PLoS ONE: pterostilbene retsakter gennem Metastase-associeret protein 1 til hæmme tumorvækst, Progression og Metastase i Prostata Cancer

Abstrakt

Udviklingen af ​​naturlige agenter med målrettede strategier lover for øget anticancer behandling med reduceret lægemiddel associeret bivirkninger. Resveratrol findes i rødvin, har anticanceraktivitet i forskellige tumortyper. Vi rapporterede tidligere på en ny molekylært mål af resveratrol, metastaser-associerede protein 1 (MTA1), som er en del af nukleosom remodellering og deacetylering (NuRD) co-repressor kompleks, der medierer gendæmpning. Vi identificerede resveratrol som en regulator af MTA1 /NuRD kompleks og re-aktivator af p53 acetylering i prostatakræft (PCA). I den aktuelle undersøgelse, vi rettet, om resveratrol analoger også besidder evnen til at inhibere MTA1 og vende p53 deacetylering. Vi viste, at pterostilbene (PTER), der findes i blåbær, havde større stigning i MTA1-medieret p53 acetylering, bekræfter overlegen styrke i løbet af resveratrol som kosten epigenetisk agent. I orthotopisk PCa xenotransplantater, resveratrol og PTER signifikant inhiberede tumorvækst, progression, lokal invasion og spontan metastase. Desuden MTA1-knockdown sensibiliserede celler til disse midler resulterer i yderligere reduktion af tumor progression og metastase. Reduktionen var afhængig af MTA1 signalering viser forøget p53 acetylering, højere apoptotisk indeks og mindre angiogenese

in vivo

i alle xenotransplantater behandlet med forbindelserne, og især med PTER. Alt i alt, vores resultater tyder MTA1 som en stor bidragyder i prostata tumor ondartet progression, og støtte brugen af ​​strategier rettet mod MTA1. Vores stærke prækliniske data indikerer PTER som en potent, selektiv og farmakologisk sikkert naturligt produkt, der kan testes i avanceret PCa

Henvisning:. Li K, Dias SJ, Rimando AM, Dhar S, Mizuno CS, Penman AD, et al. (2013) pterostilbene retsakter gennem Metastase-associeret protein 1 til hæmme tumorvækst, Progression og Metastase i prostatakræft. PLoS ONE 8 (3): e57542. doi: 10,1371 /journal.pone.0057542

Redaktør: Natasha Kyprianou, University of Kentucky College of Medicine, USA

Modtaget: 26 september, 2012; Accepteret: 25 Jan 2013; Udgivet 1. marts, 2013 |

Dette er en åben-adgang artiklen, fri for alle ophavsrettigheder, og kan frit gengives, distribueres, overføres, ændres, bygget på, eller på anden måde bruges af alle til ethvert lovligt formål. Værket gøres tilgængeligt under Creative Commons CC0 public domain dedikation

Finansiering:. Undersøgelsen blev delvist støttet af Intramural Research Support Program tilskud (# 59.927 og # 68100231012) fra University of Mississippi Medical Center til ASL. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklæret der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Prostatakræft (PCA) behandling udgør stadig et udækket medicinsk behov. Kost-afledte polyfenoler, herunder stilbener, er attraktive kliniske kandidater til primær og sekundær cancer kemoforebyggelse grund af deres evne til ikke kun at blokere eller hæmme initiering af carcinogenese, men også at vende de salgsfremmende etaper. Sidstnævnte egenskab gør disse forbindelser lovende terapeutiske midler. Resveratrol (Res) og andre naturlige stilbener er phytoalexins der er produceret af planter som reaktion på miljøbelastning [1]. Resveratrol har hjertebeskyttende, anti-inflammatoriske og anticancer aktiviteter [2], [3]. Anticancer handlinger resveratrol involverer regulering af multiple og forskellige molekylære mål og medieres ved induktion af cellecyklus og apoptose [4] – [8] og inhibering af angiogenese [9] – [13].

