PLoS ONE: Identifikation af Novel Pro-vandrende, Cancer-associerede gener ved brug af kvantitativ, mikroskopi-Based Screening

Abstrakt

Baggrund

Cell migration er en meget kompleks proces, reguleret af flere gener , signalveje og eksterne stimuli. At opdage gener eller farmakologiske midler, der kan modulere den vandrende aktivitet af celler, screening strategier, der muliggør overvågning af diverse migrerende parametre i et stort antal prøver er nødvendige.

Metode

I den foreliggende undersøgelse, beskriver vi udviklingen af ​​en kvantitativ, high-throughput cellemigrationsassay, baseret på en modificeret phagokinetic spor (PKT) procedure, og anvende det til at identificere hidtil ukendte pro-migrerende gener i en cancerrelateret gen bibliotek. Kort fortalt podes celler på fibronectincoatede plader med 96 brønde, dækket med et monolag af carboxylerede latexperler. Bevægelige celler rydde perler, der ligger langs deres vandrende stier, danner spor, der er visualiseret ved anvendelse af en automatiseret, transmitteret lys screening mikroskop. Sporene derefter segmenteret og præget af multi-parametrisk, morfometriske analyse, løse en række morfologiske og kinetiske egenskaber.

Konklusioner

I dette skærmbillede vi identificeret 4 nye gener stammer fra mammacancer relaterede cDNA bibliotek, hvis overekspression inducerer væsentlig ændring i migrationen af ​​de stationære MCF7-celler. Denne tilgang kan tjene til high throughput screening for nye måder at modulere cellulære migration i patologiske tilstande såsom tumor metastase og invasion

Henvisning:. Naffar-Abu-Amara S, Shay T, Galun M, Cohen N, Isakoff SJ, Kam Z, et al. (2008) Identifikation af Nye Pro-vandrende, Cancer-associerede gener ved brug af kvantitativ, mikroskopi-Based Screening. PLoS ONE 3 (1): e1457. doi: 10,1371 /journal.pone.0001457

Academic Redaktør: Neil Hotchin, University of Birmingham, England

Modtaget 21. oktober, 2007; Accepteret: 18. december 2007; Udgivet: 23 januar 2008

Copyright: © 2008 Naffar-Abu-Amara et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra Israel Science Foundation og en NIGMS tilskud til Cell Migration Consortium (NIH Grant U54GM64346), og ved den Kahn fond for systembiologi på Weizmann Institute

Konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret der findes ingen konkurrerende interesser.

Introduktion

Cell migration spiller en kritisk rolle i talrige fysiologiske processer, herunder fosterudvikling, inflammatoriske responser, sårheling og angiogenese, samt ved patologiske tilstande sådanne som tumorinvasion og metastase [1], [2]. At udforske mekanismerne bag reguleringen af ​​celle migration, har en bred vifte af kvalitative og kvantitative metoder blevet udviklet. Disse omfatter 2- og 3-dimensionelle time-lapse film, tracking migrering af dyrkede eller væv-embedded celler [3], [4], sår-lukning assays [5] – [7], matrix-gennemtrængning analyser [8] [9], og “optagelse” af cellernes migration “historie”, baseret på analyser som PKT dannelse [10]. Sidstnævnte assay er meget brugt til at studere de migrerende aktiviteter af forskellige celletyper [3], [11], matrix remodeling [12], [13] og forstyrrelse af cellemigrering ved kemiske eller genetiske modulatorer [14] – [19]. Sådanne undersøgelser er af særlig relevans for kræft cellemotilitet, som menes at afspejle den invasive eller metastatiske potentiale af disse celler in vivo [14], [20] – [23]. Således identifikation af kemikalier, der ændrer cellemigrering eller specifikke gener, hvis forstyrrelse påvirker cellemigrering kunne potentielt anvendes til modulering af metastatisk cellemigrering.

