontrolsystemerne dele af larynx og markant færre mastceller i peritumorale og tumor regioner (

P

0,001;. figur 1E). Desuden intakte mastceller var mere rigelige i kontrolprøver og signifikant lavere i peritumorale og tumor sektioner (

P

0,001;. Figur 1F). Brug kvantitativ analyse af neutrofiler, vi bekræftet, at der var en betydelig stigning i disse celler i tumorvæv (

P

0,001) i forhold til kontrol og peritumorale væv (Fig 1G.). En gennemgang af de neutrofiler i kontrol og peritumorale sektioner viste, at de fleste af disse celler blev lokaliseret i blodkarrene (fig. 1H). Derimod i tumorprøver, observerede vi et betydeligt antal transmigrated neutrofiler i stroma (

P

0,001 sammenlignet med kontrol og peritumorale prøver). (. Figur 1H)

Up -forordning af ANXA1 /FPR2 i den inflammatoriske celler af human larynx Tumorer

Ultrastrukturel immuncytokemi viste for første gang ekspressionen af ​​FPR2 /ALX og dets co-lokalisering med ANXA1 i mastceller (fig. 2, A- C). Mastceller og neutrofiler viste ANXA1 og FPR2 /ALX immunreaktivitet i plasmamembranen, cytoplasmaet og kernen (fig. 2, A-F). Ingen mærkning immunguld blev detekteret i sektioner, der blev inkuberet med ikke-immunt serum (data ikke vist). I disse inflammatoriske celler, vi bekræftet en signifikant opregulering af ANXA1 og FPR2 /ALX ekspression i de peritumorale og tumorprøver sammenlignet med de tilsvarende kontrol væv (fig. 2, G-L).

immunmærkning med 10 -Nm (FPR2 /ALX) og 15-nm (ANXA1) kolloide guldpartikler. Mastceller (A-C) og neutrofiler (D-F) viser subcellulær lokalisering af ANXA1 (pile) og FPR2 /ALX (pilespidser), og co-lokalisering (Kurve pile) i plasmamembranen, cytoplasmaet og kernen (N) af kontrol, peritumorale og tumorvæv. Densitet guldpartikler konjugeret med ANXA1 og FPR2 /ALX i mastceller (G-I) og neutrofiler (J-L). Data udtrykkes som middelværdien ± SEM af kolloide guldpartikler pr um i plasmamembranen og pr um

2 i cytoplasmaet og kernen af ​​celler (n = 10 celler pr gruppe). Envejs ANOVA efterfulgt af Bonferroni test afslørede en signifikant forskel mellem grupperne. *

P

0,05, **

P

0,01, ***

P

. 0,001

vs

kontrol, ##

P

0,01, ###

P

. 0,001

vs

peritumoral. Farvet med uranylacetat og blycitrat. Scale bars: 1 um

Kvantitativ analyse afslørede, at der er højere ekspression af ANXA1 og dets receptor i cytoplasmaet og kernen sammenlignes med den i plasmamembranen (fig 2, G-L.).. Co-lokalisering af ANXA1 og FPR2 /ALX blev observeret i plasmamembranen, cytoplasmaet og kernen af ​​mastceller og neutrofiler (figur 2, G-L.); men der var signifikant forskel kun i plasma membran af peritumorale neutrofiler (fig. 2J).

ANXA1

2-26 Forhindrer FPR2 /ALX Receptor-medieret spredning af Hep-2 larynxcancer Cells

Ca. 87% til 97% af Hep-2-celler var levedygtige under de eksperimentelle betingelser (kontrol, ANXA1

2-26, ANXA1

2-26 + Boc2, Dexa, Dexa + Boc2 og Boc2) ( S1 figur). vækstkurven af ​​disse celler viste imidlertid, signifikante forskelle mellem de betingelser undersøgt (fig. 3).

Behandling med ANXA1 reduceret

2-26 den cellulære vækst. Antagonisten Boc2 inhiberede delvist den anti-proliferative effekt af ANXA1

2-26. Cellerne behandlet med Boc2 alene viste en grad af spredning svarende til den i kontrollen. De Hep-2-celler blev podet i MEM-Earles medium ved en densitet på 2 x 10

6 celler i 75-cm

2 dyrkningskolbe og derefter inkuberet med serum-frit medium 24 timer inden tilsætningen af ANXA1

2-26 (1 uM), ANXA1

2-26 (1 uM) + Boc (10 uM) eller Boc (10 uM) alene. Alle eksperimenter blev udført tredobbelt for at bekræfte resultaterne. Data udtrykkes som middelværdien ± SEM af celletallet × 10