Vi nylig opdaget, at resveratrol nedregulerer metastase-associerede protein 1 (MTA1) i PCa [13]. MTA1 overekspression er korreleret med klinisk-patologiske parametre, der kendetegner tumor aggressivitet: lymfeknudemetastase, høje tumor kvaliteter, og angiogenese i forskellige kræftformer [14] – [19]. I humane prostatavæv blev en høj MTA1 niveau er forbundet med hormon-refraktær PCa [15]. Vi oprindeligt identificeret MTA1 som en ny deltager i “ond cirkel” af PCa knoglemetastaser, og yderligere demonstreret, at intensiteten af ​​farvning og nuklear lokalisering af MTA1 i humane væv blev korreleret med aggressivitet PCa og knogle metastatiske læsioner [19]. Vi etablerede også, at MTA1 havde pro-overlevelse, anti-apoptotiske, invasive og pro-angiogene egenskaber i PCa

in vitro

in vivo

[19].

MTA1 er en del af nukleosom remodellering og deacetylering (NuRD) co-repressor kompleks involveret i histon og ikke-histon-protein deacetylering og gen-transkriptionel regulering [20], [21]. Komplekset indeholder også histondeacetylaser 1 og 2 (HDAC1 og 2). Vi har tidligere vist, at resveratrol-induceret MTA1 nedbrydning destabiliserer MTA1 /HDAC /NuRD deacetylering kompleks fører til forøget acetylering /aktivering af tumor suppressor p53 i PCA-celler [13]. MTA1 tavshed gennem RNAi væsentligt sensibiliserede PCA celler til resveratrol-afhængig p53 acetylering og apoptose. Dette HDAC inhibitor-lignende aktivitet af resveratrol blev yderligere understøttet af kombinationseksperimenter med klinisk godkendt HDAC inhibitor suberoylanilid hydroxamsyre (SAHA), hvori resveratrol synergistisk forøget p53-acetylering og apoptose [13]. Vi har også vist, at MTA1 knockdown celler var undertrykt invasion og angiogenetiske aktivitet

in vitro

, og forsinket tumor dannelse og udvikling i subkutane xenotransplantater [19]. Tilsammen vi definerede en ny epigenetisk mekanisme for anticancer aktivitet af resveratrol medieret gennem den negative epigenetiske regulator, MTA1.

På trods af sin lovende egenskaber, har resveratrol hurtige metabolisme og lav biotilgængelighed udelukket sit avancement til klinisk anvendelse [2] , [22] – [24]. Begrænsningerne af resveratrol har bedt vores interesse i naturlige og syntetiske analoger med forbedrede farmakokinetik og overlegen farmakologiske potens, der holder større potentiale som anticancer naturprodukt narkotika [25]. Men hvordan resveratrol analoger sammenlignes med hinanden i form af potens og virkningsmekanismer er stort set ukendt.

in vivo

effekter er hovedsageligt uudforsket for resveratrol-analoger, hvilket gør det vanskeligt at vælge hvilken analog (er) er det bedste for klinisk udvikling.

I den aktuelle undersøgelse, vi gennemførte en sammenlignende analyse af resveratrol og seks analoger i deres evne til at hæmme MTA1 udtryk og signaler, og fokuserede på MTA1-medieret anticancer og antimetastatiske virkninger af de mest potente analog, PTER, hjælp ortotopisk PCA xenografter. Vores resultater tyder MTA1 som en stærk mål for intervention fra kosten PTER som terapeutisk naturprodukt lægemiddel til anticancer-terapi i primær og metastatisk PCa.

Materialer og metoder

Etik Statement

Alt dyr arbejde blev udført i overensstemmelse med godkendte dyr protokol # 1272 af Institutional Animal Care og brug Udvalg University of Mississippi Medical center og akkrediteret af Association for Vurdering og akkreditering af Lab Animal Care International i overensstemmelse med US Public Health service politik som sikret ved Kontoret for laboratoriet dyrevelfærd.

