PLoS ONE: Ekspression af epidermal vækstfaktor receptor opdaget af Cetuximab Angiver dens effektivitet til at hæmme in vitro og in vivo spredning af tyk- og endetarmskræft Cells

Abstrakte

Cetuximab er et kimerisk mus-humant monoklonalt antistof rettet mod human epidermal vækstfaktor receptor (EGFR). Men EGFR bestemt af immunhistokemi ikke forudsige kliniske resultater af kolorektal cancer (CRC) patienter behandlet med cetuximab. Derfor vurderede vi sammenhængen mellem EGFR niveauer registreres af cetuximab og narkotika følsomhed CRC cellelinier (Caco-2, WiDr, SW480, og HCT116) og A431 epidermoide carcinom cellelinje. Vi anvendte flowcytometri (FCM) for at påvise EGFR-binding af biotinyleret cetuximab på celleoverfladen. Subklonede cellelinjer viser de højeste og laveste EGFR ekspressionsniveauer blev valgt til yderligere undersøgelse. Cytotoksiske assays blev anvendt til at bestemme differentielle reaktioner på cetuximab. Xenograftmodeller behandlet med cetuximab intraperitonealt at vurdere følsomheden over for cetuximab. Stærke reaktioner på cetuximab blev specifikt udvises af subklonede celler med høj EGFR ekspressionsniveauer. Endvidere cetuximab hæmmede væksten af ​​tumorer i xenograftmodeller med høje eller lave EGFR ekspressionsniveauer med 35% og 10% -20%, hhv. Vi konkluderer, at påvisning af EGFR af cetuximab lover at tilvejebringe en ny, følsom og specifik metode til at forudsige følsomhed CRC til cetuximab

Henvisning:. Shigeta K, Hayashida T, Hoshino Y, Okabayashi K, Endo T, Ishii Y, et al. (2013) Ekspression af epidermal vækstfaktor receptor Opdagede ved Cetuximab Angiver dens effektivitet til at hæmme

In vitro

In Vivo

spredning af kolorektal kræftceller. PLoS ONE 8 (6): e66302. doi: 10,1371 /journal.pone.0066302

Redaktør: Anthony W.I. Lo, Den kinesiske University of Hong Kong, Hongkong

Modtaget: Februar 23, 2013; Accepteret: 3 maj 2013; Udgivet: 18 juni 2013

Copyright: © 2013 Shigeta et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne forskning blev støttet af det japanske ministerium for uddannelse, kultur, sport, videnskab og teknologi Grant-in-Støtte til videnskabelig forskning (B) (# 23791559 KS, # 23.791.499 TH og # 25.293.292 YK). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

den epidermale vækstfaktorreceptor (EGFR) er et medlem af human EGFR-familien af ​​receptor proteintyrosinkinaser. Det er en vigtig terapeutisk mål i metastatisk kolorektal cancer (mCRC), og øget EGFR er kendetegnende for mange humane tumorer [1], [2]. Aktivering af EGFR-signalvejen resulterer i øget tumor proliferation, angiogenese, metastase, og tumorindtrængen gennem bindingen af ​​et antal forskellige ligander, herunder EGF-lignende molekyler, transformerende vækstfaktor-α (TGFa), og neuregulins til receptorens ektodomænet [3]. EGFR aktivering resulterer i initiering af potentielt onkogent intracellulære signalering kaskader, herunder RAS-mitogenaktiveret proteinkinase (MAPK), phosphoinositid 3-kinase (PI3K) /Akt, phospholipase C, signaltransducer og aktivator for transkription (STAT), og SRC /FAK-pathways [4] -. [6]

udviklingen af ​​monoklonale antistoffer har forbedret strategier til inhibering af aktiviteten af ​​EGFR inhibering i cancerterapi. Cetuximab (Erbitux, Merck-Serono, Darmstadt, Tyskland) er et kimært monoklonalt antistof (IgG1), som binder til ektodomænet af human EGFR og kompetitivt inhiberer ligandbinding til undertrykke tumor proliferation. Effekten af ​​cetuximab blev evalueret i kombination med irinotecan til behandling FRK patienter, hvis tumorer er positive for EGFR (vurderet ved immunhistokemi), og er resistente over for FOLFOX eller FOLFIRI regimer [7] -. [10] Salg