Vores mål i den foreliggende undersøgelse var at udvikle en PKT tilgang til sporing celle migration, som er reproducerbar, kompatibel med high-throughput mikroskopi, og giver kvantitative oplysninger, morfologiske og dynamisk, på vandrende proces. Vi viser her, at mens PKT registrerer den integrerede historie vandrende aktivitet ved en enkelt tidspunkt, den kvantitative imaging software, muliggør beregning af både “statiske” parametre såsom banelængde og areal, og “dynamiske” parametre såsom migrationsrater , vedholdenhed, og lamellar aktivitet.

high-throughput migration assay beskrevet heri, og den billeddannende software udviklet til at måle forskellige funktioner i vandrende proces, giver en hurtig, pålidelig og kvantitativ tilgang til vurdering af celle migration i forskellige celletyper, dyrket under varierende forhold og udsættes for en række kemiske eller genetiske forstyrrelser.

Resultater

Udvikling af en perle-baserede high-throughput PKT assay

kritisk til udviklingen af ​​denne PKT assay var udvælgelsen af ​​egnede perler, med optimale dimensioner og kemiske egenskaber (tabel S1). Perlerne, der blev fundet mest egnet til PKT assays anvendes til en bred række celletyper var carboxylat-modificeret latex (CML) hvide polystyrenkugler, med en gennemsnitlig diameter på 340 nm, og en negativ ladning indhold på 184,7 μEq /g. Disse perler danner en homogen og synlig monolag; deres tilknytning til underlaget er fast nok til at forhindre spontan løsrivelse, men stadig modtagelige for fjernelse ved migrerende celler

Overfladen kemi af perlerne viste sig at have en stærk effekt på PKT analysen:. perler med et aldehyd -modificeret overflade fæstnet fast til substratet, og ikke kunne fjernes ved at migrere celler. Perler med et sulfateret overflade havde en tendens til at aggregere, hvilket gav en uensartet monolag. Carboxylerede kugler, med eller uden yderligere sulfatgrupper, havde tendens til at danne temmelig homogene suspensioner efter centrifugering. Overfladen densitet af carboxylatgrupper også berørt spor dannelse: en lav ladningstæthed (23,9 μEq /g) forårsaget vulsten at interagere stærkt med overfladen, således at mange celletyper ikke effektivt at fjerne perlerne, som de overføres. Perler med carboxylatgrupper af mellemprodukt densitet (91,4 μEq /g) blev fundet optimale for nogle adhærente celler (fx H1299, REF52), men ikke for celler med svagere adhæsioner (fx MCF7; B16-F10). Perler indeholdende carboxylgrupper med en densitet på 160-185 μEq /g, blev fundet at være optimal for assays anvendes på en lang række celletyper.

Desuden er diameteren af ​​perlerne havde en stor indvirkning på synlighed af sporene og på stabiliteten af ​​monolag. Således små perler ( 300 nm i diameter) kunne næppe visualiseres, mens store perler (~1,000 nm i diameter) havde en tendens til at løsne sig fra overfladen og derefter spontant vedhæfte, hvilket resulterer i dårligt definerede spor. Den optimale perlediameter til automatiserede PKT assays viste sig at være ca. 400 nm.

Udvikling af det automatiserede mikroskopi systemet

PKT assays blev registreret ved anvendelse af en celle-screening mikroskop [24] forsynet med en laser autofokus enhed [25]. Mikroskopet driftsprogram og købet billedet software blev skrevet som en ansøgning i UCSF PRIISM miljø (https://msg.ucsf.edu/ive). Til denne ansøgning, blev billederne taget med en 10 × /0,4 objektiv, under transmitteret lys belysning. En lysspreder blev indsat over multi-brønds plade, for at minimere ikke-homogen belysning og undgå skygger almindeligt forårsaget af de smalle brøndvægge

Den dedikerede erhvervelse program styrer belysningen.; autofokus og billedoptagelse trin for alle valgte felter i hver brønd, og for alle udvalgte brønde i pladen, samtidig optimere de eksperimentelle detaljer (fx godt nummer, felt position, eksponeringstid, objektiv, optisk indstilling, og lignende). For at optage et maksimalt antal komplette celle spor, blev billeder af tilstødende marker smeltet ind i en problemfri montage, hvor spor der spænder over mere end ét billede flettes ved høj præcision (figur S1).