Materialer

Resveratrol og piceatannol (PIC) blev opnået fra kommercielle kilder (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO og Calbiochem-Novabiochem Corp. , San Diego, CA, henholdsvis). Pterostilbene blev syntetiseret ved publicerede procedurer [26] trimethoxy-resveratrol (3M-Res) og (

E

) -4- (3,5-dimethoxystyryl) anilin (DMSA) blev syntetiseret ifølge tidligere beskrevne fremgangsmåder [27 ]. Triacetyl-resveratrol (3AC-Res) og 3,5-diacetyl resveratrol (2AC-Res) blev syntetiseret som følger: Til 18 mg af resveratrol opløst i 500 pi MeOH blev 10 dråber pyridin og 500 pi eddikesyreanhydrid tilsat. Blandingen blev omrørt natten over ved stuetemperatur. Ethylacetat (EtOAc) blev tilsat til reaktionsblandingen, og derefter delt med vand for at fjerne pyridin. EtOAc-laget blev koncentreret under en strøm på nitrogen, og spottet på en tyndtlagschromatografi plade. Pladen blev fremkaldt under anvendelse af opløsningsmiddelsystem 30% EtOAc: 70% hexan. Bånd 3AC-Res (Rf 0,8) og 2AC-Res (Rf 0,6) blev skrabet fra pladen og ekstraheret med EtOAc. Strukturerne af 3AC-Res og 2AC-Res blev bestemt ved kernemagnetisk resonans og massespektrometri. Strukturerne af alle andre stilbener er også blevet bekræftet ved spektroskopi. Renheden af ​​forbindelserne blev bestemt til at være 99%. Forbindelserne blev opløst i høj renhed ethanol eller DMSO og opbevares i mørke ved -20 ° C før anvendelse i assays.

Cellekultur

LNCaP og DU145 PCA-celler blev erhvervet fra American Type Culture Collection (ATCC). PC3M celler en gave fra Dr. R. Bergan (Northwestern University, Chicago, IL) [28], [29], og RWPE-1, “normale” udødeliggjort prostata epitelceller, var en gave fra Dr. C. Lee ( Northwestern University, Chicago, IL) [30]. PCA-celler blev dyrket i RPMI-1640 indeholdende 10% FBS, 5% penicillin /streptomycin som tidligere beskrevet [13], [19]. RWPE-1-celler blev dyrket i ATCC komplet vækstmedium, der indeholder basen keratinocyt serumfrit medium suppleret med ekstrakt fra bovin hypofyse og human rekombinant epidermal vækstfaktor. Celler blev holdt i en inkubator ved 37 ° C med 5% CO

2. Medium blev erstattet med phenolrødt-frit RPMI-1640 med 5% trækul-strippet serum 16-18 timer før resveratrol /analoger behandlinger for at tilvejebringe steroid-fri baggrund.

Western blot-analyse

Western blot-analyse blev udført som tidligere beskrevet [13], [19]. Kort beskrevet blev celler behandlet med forskellige koncentrationer af resveratrol eller analoger i 24 timer. Cellerne blev vasket med kold PBS, og lyseret ved RIPA lysis og ekstraktion buffer indeholdende Halt phosphatase og Protease Inhibitor Cocktail (Thermo Scientific). Proteinkoncentrationen blev målt under anvendelse af Bio-Rad proteinassay reagens (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Lige mængder af protein (40-70 mg) blev løst i 7-10% Tris-TGX Ready geler og overføres til en PVDF membran ved Mini Trans-Blot Elektroforese Transfer System (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Membranerne blev derefter blokeret med TBS-Tween og 5% tørmælk i 2 timer ved stuetemperatur og probet med MTA1, AR, p53 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) eller Ac-p53 (K381) (Abcam) antistoffer. Blottene blev derefter probet med p-actin-antistoffer (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) som en loading kontrol. Signaler blev visualiseret under anvendelse forøget kemiluminescens. Densitometri blev gjort ved hjælp Billede J. Effektiv dosis (ED

50) værdier blev beregnet af Chou-Martin-metoden ved hjælp CompuSyn for Drug Kombinationer og for General Dosis-Effect Analysis software (ComboSyn, Inc., Paramus, NJ).