6. **

P

0,01 og ***

P

0,001

vs

kontrol, ##

P

. 0,01 og # ##

P

0,001

vs

ANXA1

2-26 + Boc

Behandling med peptid ANXA1

2-26.. væsentligt reduceret udbredelsen af ​​Hep-2 larynx kræftceller sammenlignet med kontrollen celler (

P

0,001 ved 48 og 96 timer, og

P

0,01 ved 72 timer). Lignende resultater blev opnået efter behandling med Dexa og Dexa + Boc2 (S2 figur). Men kombinationsbehandling med ANXA1

2-26 og Boc2 (ANXA1

2-26 + Boc) signifikant forøget cellevækst sammenlignet med ANXA1

2-26-behandlede celler (

P

0,01 ved 48 og 72 timer, og

P

0,001 ved 96 timer), hvilket viser, at Boc2 svækkede antiproliferative aktivitet af ANXA1

2-26. Boc2-behandlede celler havde en proliferativ sats, der var ligner kontrol celler (Fig. 3).

Tab af ANXA1 /FPR2 Protein i Larynx tumorvæv og Up-regulering efter

In vitro

Behandling med ANXA1

2-26 Peptide

de epitelceller af kontrol, peritumorale og tumor larynx væv viste immunoreaktivitet til ANXA1 og FPR2 /ALX, samt co-lokaliseringer af proteiner, i plasmamembranen, cytoplasmaet og kernen (fig. 4, A-C). I de peritumorale og tumorprøver, observerede vi en markant reduktion af ANXA1 og FPR2 /ALX proteinekspression sammenlignet med den tilsvarende kontrol væv (fig. 4, H og I). Kvantitativ analyse afslørede, at der var højere ekspression af ANXA1 og dets receptor i cytoplasmaet og kernen og lavere ekspression i plasmamembranen (fig. 4, G-I). Forskelle i graden af ​​ANXA1 /FPR2 co-lokalisering nåede ikke statistisk signifikans blandt larynx prøver (fig. 4, G-I).

immunolabeling med 10-nm (FPR2 /ALX) og 15-nm (ANXA1) kolloide guldpartikler. (A-C) epithelial kontrol, peritumorale og tumorceller fra larynx væv. (D-E) Hep-2-celler viser immunoreaktivitet til ANXA1 (pile), FPR2 (pilehoveder), og co-lokaliseringer (kurve pile) i plasmamembranen, cytoplasmaet og kernen (N). opdages desmosomer (åben kurve pile) mellem disse celler. (F) Den manglende immunoreaktivitet til ANXA1 og FPR2 /ALX i celler inkuberet med ikke-immunt serum. Densitet guldpartikler konjugeret med ANXA1 og FPR2 /ALX i epitelceller (G-I) og Hep-2-celler (J-L). Hep-2-celler blev podet i MEM-Earles medium ved en densitet på 2 x 10

6 celler i 75-cm

2 dyrkningskolber, og derefter blev inkuberet med serum-frit medium 24 timer før tilsætningen af ANXA1

2-26 (1 uM) og ANXA1

2-26 (1 uM) + Boc2 (10 uM). Data udtrykkes som middelværdien ± SEM af kolloide guldpartikler pr um i plasmamembranen og pr um

2 i cytoplasmaet og kernen af ​​celler (n = 10 celler pr gruppe). Envejs ANOVA efterfulgt af Bonferroni test afslørede en signifikant forskel mellem grupperne. *

P

0,05, **

P

0,01, ***

P

. 0,001

vs

kontrol, #

P

0,05, ##

P

0,01, ###

P

0,001

vs

ANXA1

2. 26. Farvet med uranylacetat og blycitrat. Scale barer:. 1 um

Hep-2-celler, der blev behandlet med ANXA1

2-26 eller ANXA1

2-26 plus Boc2 viste immunoreaktivitet for ANXA1 og FPR2 /ALX (Fig . 4, D og E). Co-lokalisering af de to proteiner blev detekteret i plasmamembranen, cytoplasmaet og kernen af ​​disse celler, men ikke i Boc2-behandlede celler (fig. 4, D og E). Nr guld mærkning blev detekteret i celler, der var inkuberet med ikke-immunt serum (fig. 4 F). ANXA1 /FPR2 ekspression blev nedreguleret i plasmamembranen, men blev forøget i cytoplasmaet og kernen af ​​Hep-2-celler (fig. 4, J-L). Behandling med ANXA1

2-26 vises opregulering af ANXA1 og FPR2 i cytoplasmaet og kernen i sammenligning med de tilsvarende kontrolceller (fig. 4, J-L). Derudover har vi registreret markant reduktion af ANXA1 protein og dets receptor efter ANXA1

2-26 + Boc2 behandling sammenlignet med ANXA1

2-26-behandlede celler (fig. 4, J-L).