Kvantificering af vandrende parametre, baseret på PKT morfometri

for at identificere enkelte numre blev billeder udsat for “udfladning”, og dermed kompensere for ikke-homogen belysning, udjævning og kontrast ekstraudstyr. Den resulterende intensitet histogram gav en stor top, der svarer til den uforstyrrede baggrund (figur 1c, sort asterisk); en høj intensitet top svarende til perle-fri spor (figur 1c, blå stjerne); og lav intensitet pixels svarende til perle-loaded celler (figur 1c, rød stjerne). Ved at anvende to binære tærskler, celler (figur 1d) og spor (figur 1e) kunne skelnes fra hinanden. Debris, ridser, spor med ingen eller mere end én celle, krydsende spor og spor strækker sig ud over grænsen af ​​montage, blev identificeret og kasseret (figur 1f, segmenter, der er skitseret i blåt). For at opnå fine definition af spor grænser, som let blev sløret af udjævning trin (figur 1 g), blev spor grænser genberegnet fra de originale billeder, ved hjælp multiscale segmentering analyse [26] (Figur 1 time).

(en ) en montage af 4 × 4 felter (1024 × 1024 pixels), hver erhvervet ved hjælp af en 10 × /0,4 mål. (B) En enkelt felt (512 × 512 pixels, arkiveret lodret 2 × 2) (c) Histogram af pixel intensitet: hovedtoppen (*) svarer til baggrunden pixels; den mindre top af lys intensitet (*) svarer til at spore pixels; og de mørke pixels repræsenterer cellelegemer og debris (*). De røde lodrette linjer markerer de to tærskler, som adskiller de spor pixel fra cellerne og baggrunden. (D, e) binære billeder, efter anvendelse af tærskler. Pixels med intensiteter under den nedre grænse (celler og rester) er farvet hvide i (d), og pixels med intensiteter over den højere tærskel (spor) er farvet hvid i (e). (F) Alle tilsluttede komponenter i hele montage er skitseret: Spor er skitseret i rødt. Objekter enten for små eller for store i området, der skal indgå i billedet analyser, eller ligger på grænsen af ​​den montage, er skitseret i blåt. (G) Udvidelse af en segmenteret felt efter binær segmentering. (H) Den samme område afbildet i (g), efter multi-skala segmentering, og med fine omrids af sporet og sporet akser. Scale barer: 250 um

Efter segmentering skridt, vi kvantificeret de forskellige morfometriske parametre for hver celletype.. Sporet parametre, der blev automatisk målt omfattede track område, perimeter, storakse, lille akse, aksial ratio og soliditet. Track lysvej og end-to-end længde blev manuelt målt. Sporet parametre beregnet ud fra disse morfometriske parametre omfatter vedholdenhed, effektiv hastighed, gennemsnitlig migration hastighed, lamellar aktivitet, og den samlede retningsbestemmelse. Disse morfologiske og “dynamiske” parametre er defineret i tabel S2, og grafisk præsenteret i figur 2.

Den automatiske beregning af de forskellige morfometriske parametre, der anvendes i denne undersøgelse, er demonstreret ved hjælp pkts dannet af H1299, B16-F10 og MCF7-celler. De beregnede parametre omfatter: Total track område (um

2), afgrænset med rødt; netto spor området efter celleareal subtraheres; mindre og større akser (um) af det bedste-fit ellipse; forholdet mellem akserne; migration hastighed [længde skelet og grene (grøn + blå) /migration tid], effektiv hastighed [end-to-end afstanden (farvet rød) /migration tid]; spore perimeter; ruhed [Perimeter

2 /(4π * Area)] og Soliditet [track område (blå) /område af konvekse skrog (rød + blå) omslutter sporet]. De værdier, der er angivet i figuren henviser til den enkelt spor vist.