Generering af Stabile celler Tagget med Luciferase

MTA1-knockdown DU145 celler blev tidligere etableret ved hjælp af Expression Arrest GIPZ lentiviral shRNAmir vektorer, der udtrykker MTA1shRNA eller ikke-tavshed tom vektor (EV, Open Biosystems) og var karakteriseret

in vitro

in vivo

[13], [19]. Vektorer indeholdt grønt fluorescerende protein (GFP) og en puromycin-resistens gen. Selvom celler viste høj GFP signaler

in vitro

,

in vivo

eksperimenter lykkedes på grund af høje baggrund signaler fra animalsk væv. Som bioluminescens har høj signal-til-støj forhold til fluorescens, vi transducerede celler med lentiviral luciferase (Luc) konstruere (en gave fra Dr. R. Graeser, Institut for Medicinsk Onkologi, Freiburg, Tyskland) og udvalgte stabile kloner hjælp puromycin. Klonale populationer af celler blev ekspanderet

in vitro

og testet for deres luciferaseaktiviteter (se nedenfor). Adskillige lyse kloner blev gentagne gange valgt igen og samlet sammen til celler med høj luciferaseekspression skal bruges

in vivo.

In vitro

in vivo

Bioluminescent Imaging

In vitro

in vivo

bioluminescens (BL) blev udført ved hjælp af en IVIS Spectrum (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA). Billeder og detektion af BL signaler blev erhvervet og analyseret ved hjælp Living Billede Software V. 4.1. For

in vitro

billeddannelse, celler mærket med luciferase blev serielt fortyndet i en sort, klar bund 96-brønds plade (Costar, Corning, NY). D-luciferin (150 ug /ml) blev tilsat til brøndene, blev pladen inkuberet ved 37 ° C, 5% CO

2 i 10 minutter, hvorefter billederne blev taget. For

in vivo

BL billeddannelse, blev bedøvet mus injiceret intraperitonealt (i.p.) med 150 mg /kg D-luciferin (Caliper) og anbragt inde i kameraet kasse i 10 minutter. Kontinuerlig eksponering til 2% isofluran vedvarende sedation under billedbehandling. Erhvervelse tid var normalt højst 3 min med auto-eksponering afhængig af BL af tumorer. Målinger af udsendt lys blev udført for regioner af interesse (ROI) og kvantificeret som fotonflux (fotoner /sek /cm2 /sr). Normalisering blev udført for alle billeder ved slutningen af ​​eksperimentet. skala billeder af mus Gray blev også indsamlet på hver session. Påvisning af metastase under eksperimentet blev forurenet med stærke primære signal, der resulterer i falsk-positive signaler. Derfor ved afslutningen af ​​eksperimentet, vi afsondret det primære signal ved udskæring prostata og omgivende muskelvæv for at blotlægge organer i bughulen. Nyrer, lever og lunge /hjerte fra hver mus blev isoleret og

ex vivo

afbildet ved at øge Binning og F /stop.

ortotopisk PCA Xenografter

Seven uger gamle mandlige nøgne mus (Fox n1nu, Harlan) blev fodret phytoestrogen-fri AIN-76A kost fra dag modtog. Dyrene blev randomiseret til to store grupper forud for kirurgi og efterfølgende injiceret med enten DU145-EV-Luc (EV) eller DU145-MTA1shRNA-Luc (MTA1shRNA) celler. Under operationen blev musene bedøvet med 2% isofluran, blev et 7-9 mm abdominal midtlinie incision, og prostata blev blotlagt. 2,5 × 10