Mange undersøgelser der er blevet udført for at identificere faktorer, der kan forudsige respons på behandlingen, og CRC med muteret

KRAS

blev identificeret som regel ikke reagerer på anti-EGFR-behandling. [11], [12]. I modsætning hertil faktorer som EGFR overekspression, forstærkning af dets gen, og p53 mutationer korrelerer med respons på cetuximab; men de er ikke helt effektive til at forudsige responset på behandlingen med cetuximab [13], [14]. Eksperimentelle undersøgelser har antydet en sammenhæng mellem EGFR-niveau og effekten af ​​cetuximab [15]. denne sammenhæng synes dog at være spekulative i kliniske omgivelser, og nogle undersøgelser rapporterer at der er fundet nogen sammenhæng mellem intensiteten af ​​immunhistokemisk farvning for EGFR og svarprocenten [vurdering blev udført ved hjælp af svar evalueringskriterier i solide tumorer (RECIST) ], progressiv overlevelse eller samlet overlevelse i kliniske forsøg [8], [16] – [18].

en nylig rapport vist, at en mutation i EGFR ektodomænet giver resistens over for cetuximab ved at forhindre dets binding [ ,,,0],19]. Derfor vi spekuleret på, at påvisning af EGFR hjælp immunhistokemisk farvning under anvendelse af ikke-specifik IgG1 antistof adskiller sig fra detektion af cetuximab. Vores hypotese yderligere, at cellemembran-specifikke EGFR ekspressionsniveauer, som kan påvises ved cetuximab, kan påvirke inhibering af celleproliferation. I denne undersøgelse har vi udtænkt en fremgangsmåde, hvor vi anvendte biotinylerede cetuximab som det primære antistof til flowcytometri (FCM) til direkte påvisning af EGFR-ekspression ved CRC cellelinier. Ved hjælp af denne teknik, som vi evaluerede forholdet mellem EGFR niveauer detekteret af cetuximab-følsomhed CRC-cellelinjer.

Materialer og metoder

Udarbejdelse af Biotinyleret Cetuximab

Den mekanisme, hvorved biotinyleret cetuximab binder til EGFR er vist i figur 1a. Biotin blev konjugeret til cetuximab anvendelse af en tilpasning af fremgangsmåden beskrevet af Medical Biologisk Laboratories Co., Ltd.

(A) Biotinyleret cetuximab anvendes som et primært antistof til påvisning EGFR, og et avidin-FITC sekundært antistof anvendes under FCM til påvisning antigen-antistof-komplekser. (B: biotin, A: avidin) (B) FCM analyse af EGFR af A431-celler. Kontrol med antihumant, uspecifik IgG1 antistof mærket med FITC er beskrevet i rødt og cetuximab-biotylated antistof i blåt. Fluorescens intensitet er cirka 5 gange højere i forhold til kontrolgruppen antistof.

Colon Cancer cellelinjer og Identifikation af EGFR ektodomæne Mutationer,

KRAS

,

BRAF

, og

PIK3CA

Fire humane CRC cellelinjer, Caco-2, WiDr, SW480, HCT116, og epidermoid carcinom-cellelinie A431 blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA , USA) og dyrket som anbefalet. Autentificering af alle cellelinier blev udført ved at undersøge mutation status for hver CRC cellelinie ved anvendelse af Scorpion-buer eller direkte fremgangsmåder sekvens (gennemført af SRS Co., Japan).

KRAS

(codon 12 og 13),

BRAF

(exon 15), PIK3CA (exon 9 og 20) og EGFR ektodomæne (S492) mutationer blev bestemt i en delmængde af cellelinier og resultaterne er sammenfattet i tabel 1.

Caco-2, WiDr, SW480, og A431 blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagle-medium (DMEM) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 5% 0,1 mM penicillin-streptomycin og HCT116 blev dyrket i Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium suppleret med 10% FBS og 5% 0,1 mM penicillin-streptomycin. Alle cellelinier blev inkuberet ved 37 ° C i en fugtig atmosfære indeholdende 5% CO

2.