Især selv tilsyneladende lignende parametre (fx “migration hastighed” og “effektiv hastighed”) kan variere meget. For eksempel B16-F10-celle, der er vist i figur 2, udviste næsten den samme migration velocity (62,4 um /time) som H1299 celle (67,26 um /time), medens den sidstnævnte celletype udviste en meget højere effektiv hastighed (57.26 pm /hr, sammenlignet med 20,4 um /time i B16-F10 celle), hvilket indikerer en mere vedvarende indvandring end førstnævnte. For at vurdere “lateral” lamellar aktivitet, som påvirker bredden og ruhed af track grænser, målte vi sporet perimeter, og beregnede ruhed og soliditet parametre. Denne analyse viste, at mens for afgrænsede spor dannet af H1299 og B16-F10-celler var næsten den samme, ruhed parameter var betydeligt højere i B16-F10 celle (5,2) end i H1299 celle (3.2), hvilket indikerer højere lamellar aktivitet i melanomceller. Dette resultat blev bekræftet direkte af time-lapse film (Figur 3, og film S1 og S2).

Forskellige tidspunkter er vist, hvor lateral lamellar aktivitet af en H1299 (øverste panel) eller B16-F10 (lavere panel) celler efterlade mærker på formen og ruhed af sporet grænsen. (Full-længde film er tilgængelige online som Movie S1 og Movie S2 henholdsvis.)

Anvendelse af PKT morfometri til måling celle-typespecifikke og lægemiddelinducerede virkninger på vandrende parametre

a) forskellige celletyper producerer PKT med forskellige karakteristika.

PKT analyse beskrevet heri blev brugt til at teste vandrende opførsel af en række forskellige cellelinjer. Disse omfatter: B16-F10 og B16-F1 melanom celler; MDA-MB-231 og MCF7 brystcarcinomceller, REF52, SV80 og NIH3T3 fibroblastlinier; H1299 lungecarcinomceller, og flere prostatacarcinom linjer (DU145, PC3 og CL1). Fire af disse cellelinier (MDA-MB-231, MCF7, H1299 og B16-F10) anvendes med henblik på illustration (se figur 4a og tabel S3). MCF7-celler, for eksempel næppe migrere, producerer kun en lille, perle-fri zone omkring hver celle, med en gennemsnitlig netto spor areal på 4.900 ± 2.400 um

2 (n = 93). De B16-F10 melanom celler producerer forgrenede spor på grund af udvidelsen af ​​multiple filopodia og tynde lameller stort set vinkelret på de vigtigste vandrende bane, med en gennemsnitlig netto areal på 7400 ± 2800 um

2 (n = 124). De MDA-MB-231 celler er stærkt vandrende metastatiske celler, der producerer både lange og brede spor med en gennemsnitlig netto areal på 13.500 ± 6300 um

2 (n = 149). H1299 celler er karakteriseret ved en hurtig og meget persistente migration, danner spor med en gennemsnitlig netto areal på 14.000 ± 7.600 um

2 (n = 104).

(a) En montage af 2 × 3 billeder af PKT af MCF7-celler, såvel som for MDA-MB-231-celler, B16-F10-celler og H1299-celler. Bemærk forskellene i sporet nettoareal (A

N) og aksial ratio (X), afhængigt af cellelinjen. (B) En montage på 2 × 3 foto af H1299 kontrolceller, som udviser lange vandrende stier, der er meget persistente. Montagen billeder af Latrunculin A (4 uM) – og Nocadazole (2,5 uM) -behandlede brønde indikerer inhiberet cellemotilitet; PMA (100 ng /ml) -behandlede godt viser en stigning i cellemotilitet. Scale barer:. 250 um

b) Virkningerne af cytoskeletale lægemidler på PKT strukturelle og dynamiske funktioner

For at afgøre, om vores automatiske screening systemet var i stand til at detektere ændringer i. specifikke migrerende funktioner induceret af genetiske eller kemiske perturbationer behandlede vi H1299-celler med forskellige forbindelser (fx Latrunculin-A, nocodazol og PMA) vides at påvirke cellemotilitet. Virkningen af ​​hvert lægemiddel på de forskellige morfometriske parametre blev derefter målt (figur 4b). Da værdierne for hver PKT parameter ikke syntes at have normale statistiske fordelinger, vi bygger vores sammenligning af ændringer i percentilværdierne for hver morfometriske parameter, snarere end om ændringer i de gennemsnitlige værdier (Tabel S4). Analyse af PKT området H1299-celler behandlet med de forskellige inhibitorer indikerede, at Latrunculin-A eller Nocodazole markant reduceret track områder, aksiale nøgletal, migration hastigheder og ruhed, sammenlignet med kontrolceller. I PMA-behandlede celler, PKT området, hovedakse og beregnede migration hastigheder øget (p 0,05), men den lille akse, gjorde aksiale nøgletal og soliditet ikke væsentligt forskellige fra dem af kontrol celler