6 celler af hver cellelinje, i 20 pi PBS og Matrigel, injiceret i anterior prostata. Såret blev sutureret, og huden blev lukket med autoclips. Dyr blev nøje overvåget efter kirurgi og clips blev fjernet på dag 10. Tumorer koloniserede og voksede i 14 dage. Mus, der udviklede tumorer i hver gruppe blev randomiseret i tre undergrupper (n = 6) med daglige i.p. administration af 10% DMSO fingeret kontrol (Ctrl); 50 mg /kg resveratrol eller PTER. Begge forbindelser var opløselige i 10% DMSO når varmet op ved hjælp af vandbad. Hver uge friske opløsninger blev fremstillet til injektion. Legemsvægt og BL-signaler blev overvåget ugentligt. Musene blev aflivet ved uge 8 efter celleinokulering. Ved obduktion blev prostata og andre organer fjernet,

ex vivo

afbildet og fikseret med 10% neutral-bufferet formalin (Richard Allan Scientific, Kalamazoo, MI). Serum blev også opsamlet og opbevaret ved -80 ° C

Histopatologi og Immunhistokemi

Fire um tyk snit blev fremstillet fra formalin-fikserede paraffin indlejret tumorer og farvet med hematoxylin og eosin (H W DB-5 kapillarsøjle (0,25 mm indre diameter, 0,25 um filmtykkelse, mm længde 30; Agilent Technologies , Foster City, CA). GC temperatur program var: indledende 190 ° C holdt i 1 min, steg til 244 ° C med en hastighed på 30 ° C /min og holdt ved denne temperatur i 0,5 min, steg til 246 ° C med en hastighed på 0,5 ° C /min og holdt i 0,5 min, steg til 280 ° C med en hastighed på 20 ° C /min og holdt i 2 min, derefter endelig øget til 300 ° C med en hastighed på 30 ° C /min og holdt i 0,8 min. Bæregassen var ultrahøj renhed helium, ved 1 ml /min strømningshastighed. Injektionsporten blev holdt ved 250 ° C, GC-MS-grænsefladen ved 230 ° C, og i ioniseringskammeret ved 230 ° C. Volumenet af injektion var 2 pi (splitless injektion). Massen spektret blev erhvervet i udvalgte ion-overvågning tilstand, elektron effekt 70 eV. Pterostilbene blev overvåget med m /z 328, 313 og 297 (retentionstid 11,6 min). Resveratrol blev overvåget med m /z 444, 428 og 414 (retentionstid 13,7 min). Kvantificering blev udført ved hjælp af eksterne standarder af en kommerciel prøve af resveratrol (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) og en syntetisk prøve af PTER [31].

Statistiske Analyser

Værdierne er udtrykt som middelværdien ± SE eller box plots af målinger. Students en-halet parret t-test blev anvendt til at analysere

in vitro

data. Forskelle i tumor BL intensitet

in vivo

blev analyseret ved enten rang-baserede eller tovejs ANOVA efterfulgt af Bonferroni post hoc analyser eller af Kruskal-Wallis test. For nogle analysedata værdier blev log transformeret. Forskellene blev betragtet som signifikante ved p. 0,05

Resultater

Pterostilbene er en potent hæmmer af MTA1 Expression i PCA Celler

Vi har for nylig opdaget, at resveratrol hæmmer epigenetiske modifier MTA1 , hvilket i sidste ende fører til øget p53 acetylering og apoptose af PCA-celler [13]. Her testede vi seks resveratrol analoger (fig. 1) for at afgøre, om de ville have bedre anticancer aktivitet ved inhibering af denne specifikke molekylære mål. Af de analoger, PTER, piceatannol (PIC) og trimethoxy-resveratrol (3M-Res) er naturligt forekommende, mens dimethoxystyrylaniline (DMSA), diacetylstilbene (2AC-Res) og triacetylstilbene (3AC-Res) er syntetiske derivater. Vi undersøgte virkningerne af disse analoger på MTA1 udtryk i tre PCA cellelinier, der repræsenterer forskellige stadier af PCa progression. Cellerne udtrykker MTA1 på forskellige niveauer, fra moderat høj i androgen lydhør LNCaP- og androgen-resistent DU145 til meget høje niveauer i metastatiske PC3M celler (Fig. 2A). Vi behandlede cellerne med forskellige doser (5-100 uM) af resveratrol /analoger til 24 timer og isoleret protein for Western blots. Der var nedregulering af MTA1 ekspression i forbindelse-behandlede sammenlignet med vehikelbehandlede celler (fig. 2). Resveratrol og analoger hæmmede MTA1 protein niveauer i en dosisafhængig måde, men med forskellige kræfter. MTA1-inhibering med analoger var cellespecifik: mens den inhibitoriske virkning af PTER var sammenlignelig med resveratrol i LNCaP-celler (. Figur 2B), i DU145-celler, 3AC-Res, PIC og PTER var mere potent end resveratrol, men kun PTER havde en ED

