PLoS ONE: Genotvpebestemmelse Cancer-associerede gener i chordom Identificerer mutationer i onkogener og Områder i Kromosomal Tab Inddragelse CDKN2A, PTEN, og SMARCB1

Abstrakt

De molekylære mekanismer bag chordom patogenese er ukendt. Vi søgte derfor at identificere nye mutationer til bedre at forstå chordom biologi og potentielt identificere terapeutiske mål. I betragtning af de relativt høje omkostninger ved hele genomet sekventering, udførte vi en fokuseret genetisk analyse ved anvendelse matrix-assisteret laser desorption /ionisering-time of flight-massespektrometer (Sequenom IPLEX genotypebestemmelse). Vi testede 865 hotspot mutationer i 111 onkogener og udvalgte tumorsuppressorgener (OncoMap v. 3,0) af 45 humane chordom tumorprøver. Af de analyserede prøver, syv blev identificeret med mindst en mutation. Seks af disse var fra friske frosne prøver, og en var fra en paraffinindlejret prøve. Disse observationer blev valideret ved hjælp af en uafhængig platform ved hjælp af homogen masse udvide MALDI-TOF (Sequenom HME Genotypebestemmelse). Disse genetiske ændringer kan nævnes: ALK (A877S), CTNNB1 (T41A), de nationale tilsynsmyndigheder (Q61R), PIK3CA (E545K), PTEN (R130), CDKN2A (R58 *), og SMARCB1 (R40 *). Denne undersøgelse rapporterer på den største omfattende mutationsanalyse af chordomas udført til dato. At fokusere på mutationer, der har den største chance for klinisk relevans, testede vi kun onkogener og tumorsuppressorgener, der tidligere har været impliceret i tumorigenese af mere almindelige maligne sygdomme. Vi identificerede sjældne genetiske ændringer, der kan have funktionel betydning for den underliggende biologi og potentielle lægemidler til chordomas. Mutationer i CDKN2A og PTEN forekom i områder af kromosomal kopi tab. Når disse data er parret med de undersøgelser, der viser 18 af 21 chordom prøver viser kopi tab på locus for CDKN2A, 17 af 21 chordom prøver viser kopi tab på PTEN, og 3 af 4 chordom prøver viser sletning på SMARCB1 locus, kan vi udlede at et tab af heterozygositet på disse tre loci kan spille en væsentlig rolle i chordom patogenese

Henvisning:. Choy E, MacConaill LE, Cote GM, Le LP, Shen JK, Nielsen GP, ​​et al. (2014) Genotypning Cancer-associerede gener i chordom Identificerer Mutationer i onkogener og Områder i Kromosomal Tab Inddragelse CDKN2A, PTEN, og SMARCB1. PLoS ONE 9 (7): e101283. doi: 10,1371 /journal.pone.0101283

Redaktør: Anette Duensing, University of Pittsburgh Cancer Institute, USA

Modtaget: 18 oktober, 2013; Accepteret: 4 juni 2014; Udgivet: Juli 1, 2014

Copyright: © 2014 Choy et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette projekt blev støttet delvist af Jennifer Hunter Yates Foundation, Stephan L. Harris chordom Fund, Kassandra Moseley Berry sarkom Begavet Fund, de Gategno og Wechsler fonde, og KL2 Medical Research Investigator Training (Merit) tilskud til EF gennem Harvard Catalyst /Harvard Clinical og Translational Science center (National Institutes of Health giver 1KL2RR025757-01), og ved finansielle bidrag fra Harvard University og dets associerede akademiske sundhedscentre. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. EF har modtaget høring gebyrer fra Amgen, Bayer, NPS, og Pfizer. LG er en konsulent for Novartis og Foundation Medicin og en egenkapital holder i Foundation Medicine. Det betyder dog ikke ændre forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer.

Introduktion

chordom er en aggressiv primær malignitet af den aksiale skelet, der menes at stamme fra notochordal væv [1]. Størstedelen af ​​disse tumorer forekommer i enten basen af ​​kraniet (35%) eller i korsbenet (50%), og disse er typisk styres med kirurgi og /eller stråling [2] – [10]. Deres kliniske adfærd er præget af lav vækst og en forkærlighed for at gentage sig trods kirurgisk resektion. De fleste patienter med tilbagevendende chordom og næsten alle patienter med metastaser i sidste ende vil dø af denne sygdom [11], [12]. Desværre er der ingen effektiv systemisk middel til at kontrollere inoperabel eller metastatisk chordom og udvikling af nye behandlinger er begrænset af vores fattige forståelse af dens biologi [12] – [15]