Application. af PKT assay til identifikation af pro-migrerende gener i en brystcarcinoma-relateret genbibliotek (BC1000)

PKT heri beskrevne blev anvendt til at screene et bibliotek af cancerrelaterede gener for deres evne til at inducere en vandrende fænotype i stort set stationære bryst epitelceller. Med henblik herpå vi inficerede dyrkede MCF7-celler med retrovirale vektorer, der koder 55 gener valgt fra BC1000 biblioteket (tabel S5) og testet deres vandrende aktivitet ved hjælp af kvantitativ PKT screening.

Som vist i figur 5a og Tabel S6 , skærmen PKT muligt for os at identificere fire nye pro-migrerende kandidater: HOXB7, FGF7, ErbB3 og PKCζ. Den 80

th percentilværdierne samt gennemsnittet og standardafvigelsen, er præsenteret i tabel S6. Mens alle fire gener stimuleret MCF7 celle migration, deres virkninger på de forskellige vandrende parametre afveg. Medens FGF7 og PKCζ kloner inducerede dannelsen af ​​lange, vedholdende spor, på grund af forbedring af retningsbestemte membran fremspring, de aflange spor, fremkaldt af HOXB7 og ErbB3 syntes at være forbundet med flere membran fremspring i alle retninger. Derfor, mens fremtrædende retningsbestemte “forward fremspring” ikke direkte kan vurderes ved sporet morfometri, fremgår det, at forøgelse af banelængde som ikke er ledsaget af høje ruhed værdier, mest sandsynligt, drevet af øget retningsbestemt lamellipodial aktivitet (tabel S6 og figur 5). Det er interessant at bemærke, at i skærmen på BC1000 biblioteket blev ændringer i vandringsadfærd noteret for et andet gen, nemlig MFGE8 (også kendt som bryst epitelialantigenet BA46). Mens overekspression af dette gen induceres kun mindre forbedring i PKT område, det i høj grad øge spor ruhed, hvilket antyder, at det øger ikke-retningsbestemt membran fremspring (Naffar Abu-Amara, upublicerede data).

(a) A montage af 4 × 4 billeder, sammenligner PKT produceret af GFP-MCF7 kontrol celler, til dem, der produceres af MCF7-celler udtrykker BC1000-afledte gener HOXB7, PKCζ, FGF7, og ErbB3. Forstørrelse: 10 ×. Scale barer: 250 um. (B) beregnede forhold mellem hver af de vandrende morfometriske parametre for de forskellige BC1000 bibliotek kandidater, og de af kontrolceller (GFP-MCF7). Den primære statistiske metode udnyttes var baseret på beregning, for hver parameter, The normaliserede effekt af GFP-kontrol er altid defineret som nul “80

percentil.”: En værdi på nul indikerer ingen forskel mellem “80

percentilen “værdi af kandidat-genet og af kontrolcellerne. Numre, der er højere eller lavere end nul indikerer en stigning eller et fald, henholdsvis i 80

percentil værdi af de testede parametre. (For yderligere oplysninger, se tabel S6).

For at bestemme de indbyrdes forhold mellem de forskellige vandrende parametre, anvendte vi Pearson korrelation test til alle PKT produceret af uforstyrrede celler (Figur S2). Denne analyse viste, for eksempel, at banelængde (hovedakse og aksial ratio) negativt korreleret med spor soliditet, hvilket indikerer, at produktionen af ​​langstrakte numre af kontrolcellerne er stærkt korreleret med den laterale protrusive aktivitet. Denne analyse blev også anvendt på de celler, der udtrykker de forskellige pro-migrerende gener, for at bestemme deres evne til at forstyrre den tilsyneladende indbyrdes sammenhæng mellem alle vandrende parametre. Disse analyser viser, at overekspression af PKCζ, HOXB7, og ErbB3 formindsket gensidig relation mellem banelængde og soliditet.