50 værdi i det lave mikromolære område (13,9 uM) (fig. 2C). I PC3M celler, 3M-Res og PTER demonstrerede højere potens end resveratrol, og endnu en gang, PTER havde den laveste ED

50 værdi (41,6 uM;. Figur 2D). Derfor blandt de seks testede analoger, PTER demonstrerede den mest potente MTA1-inhibering på tværs af alle tre cellelinier. Pterostilbene blev oprindeligt isoleret fra sandeltræ og senere blev fundet i druer og blåbær [31], [32]. Ligesom resveratrol, PTER er en potent antioxidant og antiinflammatorisk middel med kemoforebyggende og anticanceraktivitet [33] – [42]. I DU145 celler, PTER udstillet den højeste MTA1-hæmmende potens (mere end syv gange højere end resveratrol). Vigtigere, PTER demonstrerede større forøgelse MTA1-medieret p53 acetylering, især i MTA1-Knockdown sensibiliserede celler (fig. 3), hvilket indebærer overlegen styrke i løbet af resveratrol som kosten epigenetiske middel, der styrer posttranslationelle modifikationer af proteiner.

Resveratrol ( Res),

trans

-3,5,4′-trihydroxystilbene; Pterostilbene (PTER),

trans

-3,5-dimethoxystilbene; Trimethoxy-Resveratrol (3M-Res),

trans

-3,5,4′-trimethoxystilbene; Piceatannol (PIC),

trans

-3,5,3’4′-tetrahydroxystilben; Dimethoxystyrylaniline (DMSA),

trans

4- (3,5-dimethoxystyryl) anilin; Diacetyl-Resveratrol (2AC-Res),

trans

-3,5-diacetylstilbene; Triacetyl-Resveratrol (3AC-Res),

trans

-3,5,4′-triacetylstilbene.

A. Cellelinjer repræsenterer forskellige stadier af PCa progression: RWPE-1, “normale” udødeliggjort prostata epitelceller; LNCaP, androgen-responsive celler; DU145, androgen-resistente celler; PC3M, aggressive metastatiske celler. Celler blev dyrket i RPMI-1640-medier indeholdende 10% FBS og antibiotika. 75 ug protein blev separeret på 10% gel, overført til membran og probet med MTA1 antistoffer. β-actin var en loading kontrol. Pterostilbene har den højeste potens til at hæmme MTA1. B. dosisafhængige virkninger af Res /analoger på MTA1 protein niveauer i LNCaP; i DU145 (C) og i PC3M (D) celler. (I) celler blev behandlet med 5-100 uM Res /analoger i 24 timer og analyseret ved immunoblotting. (Ii) grafisk gengivelse af resultater. Den Ctrl er indstillet til 1, og ændringer MTA1 niveau udtrykkes som en procentdel af Ctrl. Organerne ± SE for fire uafhængige forsøg er vist. • p 0,05, # p 0,01, * p 0,001. (Iii) effektive doser (ED

50) blev beregnet ved Chou-Martin-metoden.