EGFR-binding af biotinyleret Cetuximab og evaluering af EGFR niveauer ved hjælp af FCM

Vi bruges biotinyleret cetuximab som det primære antistof til FCM. For at bekræfte cetuximab binding til EGFR, blev FCM udført under anvendelse af A431 cellelinie, der udtrykker høje niveauer af EGFR. A431-celler blev indstillet til 1 x 10

6 celler /rør og vasket to gange med 2 ml iskold phosphatbufret saltvand (PBS), og blokering blev udført i 30 minutter under anvendelse af blokerende reagenser N102 (NOF Co., Tokyo , Japan). Cellerne blev vasket igen og derefter biotinyleret cetuximab blev tilsat i 1 time for celler, som blev holdt på is. En antihumant, uspecifik IgG1 antistof mærket med fluoresceinisothiocyanat (FITC) blev anvendt som kontrol. Efter vask af cellerne med iskold PBS, et avidin-FITC-antistof (Streptavidin, Alexa Fluor® 488 konjugat, Molecular Probes®), et sekundært antistof, blev tilsat i 15 minutter på is. Endelig blev propidiumiodid (PI) anvendes til at bestemme cellelevedygtighed.

A BD FACS Aria ™ III cellesorteringsapparat systemet (BD Biosciences, San Jose, CA, USA), blev anvendt til FCM. EGFR ekspressionsniveauer blev evalueret ved at beregne intensiteten af ​​FITC signal. Efter vurderingen af ​​bindingen af ​​biotinyleret cetuximab til A431-celler, blev EGFR ekspressionsniveauer af de resterende fire CRC cellelinier vurderes ved den samme metode. Desuden blev cytogrammer (sammenligning af FITC og PE-signal) og histogrammer for hver CRC cellelinje i forhold til dem, for A431 celler ved hjælp af en BD FACSDiva 6.0 (BD Biosciences).

Etablering Subkloner med høj og lav EGFR Niveauer

begrænsende fortynding af cellekulturer blev udført i 96-brønds vævskulturplader udsået ved 0,8 celler /brønd i konditioneret medium (DMEM suppleret med 10% FBS og 5% 0,1 mM penicillin-streptomycin) høstet fra sunde ( 1 × 10

6 celler /ml og 95% levedygtighed) CRC cellekulturer. Tyve subkloner af hver CRC cellelinier blev isoleret, og EGFR ekspressionsniveauer blev bestemt under anvendelse biotinyleret cetuximab som beskrevet ovenfor. Celler med enten den højeste eller laveste EGFR ekspressionsniveauer blev udvalgt og dyrket i proliferationsassays og anvendes i xenograft model. Mutationen status hver subklonede CRC cellelinjer blev undersøgt igen for at afgøre, om der er nogen forskel mellem vilde og subklon celler.

Vækstsuppression Assay

Celler (1000 og 3000 celler /brønd) blev udsået umiddelbart efter evalueringen af ​​FCM i brøndene af en plade med 96 brønde i DMEM eller RPMI-medium som nævnt ovenfor suppleret med 0,5% FBS og 5% penicillin-streptomycin. Celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af cetuximab efter 24 timer og inkuberet i 6 dage. Cellelevedygtighed blev bestemt under anvendelse af 3- (4, 5-dimethylthiazol-2-yl) -2, 5-diphenyltetrazoliumbromid assay og dannelsen af ​​formazan blev målt ved dets absorbans ved 550 nm. Den relative hastighed af cellevækst for hver cellelinje blev indregnet i analysen ved at fratrække absorbansen ved tiden 0 fra de kontrol- og behandlingsgrupper.

xenograftmodeller og Cetuximab behandling

Alle dyr eksperimenter i denne undersøgelse blev godkendt af Animal Care og brug Udvalg for Keio Universitet. Subklonede cellelinier afledt fra WiDr og SW480 (2,0 × 10

6 celler) blev injiceret subkutant i højre og venstre side af ryggen af ​​5 uger gamle nøgne hunmus. Ekspressionsniveauet af EGFR af disse subklonede celler blev vurderet ved FCM i hver gang af eksperiment og cellerne blev straks injiceret. Tumorstørrelse blev målt ved anvendelse af en skydelære, og volumenet blev beregnet ved anvendelse af følgende formel: Volumen = længde × bredde × højde. Mus blev behandlet med 30 mg /kg cetuximab indgivet intraperitonealt på dag 0, 7, 14, og 21 eller med vehikelkontrol PBS (samme mængde som cetuximab). Behandlingen blev indledt, da tumorstørrelsen var ca. 100 mm

3. Tumorstørrelser blev målt to gange hver uge indtil dag 28, og forholdet mellem tumorvolumener til dem bestemt på dag 0 blev beregnet.