identifikation af føreren mutationer i malignitet. , såsom EGFR-muterede lungekræft, c-Kit muteret gastrointestinale stromale tumorer, og ALK-omplantede tumorer, blandt andre, har dramatisk ændret behandlingen landskabet for disse sygdomme [15] – [20]. Vi hypotesen, derfor, at for en typisk kemoterapi tumor såsom chordom hvor der ikke er effektiv systemisk terapi, identifikation af mutationer i gener, for hvilke der eksisterer en terapeutisk strategi kan præge udviklingen af ​​nye lægemidler. Men på grund af sjældenhed af patienter med disse tumorer, omfattende molekylær forståelse af chordom patogenese er i øjeblikket ufuldstændige,.

karyotype studier observerede chordomas med tab på kromosom 1p og 3p og gevinster, der involverer kromosomer 7q, 20, 5q, og 12q [21], [22]. Mobley et al. identificeret en kohorte af dårligt differentierede chordomas der mangler SMARCB1 /INI1 udtryk [23]. Cytogenetisk evaluering under anvendelse FISH viste, at 3 af de 4 prøver havde deletion i dette locus. Gene sekventering afslørede ingen punktmutationer. For nylig, Le et al. udført komparativ genomisk hybridisering på 21 chordom tumorprøver at vise hyppige tab af kromosomale regioner 9p21 og 10q23.3 [24]. De har også genotype for 56 punktmutationer forekommer i 13 gener almindeligvis er forbundet med kræft, herunder CDKN2A (placeret i 9p21) og PTEN (placeret i 10q23.3), men har ikke identificeret nogen ændringer i deres kohorte. Vi søgte at ekspandere på disse observationer ved at analysere 45 chordom prøver via high throughput genotypebestemmelse af cancer-associerede gener er kendt for at spille en vigtig rolle i kræft.

Metoder

Etik Statement

Institutionel review board godkendelse blev opnået til efterfølgende studere disse tumorprøver fra Forskningsudvalget Partners Menneske, 116 Huntington Avenue, Suite 1002, Boston, MA 02116. protokollen nummer er 2007P-002.464. Den institutionelle Review Board frafaldes behovet for at samtykke. Tumor prøver blev indhentet fra de kliniske arkiver Dr. Francis Hornicek (Ortopædkirurgisk Afdeling, Massachusetts General Hospital) og Massachusetts General Hospital Tissue Repository (https://www.massgeneral.org/cancer/research/resourcelab.aspx?id = 31).

chordom tumorprøver

tumor prøver blev indhentet fra de kliniske arkiver Dr. Francis Hornicek (Ortopædkirurgisk afdeling, Massachusetts General Hospital) og Massachusetts General Hospital Tissue Repository ( https://www.massgeneral.org/cancer/research/resourcelab.aspx?id=31).

Ekstraktion af Genomisk DNA

Ekstraktion af DNA fra chordom tumorvæv og cellelinier var udført under anvendelse af QIAamp DNA Micro kit (Qiagen) som tidligere beskrevet i tidligere publikationer [25]. Ekstraktionen blev udført ifølge producentens instruktioner. DNA blev opbevaret ved -20 ° C indtil anvendelse.

Udvælgelse af kræft genmutation og OncoMap v3 Assay Design

Udvælgelse af kræft genmutationer for assay design og massespektrometrisk genotypebestemmelse blev udført som tidligere beskrevet [25] – [27]. Flere databaser, herunder Sanger Institute COSMIC database, PubMed, og The Cancer Genome Atlas (TCGA), blev forespurgt for kendte somatiske onkogen og tumor suppressor genmutationer. Mutationer blev rangeret betydning efter hyppighed i kræft og på tværs af kræft undertyper, og gener med eksisterende terapeutiske modifikatorer blev fortrinsvis valgt.

Primere til PCR-amplifikation og forlængelsen sonden blev designet ved hjælp Sequenom MassARRAY Assay Design 3.0 og den resulterende DNA sekvenser blev (1) forespørges i dbSNP database for at undgå inkorporering af SNP’er under assay design, (2) bekræftes i en BLAST-lignende justeringsværktøj (BLAT) og modificeret nødvendigt at undgå pseudogen amplifikation [28], og (3) der blev syntetiseret umodificeret bruge standard rensning (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA).