DU145-EV og DU145-MTA1shRNA celler (Fig. S1) blev behandlet med 50 uM Res eller PTER i 24 timer og analyseret for MTA1, p53, Ac-p53 ved Western blot som beskrevet i “Materialer og metoder”. En repræsentativ blot er vist. Kvantificering af Ac-p53 /p53-forholdet blev udført af Image J software og data vist som gennemsnit ± SEM fra tre uafhængige forsøg

Virkninger af Resveratrol og Pterostilbene på ortotopisk tumorvækst, Progression og metastase:. Involvering af MTA1

Vi har tidligere vist, at endogene niveauer af MTA1 fremme tumorudvikling i en subkutan model af PCa [19]. Men rollen som MTA1 i PCa vækst, progression og metastase er fortsat ukendt, og virkningerne af resveratrol og PTER er ikke blevet evalueret i ortotopisk PCA-modeller. For at sammenligne

in vivo

effekten af ​​resveratrol og PTER og studere rolle MTA1 i prostata tumorvækst og progression, vi udnyttet klinisk relevant ortotopisk musemodel, hvor humane PCA celler, der udtrykker eller tavshed for MTA1 kan vokse i et miljø relateret til deres vævsoprindelse. Målet med dette forsøg var tre formål: 1) at evaluere virkningen i resveratrol og PTER inhibering orthotopisk PCa vækst og progression; 2) for at vurdere, hvilken rolle MTA1 i prostata tumor udvikling, progression og metastase, og 3) at afgøre, om MTA1 påvirker modtagelighed af primær prostata tumor og metastase til resveratrol og PTER.

For at undersøge MTA1-afhængige virkninger, vi udnyttet vores tidligere beskrevne og karakteriseret DU145-celler transduceret med lentivirus bære EV og MTA1shRNA [13], [19]. Vi mærkede disse celler med luciferase og brugte dem til ortotopisk podning (fig. 4). Forud for transplantation, validering af luciferase udtryk og MTA1 knockdown i DU145-Luc celler blev udført ved hjælp af bioluminescensanalysen

in vitro

og Western blot, henholdsvis (fig. S1). Ved kirurgi blev mus injiceret i prostata med EV-Luc og MTA1shRNA-Luc celler. For at sikre specifik respons på MTA1-knockdown og behandling med forbindelser, vi tillod tumorer at kolonisere og udvikle i 14 dage forud for randomisering. Tumor udvikling blev overvåget af BL imaging ugentligt. Mus, der udviklede tumorer (12/16 EV gruppe og 15/16 MTA1shRNA gruppe) blev randomiseret af størrelsen af ​​billeder i tre undergrupper og behandlet med vehikelkontrol (10% DMSO), resveratrol eller PTER, ip, på samme 50 mg /kg /dag dosis. Pterostilbene dosis blev holdt identisk med resveratrol er at bestemme styrken forskelle. Mens vehikelbehandlede mus viste hurtig tumorprogression i EV-xenotransplantater, resveratrol og PTER forårsagede mærkbar forsinkelse af tumorvækst (fig. 4A og B). Resveratrol, men mere så PTER, viste tumor inhiberende virkninger, selv om statistisk signifikans ikke blev opnået på grund af lille antal mus. Xenografter udtrykker MTA1shRNA udstillet markant reduceret tumorvækst ved uge 5 efter transplantation med marginal betydning versus EV-Ctrl (p = 0,05). Endvidere MTA1-knockdown tumorer behandlet med forbindelser havde yderligere reaktion, og forskellene versus EV-Ctrl blev stærkt signifikant (p = 0,001 for resveratrol, p = 0,0004 for PTER). Derfor MTA1-knockdown sensibiliserede celler til resveratrol og især til PTER. Overensstemmelse med de potente antitumorvirkninger, resveratrol- og PTER-behandlede tumorer viste reduceret mitotisk aktivitet sammenlignet med vehikelbehandlede EV-tumorer som vist ved Ki-67 IHC (fig. 5A). Vigtigt er det, i overensstemmelse med reduceret MTA1 aktivitet i tumorer, nedstrøms acetyl-mål for MTA1, Ac-p53, havde signifikant øget niveauer upon behandlinger, bedst set med PTER (fig. 5B). Følgelig M30-farvning afslørede en stor stigning i apoptose i tumorer fra EV sammensatte-behandlede mus og MTA1-knockdown gruppe (fig. 5C). Derudover mikrokar område, som vurderet af CD31 immunfarvning, faldt med ~59% i EV-sammensatte behandlede tumorer og ~67% i MTA1-knockdown gruppe sammenlignet med EV-Ctrl (fig. 5D).