Vi evaluerede EGFR i Efterbehandlingen tumorer ved immunhistokemisk farvning under anvendelse af anti-human vildtype-EGFR-antistof og ikke cetuximab. Behandling af vævsprøverne blev udført ved anvendelse vævsprocessor (Sakura RH-12DM-II, Japan). Kort fortalt vævsprøverne blev fikseret i 10% formalin i 24 timer, og derefter bearbejdet i en stigende serie af ethanol og derefter godkendt med xylen og indlejret i paraffin. De paraffinindlejrede vævsprøver blev snittet ved en tykkelse på 4 um under anvendelse af en mikrotom (YAMATO ROM-380, Japan). Sektionerne blev monteret på starfrost /silan belagt slides (Muto PURE KEMIKALIER NewSilane II, Japan) og lufttørret. På dagen for farvning blev objektglassene nedsænket i xylen i 10 minutter før rehydrering i ethanol serien. Snit blev inkuberet i hydrogenperoxid i 10 min for at blokere endogen peroxidaseaktivitet. Forbehandling af deparaffiinized vævssnit med varmeinduceret epitopgenfinding er påkrævet. Optimale resultater opnås ved at forbehandle væv med med varme epitopgenfinding hjælp TE-buffer, pH 9,0. Hvorefter blev snittene inkuberet med anti-human vildtype EGFR (Dako, USA) primært antistof (1:50) til 4 grader natten over. For at bekræfte specificiteten af ​​binding blev normalt museserum-lgG anvendt som negativ kontrol i stedet for primært antistof. Efter omfattende vask blev snit inkuberet i 1 time i det sekundære biotinylerede antistof efterfulgt af DAB kromogen (Dako REAL EnVision Detection System, USA) i 8 min. Sektioner blev derefter counter-farvet med Mayers hematoxylin og dehydreret i stigende kvaliteter af ethanol før clearing i xylen og montering under et dækglas. EGFR cytoplasmatiske membran positivitet blev betragtet som positive EGFR-farvning. Farvning intensitet blev scoret som 0 (ingen farvning), 1+ (svag), 2+ (moderat) og 3+ (stærk).

Statistiske Analyser

Alle statistiske analyser blev udført ved hjælp af Stata software version 11.0. Forskelle mellem to grupper blev analyseret ved hjælp af en uparret Students

t

test og

s

0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

Påvisning af EGFR. af biotinyleret cetuximab

evne biotinyleret cetuximab at detektere EGFR hjælp FCM blev evalueret under anvendelse af A431 cellelinien, som udtrykker høje niveauer af EGFR [20]. Biotinyleret cetuximab blev anvendt som det primære antistof og FCM blev udført for at detektere FITC signal. Stærk FITC intensitet blev detekteret sammenlignet med kontrollen FITC-mærket IgG (fig. 1B). Dette fund tyder på, at EGFR udtrykkes af A431-cellelinje kan evalueres ved hjælp af biotinyleret cetuximab.

Mutation Status for

KRAS

,

BRAF

,

PIK3CA

og EGFR S492 ektodomæne

mutation status for hver CRC cellelinje er vist i tabel 1.

KRAS

mutationer i codon 12 og 13, som forudsiger effektivitet cetuximab behandling, ikke er påvist i Caco-2 og WiDr. I modsætning hertil blev codon G13D mutation påvist i SW480 og HCT116. Kodonet 12-mutationen blev ikke detekteret i de fire CRC cellelinier. Den exon 15 mutation i

BRAF

blev kun fundet i WiDr. Endvidere

PIK3CA

mutationer i exonerne 9 eller 20 blev detekteret i SW480 og HCT116 hhv. Endelig blev EGFR S492 ektodomæne mutation ikke påvist i alle cellelinjer.