Massespektrometrisk Genotypning

Primere og prober blev samlet og derefter valideret på kontrol-DNA stammer fra CEPH panel af humane HapMap DNA ( Coriell Institute) samt et panel af humane cellelinier med kendt mutationsstatus, som tidligere beskrevet [26]. Genomisk DNA blev kvantificeret ved hjælp Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit (Invitrogen, Carlsbad, Californien), udsat for hel-genom forstærkning (WGA) ved hjælp af Qiagen Repli-g-kit, og en post-WGA oprydning trin blev gennemført ved hjælp af en Nucleofast Purification Kit (Macherey-Nagel). Massespektrometrisk genotype hjælp IPLEX kemi blev udført som tidligere offentliggjort [27].

Kandidat mutationer blev yderligere filtreret ved manuel gennemgang og udvalgt til bekræftelse ved hjælp af multi-basen forlængelse homogen Masse-Extend (HME) kemi med plexing på ≤ 6 analyser pr pool. Betingelser for HME validering stemte overens med fremgangsmåderne beskrevet af MacConaill et al. 2009 [27].

Array Comparative Genomic hybridisering (CGH) Analyse

Array CGH hjælp af Agilent 4x180k CGH + SNP microarray (Santa Clara, Californien) er tidligere beskrevet [24]. Kopiér nummer aberration opkald blev foretaget med et minimum regional absolut gennemsnitlige log bund 2-forhold på 0,25 og minimum sammenhængende sonde optælling af 5. Alle array-data blev manuelt revideret for subtile ændringer.

Resultater

Kendetegn Klinisk tumorprøver

i alt 45 DNA-prøver blev afledt fra 40 patienter som havde fået foretaget operative resektioner af deres chordom. Patient dato for kirurgi (DOS), alder, køn, tumorplacering, gentagelse, og metastase er katalogiseret i tabel 1. 28 prøver blev opnået fra frisk frossen væv, og 17 blev afledt fra FFPE blokke.

genotype og CGH analyse

Eksempler på de massespektrometriske udlæsninger er vist i figur 1. Mutation resultater katalogiseret sammen patientkarakteristika i tabel 1. de identificerede mutationer inkluderer: ALK (A877S), CTNNB1 (T41A) også kendt som β-catenin nationale tilsynsmyndigheder (Q61R), PIK3CA (E545K), PTEN (R130), CDKN2A (R58 *), og SMARCB1 (R40 *).

PCR-produkter varierer i masse afhængigt af, om sonden forlængelse detekterer en cytosin (C) eller thymin (T). Tallet i højre viser masse spec plot af en allel i SMARCB1 vise et højdepunkt på både C og T. Det venstre panel viser, at de fleste undersøgte prøver var homozygote med C, og 2 prøver var heterozygote.

Blandt de 28 frisk frosne prøver testet blev 6 mutationer identificeret. Af de 17 FFPE prøver testede, var kun en mutation (i ALK) identificeret. Svarende til vores tidligere rapporterede satser for at detektere tilsvarende frekvens af mutationer mellem frisk frosset og paraffin indlejret osteosarkom tumorprøver [25], der syntes at være nogen forskel i antallet af mutationer i prøver, var frisk frosne sammenlignet med prøver af FFPE forberedt (Fishers eksakte test, p = 0,22 to haler). To prøver (prøver # 7 og 8 i tabel 1), taget fra den samme patient på forskellige anatomiske steder og kirurgiske datoer, hver havde de samme mutationer i både SMARCB1 og CDKN2A. Når vi udført CGH-analyse på prøverne med CDKN2A og PTEN mutationer, vi observerede kopital tab på respektive loci (figur 2), hvilket viser, at disse mutationer indtraf i regioner af kromosomal tab.

X-akse måler placering langs kromosom 9 (felt A) eller 10 (felt B). Y-akse foranstaltninger relativ sonde tæller. A: aCGH viser heterozyogous kopi tab på CDKN2A; B:. ACGH viser heterozyogous kopi tab på PTEN

Diskussion

Chordomas er tidligere blevet beskrevet at have kromosomafvigelser og er kendetegnet ved kromosomale gevinster og tab på forskellige regioner i hele genomet [ ,,,0],21], [22], [24], [29]. En omfattende genom-undersøgelse for højtforrentede mutationer er endnu ikke blevet udført på tværs af en stor samling af chordomas. Array komparativ genomisk hybridisering (aCGH) blev anvendt til at analysere 21 chordom tumorprøver [14] og observerede store kopital tab involverer kromosomer 1P, 3, 4, 9, 10, 13, 14 og 18 [24]. I denne undersøgelse, har en fokuseret analyse af 11 kræftrelaterede gener ikke afsløre nogen nye mutationer i DNA-sekvens. Diaz et al. udføres en hel-genom enkeltnukleotidpolymorfi microarray analyse af 21 clival chordom prøver at bekræfte CGH fund af andre, at kromosom 3 aneuploidi og kromosom 9p sletning forekommer (omend mindre hyppigt end i sakrale chordomas) [29].