Med hensyn til forholdet mellem den aksiale forholdet og dimensionerne af de lange og korte akser, kontrol- cellerne viser den fremherskende bidrag af den lange akse til den aksiale forholdsværdi, med lilleaksen udøver en begrænset effekt. I celler, der udtrykker FGF7 og PKCζ blev den aksiale forholdet primært korreleret på hovedaksen, mens ErbB3 og HOXB7 påvirket den aksiale forholdet ved at ændre sporvidden. Det fremgår således, at forøgelse af den samlede cellemigration ved forskellige pro-migrerende gener kan opnås ved selektiv modulering af en række dynamiske cellulære funktioner såsom celle polarisering og protrusive membran aktivitet.

Discussion

det primære formål med denne undersøgelse var at udvikle en kvantitativ analyse for celle migration, som kunne måle flere vandrende funktioner, og ville være forenelig med high-throughput screening. Den største eksperimentelle udfordring involveret i at designe en sådan analyse er den tilsyneladende konflikt mellem den hurtige overtagelse af stor mængde data migration, og behovet for at opnå “højt indhold” oplysninger om vandrende adfærd mange celler, herunder dynamiske funktioner såsom migration hastighed og lamellipodial aktivitet. Da indsamlingen af ​​direkte dynamisk information om celle migration er uforenelig med høj kapacitet, valgte vi derfor at udforske indirekte, men reproducerbar og robust, tilgange til at opnå sådanne oplysninger. Vi foreslår heri, at detaljerede morfometrisk analyse af PKT genereret af individuelle migrerende celler kan levere sådanne kvantitative, morfologiske og tilsyneladende dynamiske data

De nye aspekter af denne undersøgelse, som fortjener særlig diskussion er:. (I) valg af perler ; (Ii) track segmentering og morfometri; og (iii) statistisk analyse af data. Udvælgelsen af ​​perler til PKT analysen var baseret på tre egenskaber for “migration felt”: synligheden af ​​sporet (primært påvirket af perlen størrelse, med en optimal perle diameter på 300-400 nm); deres evne til at danne en homogen lag (optimal med aldehyd eller carboxylerede overflader fattige med sulfat-modificerede perler), og evnen til at blive fjernet ved at migrere celler (optimalt ved carboxylated- og fattige med aldehyd modificerede perler). Især er modtageligheden af ​​carboxylerede kugler til fjernelse ved migrerende celler omvendt korreleret til overfladen tætheden af ​​carboxylatgrupper, således “finjustering” af perlen laget for den særlige celletype, der skal testes.

PKT segmentering og morfometri forudsat vigtig indsigt i de grundlæggende funktioner i den vandrende proces. Disse omfatter den samlede vandrende aktivitet af cellen, svarende til nettet PKT område; migration polaritet, svarende til længden af ​​storaksen af ​​migration (eller den aksiale ratio); og “lateral” lamellar aktivitet, målt ved sporets soliditet, blandt andre værdier. Baseret på disse målinger blev flere dynamiske parametre beregnet, herunder gennemsnit og effektive migration priser, og lamellar aktivitet. Naturligvis er den dynamiske oplysninger, udledes af de statiske PKT morfologi, er temmelig indirekte, men data med høj opløsning [især ruhed spor grænser, målt ved multiscale segmentering analyse [26]; (Figur 1h)], som kan korreleres til dynamisk information, baseret på tid-lapse video mikroskopi (figur 3). Når beregnet for hvert spor, kunne flere parametre korreleres til hinanden, enten i kontrolceller, eller efter kemisk eller genetisk forstyrrelse.

Til vores formål blev PKT assayet anvendes til opdagelse af hidtil ukendte pro-migrerende gener i en brystcarcinoma-relateret genbibliotek. Rationalet bag denne tilgang er, at trods den indlysende molekylære kompleksitet af cellen migration proces, kan der være “master-gener”, der kunne fremkalde migrerende funktioner i en stationær celle. Den unikke kapacitet PKT assay vi udviklet til at fremhæve og kvantificere de enkelte funktioner i vandrende fænotype, kunne derefter knytte en given pro-vandrende gen til specifikke vandrende mekanismer. De nye pro-vandrende gener identificeret her nævnes: HOXB7, ErbB3, PKCζ og FGF7. Mens alle disse gener er kendt for at være “kræftrelaterede”, den aktuelle undersøgelse peger på muligheden for, at deres bidrag til den maligne proces kan være relateret til deres pro-vandrende aktivitet.