Ud fra disse resultater, vi valgte Caco-2 som cellelinien, fordi det ikke har nogen mutation i nogen af ​​de tre gener, og forventes at være følsomme til cetuximab. HCT116 blev anvendt som en negativ kontrol, fordi det har den PIK3CA mutation i exon 20, som allerede er blevet vist at være resistente over for cetuximab [21], [22]. På den anden side blev SW480 med en KRAS mutation i p.G13D valgt, da det er kendt, at p.G13D-muterede tumorer er mere følsomme over for cetuximab forhold til andre KRAS-muterede tumorer [23]. Vi havde en stærk interesse i denne mutation og ønskede at vurdere, om vores hypotese og eksperimentel model kunne anvendes på p.G13D-muterede tumorer. Desuden var vi også interesseret i effekten af ​​cetuximab med BRAF mutation, fordi følsomhed over for cetuximab tidligere var observeret i xenograft model af BRAF-muterede tumorer [24].

Evaluering af EGFR Niveauer i CRC cellelinier

EGFR ekspressionsniveauer i hver CRC cellelinje blev vurderet ved anvendelse FCM med biotinyleret cetuximab. Intensiteten af ​​FITC og PE er vist i cytogram, og fluorescens af FITC blev let detekteret i alle fire CRC cellelinjer (Fig. 2A). Dette resultat antyder, at disse CRC cellelinjer udtrykker EGFR, hvortil cetuximab binder på celleoverfladen). Som angivet af dataene vist i fig. 2B, WiDr og SW480 cellelinjer udtrykte de højeste niveauer af EGFR.

(A) Hver cellelinje blev evalueret ved FCM med biotinyleret cetuximab. Alle fire CRC cellelinier afveg i EGFR ekspressionsniveauer. (B) Histogram af hver CRC cellelinier. Ekspressionsniveauet af EGFR blev målt ved intensiteten af ​​FITC-fluorescens.

Etablering af cellelinier, differentielt Express EGFR

EGFR kan være en af ​​de vigtigste gener til bestemmelse af fænotypen af cellerne. Derfor er metode til at opnå forskellige cellelinjer, der havde mindst indvirkning på den genetiske baggrund og viste en række af EGFR var ønskelig. Begrænsende-fortynding subkloning metode er den vigtigste teknik til at udlede forskellige typer af celler med samme genetiske baggrund [25]. Vi var i stand til at isolere subkloner af CRC cellelinjer under anvendelse af begrænsende fortynding teknikken og fastsatte EGFR ekspressionsniveauer i hver. I figur 3A, resultatet af FACS med WiDr subklonede celler samt forskellige EGFR udtryk er vist. Vi derefter udvalgt celler fra subklonede cellelinjer, der udtrykte de højeste og laveste niveauer af EGFR (fig. 3B). Mutationen status

KRAS

,

BRAF

,

PIK3CA

, og EGFR S492 ektodomænet ikke ændre i hver subklonede cellelinjer.

(A) histogram af WiDr subklonet cellelinier viser forskelle i EGFR. Forskellige EGFR udtryk blev set i subklonede cellelinier. (B) Høje og lave EGFR subkloner med høj eller lav EGFR blev udvalgt på grundlag af FCM resultater. Subkloner afledt af fire CRC cellelinjer blev analyseret, og subklonerne udviser højeste (blå) og laveste (grøn) niveauer af EGFR blev udvalgt til yderligere undersøgelser. Controls er beskrevet i rød linje.

følsomhed CRC Cell Lines til Cetuximab

Vi har udført analyser for at fastslå, om hæmmer cetuximab formeringen af ​​CRC-cellelinjer. Væksten i Caco-2 og SW480 var stærkt hæmmet, mens mellemliggende hæmning af WiDr og ingen hæmning af HCT116 cellelinjer ved den maksimale dosis af cetuximab blev observeret. For at vurdere, om EGFR niveau korreleret med spredning hæmning virkninger af cetuximab, vi brugte subklonede cellelinjer med høje eller lave EGFR niveauer. For at hæmme proliferation, subkloner af Caco-2, SW480, og WiDr, som udtrykte de højeste niveauer af EGFR, var mest modtagelige for virkningerne af cetuximab (fig. 4). Men svar på cetuximab blev ikke observeret i subkloner af disse cellelinjer, der havde lav EGFR niveauer. Subkloner af HCT116, der i massekultur viste minimal respons på cetuximab, svarede ikke på cetuximab, om de havde høje eller lave EGFR niveauer.