med den nuværende teknologi, hel-genom sekventering af store samlinger af chordomas er dyrt og besværligt. Således har vi til formål at udvide vores mutations skærm mens kun fokusere på de genetiske ændringer, der tidligere har været impliceret som tumorigenisis bilister i andre tumortyper med det overordnede mål at identificere nye mutationer, der kunne dirigere yderligere forskning i chordom terapeutisk opdagelse. Nogle af de mutationer er identificeret i denne undersøgelse er i gener velkendte for deres rolle som tumorsuppressorer, såsom PTEN og CDKN2A. Interessant, begge af disse gener ligger i kromosomale regioner, der ofte blev fundet at have kopi nummer tab i den seneste CGH array analyse (9p21 for CDKN2A og 10q23.3 for PTEN) med en hastighed på 80% til hver. Derfor udførte vi CGH i prøverne, der indeholder mutationer i PTEN og CDKN2A og fundet kromosomale tab ved hvert loci i de respektive prøver. Interessant, 33% af prøver testet i Le et al. samling fandt fuldstændig tab af begge kopier af CDKN2A – argumenterer at enten en punktmutation ved CDKN2A eller fuldstændig kopi tab af CDKN2A kan føre til LOH i dette locus [24]. Vi har derfor udlede, at tabet af heterozygositet (LOH) ved disse loci kan potentielt være en tumorigen begivenhed for udvikling af chordom.

SMARCB1 er en underenhed af den ATP-afhængige chromatin remodeling kompleks SWI /SNF, en kraftfuld epigenetisk tumorsuppressor, som direkte antagoniserer histon methyltransferase EZH2. Mutationer i SWI /SNF medlemmer i stigende grad anerkendes i maligniteter, hvor de nu troede af nogle grupper til at være mere udbredt end inaktivere mutationer i p53 [30], [31]. SMARCB1 regulerer også celle-cyklus ved at aktivere CDKN2A, og dens tab fører til opregulering af EZH2 et molekyle, der bliver i adskillige inhibitorer, der i øjeblikket undergår kliniske test [32] – [34]. SMARCB1 er kendt for at blive forstyrret i maligne rhabdoid tumorer, rund celle bløddelssarkomer (de fleste var en delmængde af tumorer ligner extraskeletal myxoid chondrosarcoma med rhabdoid funktioner, epiteloide sarkomer og schwannomatosis [34] -. [38]

Disse tumorer, ligesom chordomas, er grupper af sjældne neoplasmer for hvilke der ikke effektiv terapi er kendt.. de brugte FISH at evaluere SMARCB1 locus på kromosom 22q og fundet sletning i 3 af 4 prøver [38]. Vi har derfor også udlede, at når SMARCB1 mutationer falder sammen i områder med kromosomal tab, kan tabet af heterozygositet også være en tumorigen begivenhed.

Flere af de mutationer findes i vores undersøgelse , såsom ALK, PIK3CA, og CTNNB1, har hver inhibitorer, som er kommercielt tilgængelige, såsom ALK-hæmmer XALKORI (crizotinib), eller have flere hæmmere i øjeblikket er under aktiv klinisk udvikling [39] -. [44] Observationer som vores foreslår den kliniske anvendelighed af at udføre en genotype rettet klinisk forsøg for at afprøve nye kinaseinhibitorer i denne sygdom population.

Afslutningsvis vi observerede chordomas med punktmutationer i tumorsuppressorgener i områder med hyppig kromosomale tab, og i onkogener med kommercielt tilgængelige inhibitorer. Den tidligere foreslår mulige mekanismer til chordom tumorigenese, sidstnævnte tyder mulighederne for nye behandlingsformer. Yderligere undersøgelser skal gøres for at etablere disse gener som vigtige biomarkører eller mål i chordom. Den ideelle undersøgelse ville være en komplet genom sekventering indsats, der omfatter mange flere chordom prøver. Vi håber, at denne første tegn på vellykket genotypning i den største samling af humane chordom tumorprøver til dato kan antænde entusiasme til yderligere undersøgelser i den molekylære patologi af denne sygdom, der i øjeblikket har nogen effektiv medicinsk behandling.