Materialer og metoder

Fremstilling af perle-coatede 96-brønds plader Salg

glas-bund 96 brønd plader (Whatmann, Inc., Clifton, NJ, USA, Cat. # 7706-2370) blev inkuberet i 2 timer ved stuetemperatur, med 50 pi 10 pg /ml fibronectin opløsning opløst i PBS (fibronectin, F-1141; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA). Brøndene blev derefter vasket to gange med PBS og overtrukket med 340 nm hvid polystyren latexperler (Interfacial Dynamics Corporation-Molecular Probes mikrosfærer Technologies, USA; Produkt nr 2-300;. Batch nr 1344.). Perlesuspensionen (3,2 ml) blev centrifugeret i 5 minutter ved 20.800 x g, og pelleten resuspenderes i 4 ml PBS, indtil alle synlige perle klumper blev dispergeret. Proceduren for sedimentation blev derefter gentaget en gang mere, hvorefter perlerne blev resuspenderet i 7 ml PBS, til en slutkoncentration på 0,9

12 partikler /ml. Portioner af 70 pi af perlesuspensionen sattes til hver brønd, der var blevet præ-coatet med fibronectin og inkuberet ved 37 ° C i 2 timer, efterfulgt af forsigtig vask med PBS (x 5) med en pladevasker (Colombus Plus , Tecan, Schweiz). Før celleudpladning blev PBS erstattet med 50 pi dyrkningsmedium er egnet til den særlige celletype anvendt i assayet (se figur S3).

Cell forberedelse til PKT assay

MCF7 (ATCC -HTB-22), MDA-MB-231 (ATCC-HBT-26), og B16-F10 (ATCC-CRL-6475) celler blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM); H1299-celler (ATCC-CRL-5803) blev dyrket i RPMI-1640. Begge dyrkningsmedier blev suppleret med 10% FCS, 2 mM glutamin, 100 internationale enheder /ml penicillin, og 100 ug /ml streptomycin (Biological Industries, Beit Haemek, Israel), og holdes i en CO 5%

2 befugtet inkubator ved 37 ° C. For PKT assay 200-400 celler (i 50 pi medium) blev dyrket i hver brønd. Afhængigt af de typiske spor dimensioner, som bestemt i præliminære eksperimenter blev antallet af udpladede celler, og inkubationstiden kalibreret at maksimere antallet af enkelt, ikke-krydsende celle spor. Typisk blev 200-400 celler /brønd og 7 timers inkubation fundet at være optimale parametre for de fleste celler.

Farmakologiske forstyrrelser af PKT dannelse Salg

For at bestemme virkningerne af forskellige farmakologiske inhibitorer på H1299 cellelinie blev celler udpladet og inkuberet i en time, hvorefter de blev behandlet med enten 4 uM Latrunculin A; 2,5 uM Nocodazole; eller 100 ng /ml PMA (phorbol-12-mirystate 13-acetat). Cellerne blev derefter inkuberet i yderligere 4 timer, fikseret med 3% paraformaldehyd og vasket to gange med PBS. Plader blev enten undersøgt straks ved hjælp af en screening autofokus mikroskop, eller opbevares ved 4 ° C til senere inspektion.