Når cetuximab blev givet til lave CRC subkloner med lav EGFR, svag inhibering af cellevækst blev observeret. Men væksten i subkloner med høj EGFR var stærkt hæmmet i sammenligning.

Følsomhed til Cetuximab i Xenografter af underklonet CRC cellelinier

Hver af de subklonede cellelinjer afledt WiDr og SW480 blev subkutant indpodet i nøgne mus (cetuximab, 30 mg /kg ugentlig i 4 uger), og forskellen i følsomhed over for cetuximab blev vurderet

in vivo

. Cetuximab hæmmede væksten af ​​WiDr celler, der udtrykte høje niveauer af EGFR med 35% sammenlignet med ubehandlede mus. I modsætning hertil blev cetuximab behandling af en WiDr subklon, der udtrykte lave niveauer af EGFR inhiberet med 20% sammenlignet med ubehandlede mus (fig. 5A).

(A) xenotransplantater afledt fra WiDr subklon celler behandlet med cetuximab. Stærk vækst hæmning blev set i tumorer afledt af subkloner med høj EGFR sammenlignet med ubehandlede mus; imidlertid observeredes kun lille hæmning af tumorvækst fremkaldt af xenografter af subkloner med lav EGFR. (B) Cetuximab behandling af tumorer afledt af xenografter af SW480 subkloner celler. Lignende resultater blev også observeret i tumorer afledt af SW480-xenotransplantater dvs. stærk vækstinhibering af tumorer afledt af subkloner med høj EGFR sammenlignet med subkloner med lav EGFR. (C) Sammenligning af tumorstørrelsen på dag 28. Tumorer afledt af subkloner med høj EGFR var signifikant mindre hos mus behandlet med cetuximab sammenlignet med tumorer afledt fra subkloner med lav EGFR. (D) repræsentant immunhistokemisk farvning af 3+ EGF-R-ekspression (i; A431), 2+ EGF-R-ekspression (II WiDr Høj og III SW480 Høj) og 1+ EGF-R-ekspression. (Iv; WiDr Low og v; SW480 Lav). I subkutan transplantation tumor af tyktarmskræft cellelinjer

Xenografter afledt af SW480 subkloner, der udtrykte høje niveauer af EGFR blev hæmmet med 35% i forhold til ubehandlede mus. Men xenotransplantater afledt af SW480 sublcones der udtrykte lave niveauer af EGFR blev hæmmet med kun 7% sammenlignet med ubehandlede mus (fig. 5B).

For tumorer induceret af subkloner afledt fra WiDr eller SW480 kulturer, tumorvolumenet af grupper behandlet med cetuximab blev sammenlignet med den af ​​de ubehandlede grupper efter 28 dage (fig. 5C). Tumorvolumen var signifikant mindre i cetuximab-behandlede grupper, der blev transplanteret med celler, der udtrykker høje niveauer af EGFR. I modsætning hertil cetuximab behandling ikke forårsage nogen signifikant forskel i tumorvolumener induceret af subkloner, der udtrykte lave niveauer af EGFR.

Baseret på immunhistokemisk farvning, subkutan transplantation tumor af A431, positiv kontrol, viste 3+ EGFR udtryk , mens høj WiDr og SW480 havde 2 + EGFR udtryk. I modsætning hertil udviste lave WiDr og SW480 tumorer mindre EGF-R-ekspression (fig. 5D). Disse resultater viste, at efter behandling tumorer stadig udtrykke EGFR.

Diskussion

Cetuximab, en kimære IgG1 antistof rettet mod EGFR, blev indført til at behandle mCRC. For at identificere de patienter, som vil gavne mest fra denne biologiske terapi, påvisning af

KRAS

mutationer blev foreslået som den vigtigste biomarkør [11], [26], [27]. Onkogene mutationer af

KRAS

observeres i ca. 40% (20% -50%) af sporadisk CRC [28] – [31]. Mutationer forårsage konstitutiv aktivering af Ras /Raf /MAPK signalvej, som er uafhængig af EGFR aktivering ved ligandbinding [32]. Karapetis

et al

. rapporterede signifikant forbedring hos patienter med vildtype

KRAS

som respons på behandling med cetuximab [12].