Screening for migration-fremkaldende gener

For at screene for migration-fremkaldende gener, vi udvalgte 55 kandidatgener fra BC1000 bibliotek: (https://www.hip.harvard.edu/research/breast_cancer/index.htm), samlet på Harvard Institute of Proteomics hjælp litteratur-mining software [27]. Dette bibliotek består af en samling af fuld længde cDNA kendt for at være forbundet med udviklingen af ​​brystkræft. CDNA’erne klones ind i en puromycin- valgbar retroviral vektor (JP1520) [28] ved hjælp Skaberen ™ rekombination systemet (Clontech, Mountain View, CA). De 55 testede gener (se tabel S5) blev tilfældigt udvalgt fra dette bibliotek, og blev generøst tilvejebragt af Prof. Joan Brugge (Department of Cell Biology, Harvard Medical School, USA). Gener blev introduceret i MCF7-celler ved hjælp af retroviral infektion. Hver klon blev testet for dets indvirkning på cellemigrering ved anvendelse PKT assay. Som kontroller, vi frembragte også JP1520 GFP-udtrykkende MCF7-celler. PKT Assayet blev udført i plader med 96 brønde. Fire hundrede celler per brønd blev udsået, og 8 brønde blev testet for hver klon. Cellerne blev inkuberet i 7 timer, og derefter fikseret under anvendelse af 3% PFA. Dataene blev indsamlet ved brug af autofokus-screening mikroskop.

Statistisk analyse

Da fordelingen af ​​spor parametre viser ikke-normale fordelinger, brugte vi den percentil statistisk redskab til skøn parametre variabilitet. For eksempel 80

percentil for spor område er værdien bellow hvor 80% af sporene område er fundet.

Forskelle mellem kontrol- og behandlede kulturer blev vurderet for signifikans under anvendelse af to stikprøver Kolmogorov- Smirnov goodness-of-fit hypotesetest. En p-værdi på 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Pearsons korrelation blev udført med værdier fra 1 (en perfekt positiv lineær sammenhæng mellem to testede variabler) til -1 (en perfekt. negativ lineær sammenhæng). En p-værdi på 0,0014 blev betragtet som statistisk signifikant

Støtte oplysninger

tabel S1.. Sammenligning

af egenskaberne af forskellige perler, der anvendes til PKT analysen

doi:. 10,1371 /journal.pone.0001457.s001

(0,03 MB DOC)

tabel S2.

Parametre anmærkning

doi:. 10,1371 /journal.pone.0001457.s002

(0,03 MB DOC)

Tabel S3.

PKT analyse for de forskellige cellelinjer

doi:. 10,1371 /journal.pone.0001457.s003

(0,03 MB DOC)

Tabel S4.

PKT analyse af H1299 celler behandlet med forskellige stoffer

doi:. 10,1371 /journal.pone.0001457.s004

(0,03 MB DOC)

tabel S5.

Liste over testede gener

doi:. 10,1371 /journal.pone.0001457.s005

(0,04 MB DOC)

tabel S6.

PKT analyse af MCF7-celler, der overudtrykker en given pro-vandrende gen

doi:. 10,1371 /journal.pone.0001457.s006

(0,05 MB DOC)

Figur S1.

En ordning, der beskriver købet image og display proces. (A) En skabelon i en 96-brønds plade. (B) positioner 52 felter, der kan erhverves inden for et godt, ved hjælp af en 10 × mål. (C) En montage af 4 × 4 billeder (1024 × 1024 pixels), der svarer til det markerede område af brønden. (D) En fuld-opløsning billede af et felt (512 × 512 pixels) inden montagen (markeret med c). Målestok:. 250 um

doi: 10,1371 /journal.pone.0001457.s007

(2,03 MB TIF)

Figur S2.

Auto-korrelation mellem PKT morfometriske parametre i kontrol- celler, og i celler, der udtrykker pro-migrerende gener. Autokorrelationen mellem de forskellige morfometriske parametre blev beregnet for kontrollen (GFP-MCF7) bibliotek, samt for celler, der overudtrykker de forskellige pro-migrerende gener er beskrevet i figur 5. Hvert rektangel er opdelt af en hvid streg i to trekanter; hver trekant viser korrelationen test af en anden kandidat. Den p-værdi for hver korrelation resultat er angivet under korrelationen score nummer

doi:. 10,1371 /journal.pone.0001457.s008

(4,16 MB TIF)

Figur S3.

Skematisk oversigt over 96 brønde forberedelse til PKT assayet

doi:. 10,1371 /journal.pone.0001457.s009

(0,96 MB TIF)

Movie S1.

PKT dannelse ved H1299, udpladet på polystyrenperler.