EGFR status evalueret ved brug immunhistokemisk farvning anses en anden biomarkør for effekten af ​​anti-EGFR behandlinger . Således blev EGFR niveau, der forventes at korrelere med følsomhed og effektivitet cetuximab. Trods denne hypotese, følger af en række undersøgelser tyder på, at EGFR status og dets ekspression niveau bestemt ved immunohistokemisk farvning muligvis ikke svarer til effekten af ​​anti-EGFR-behandling [8], [16] – [18]. Således blev registreret en reaktion på cetuximab hos patienter med målbart tumor-specifikke EGFR, hvilket fører til den konklusion, at svaret på cetuximab er uafhængig af EGFR i tumorvæv [18].

identifikation af yderligere genetiske determinanter for primær modstand mod EGFR-målrettede behandlinger i CRC er helt klart en prioritet. Resultaterne i denne undersøgelse tyder på, at EGFR-niveau, som detekteres af cetuximab korrelerer med effektiviteten af ​​cetuximab behandling. Endvidere kan vurderingen af ​​EGFR hjælp biotinyleret cetuximab metode forudsige den kliniske fordel af cetuximab behandling. Her har vi vist, at proliferation af CRC cellelinjer var stærkt inhiberet i celler, der udtrykte EGFR i høje niveauer, hvilket antyder, at EGFR ekspressionsniveauer detekteret ved cetuximab korrelerer med følsomheden af ​​celler til cetuximab behandling. Effekten af ​​cetuximab i en xenograft model blev også undersøgt ved at sammenligne xenotransplantater af CRC cellelinjer subkloner som udtrykte høje eller lave niveauer af EGFR. Større vækstinhibering af tumorer blev set i tumor induceret af subkloner med høj EGFR sammenlignet med dem med lav EGFR. Men vi er ikke bekendt med oplysninger om, at påvisning af EGFR af cetuximab er forbundet med følsomheden af ​​CRC til cetuximab behandling. Selvom yderligere undersøgelser vil være forpligtet til at definere sammenhængen mellem EGFR og følsomhed af tumorceller til cetuximab, vores nuværende resultater tyder på, at vores metode til påvisning af EGFR med cetuximab kan give en ny biomarkør.

Vi valgte fire CRC cellelinjer, Caco-2, WiDr, SW480, og HCT116 for vores nuværende undersøgelse. Disse cellelinier er blevet anvendt i mange andre tidligere undersøgelser for at vurdere effekten af ​​cetuximab behandling. Vi undersøgte også tilstedeværelsen af ​​mutationer i

KRAS

,

BRAF

,

PIK3CA

, og EGFR ektodomæne (tabel 1). En stærk reaktion på cetuximab blev observeret i Caco-2-celler, som manglede detekterbare mutationer i disse tre gener; var imidlertid et svar også påvist i SW480 celler, som huser et

KRAS

og PIK3CA mutation. Først med hensyn til

KRAS

mutation, effekten af ​​cetuximab er forbundet med længere samlet og progressionsfri overlevelse blandt patienter med kemoterapi-refraktær kolorektal cancer med p.G13D-muterede tumorer end med andre KRAS-muterede tumorer [23 ]. For det andet, om PIK3CA mutation, Ogino

et al.

Rapporterede, at

PIK3CA

mutationer var forbundet med kortere cancer specifik overlevelse hos patienter med KRAS wild-type tumorer i en række trin I-III kolorektal cancere [21]. Imidlertid blev De Roock

et al.

Rapporteret for første gang, at PIK3CA exon 20 mutationer er associeret med dårligere resultater sammenlignet med vilde typer, mens exon 9 mutation sig at have nogen virkning [22]. Ud fra disse tidligere rapporter, vores resultater var i overensstemmelse med dem i en anden undersøgelse, der viser, at cetuximab blev effektiv i SW480, som har KRAS codon 13 mutation og PIK3CA exon 9 mutation, hvorimod ingen positiv effekt blev set i HCT116 med PIK3CA exon 20 mutation.

Vi undersøgte også WiDr og SW480 CRC celler til at evaluere effekten af ​​cetuximab effekt bruge en mus xenograftmodel. En spredning assay viste, at en stærk eller mild reaktion på cetuximab i mus indpodede med enten WiDr eller SW480. Caco-2, som udviste stærk reaktion på cetuximab, blev også anvendt til at etablere xenograftmodel; men det undlod at indpode de mus. Væksten af ​​tumorer afledt af WiDr og SW480 implanteret var meget hæmmet, når subkloner udviste høj EGFR i forhold til dem med lav EGFR. Dette antyder, at forskellen i mængden af ​​EGFR korrelerer med cetuximab følsomhed. Men en begrænsning af denne undersøgelse er, at der er mulighed for ændringer i EGFR niveau under tumorprogression. Selv om vores ny metode til at kvantificere EGFR hjælp cetuximab kræver yderligere validering som biomarkør for effekten af ​​anti-EGFR-behandling, vores resultater tyder på, at EGFR ekspressionsniveauerne korrelerer med følsomhed på CRC til cetuximab.

De tilsyneladende uoverensstemmelser mellem resultaterne af vores nuværende undersøgelse, og dem tidligere rapporterede kan forklares som følger: for det første er EGFR udtrykkes i 40% -70% af kolorektal kræft, og tyder en forening med overlevelse [33] – [35]. Måden at vurdere mængden af ​​EGFR i kolorektale cancere indbefatter immunhistokemi, ligandbinding, immunoblotting, fluorescens in situ hybridiseringsanalyse og en række molekylære teknikker [36]. Imidlertid kan vurderingen af ​​EGFR blive påvirket af immunoreaktiviteten af ​​normale væv, differential EGFR reaktiviteten af ​​neoplasmer fra forskellige områder af tarmen, og heterogenitet reaktivitet inden for colorectal carcinom selv [17], [37]. For det andet, Scartozzi

et al.

Rapporterede, at EGFR status i primære kolorektale tumorer adskiller sig fra metastatiske steder [38]. Tredje, Montagut

et al.

Rapporterede, at EGFR S492R ektodomæne mutation forhindrer cetuximab binding og bibringer resistens over for cetuximab [19]. Dette fund tyder på, at EGFR kvantificering under anvendelse af immunhistokemi farvning detekterer enten vildtype eller muteret EGFR, som ikke binder cetuximab. Derfor kan vores nye metode løser dette problem, fordi det afhænger af evnen af ​​cetuximab at detektere EGFR.

Mange kliniske undersøgelser har vist effekten af ​​at tilføje cetuximab til behandling for mCRC [7], [8], [39]. Van Cutsem

et al

. udført en fase III-undersøgelse af førstevalgsbehandling, hvor cetuximab blev tilføjet til FOLFIRI og 5-FU-baserede multidrug kemoterapi med irinotecan [40]. Tilsætningen af ​​cetuximab var forbundet med en betydelig stigning i median progressionsfri overlevelse sammenlignet med ingen cetuximab. Jonker

et al

., I en anden fase III-studie, sammenlignet anti-EGFR-antistof behandling med bedste understøttende behandling hos patienter [10]. I denne undersøgelse blev cetuximab tilsat sammen med den bedste understøttende behandling og var forbundet med betydelige forbedringer i forhold til den bedste understøttende behandling alene. Men resultaterne fra de fleste undersøgelser viser en tendens til bedre overlevelse, hvis kemoterapi blev kombineret med cetuximab men afslørede ikke en betydelig indvirkning på CRC behandling.

svarprocent på cetuximab behandling for CRC er 30% -40 % [10]. Meget tyder på, at

KRAS

mutationer er de mest effektive prædiktorer for udvælgelse af patienter, der vil få gavn af behandling; men disse mutationer i sig selv ikke identificere de bedste responders. Vores nuværende resultater tyder på, at denne nye metode til påvisning af EGFR hjælp biotinyleret cetuximab kan give et middel til påvisning af meget følsomme patienter med vildtype

KRAS

. Selvom yderligere undersøgelser er nødvendige for at vurdere vores hypotese, kan den her beskrevne teknik giver en mere specifik indikation for gennemførelsen behandling af CRC med cetuximab.

Som konklusion, resultater af denne undersøgelse viser, at EGFR niveauer, som blev påvist ved cetuximab, kan korrelere med følsomhed over for cetuximab-medieret inhibering af tumorcellevækst. Derfor mener vi, at disse resultater kan give en ny metode til at kvantificere EGFR, hvorved mere effektiv udvælgelse af CRC patienter, der vil få gavn af behandlingen med cetuximab.

Tak

Forfatterne takker H.