Male nøgne mus blev injiceret orthotopisk med DU145-EV-Luc (EV) eller DU145-MTA1shRNA-Luc (MTA1shRNA) celler og behandlet med vehikel (Ctrl), Res eller PTER, 50 mg /kg /dag, hver dag, ip A. Normaliseret repræsentant BL billeder af mus fra hver gruppe er vist. B,

venstre

, Kvantitativ analyse af tumor lysudsendelse i alt Flux (fotoner /sek /cm2 /sr) er afsat mod tiden. Organerne ± SE er vist (n = 6 i starten), * p = 0,05.

Right

, log tendenser for hver gruppe er vist. Signifikant væksthæmning blev påvist i Everio vs. MTA1shRNA-tumorer som grupper, ** p 0,01 og mellem EV-Ctrl vs. MTA1shRNA-Res og MTA1shRNA-PTER, *** p. 0,001

Venstre,

repræsentant IHC billeder af A. Ki-67 (spredning); B. Ac-p53 /p53 (MTA1 signalering); C. M30 (apoptose); og D. CD31 (angiogenese) i Everio og MTA1shRNA-tumorer er vist.

Right,

kvantificering af positivt farvede celler i procent af totale celler. Dataene er box plots af tilfældigt udvalgte fem felter analyseret uafhængigt af to efterforskere. Parvise sammenligninger, * p 0,05; ** P 0,01; *** P 0,001 vs. EV-Ctrl;

# p 0,05 og

## p 0,001 vs. MTA1shRNA-Ctrl; + P 0,05 og ++ p. 0,001, af forbindelser mellem EV og MTA1shRNA grupper

Få prækliniske PCa xenograftmodeller fremskridt metastase, hvilket gør det svært at studere den funktionelle betydning af MTA1 i metastaser. Vores tidligere studie med LNCaP-Luc-celler viste ingen metastaser når orthotopisk injiceret i mus (upublicerede data). På grund af den mere aggressive fænotype af DU145 celler, overvejede vi muligheden af ​​spontan metastase i ortotopisk DU145 xenotransplantater. I begyndelsen af ​​ugen 7, vi har registreret BL signaler adskilt fra den primære kilde (prostata) i sham EV-Ctrl-gruppen (fig. 4A og 6A).

Ex vivo

BL billeder af metastaser blev påvist ved obduktion i lever, nyrer og lunger /hjerte, og histologi blev bekræftet af en certificeret patolog (JRL) (fig. 6B). Den højeste forekomst af metastaser blev observeret i EV (100%), hvorimod MTA1shRNA gruppen viste kun 50-75% og med høj grad af heterogenitet (fig. 6C). Omfattende macrometastases i alle organer observeret i EV-Ctrl blev hæmmet af resveratrol og PTER. MTA1-knockdown tumorer udvikles mindre metastaser, og i færre organer. Især MTA1shRNA tumorer behandlet med forbindelser enten ikke udvikle nogen nyre metastase eller havde små læsioner i en nyre (fig. 6D). Hæmning af metastase som reaktion på MTA1 målretning agenter og MTA1 lyddæmpning indikerer MTA1 bidrag til den lokale invasion, formidling og metastase. Sammen antyder disse data, at MTA1 signalering spiller en væsentlig rolle i udviklingen og progressionen af ​​metastatisk prostatacancer, og at målrette MTA1 vej med kosten polyphenoler kan være effektiv bremse tumor progression og forhindre metastaser.

A. BL billeder af metastaser er vist. Signaler detekteres efter prostata fjernelse bestod af metastatiske og ikke-specifikke signaler. Fjernelse af hud og muskler fjernet ikke-specificitet. B.

Top, ex vivo

billeder af metastatiske organer.

Bund,

Validering af metastatiske læsioner (T) i nyrerne (K), lever (Li) og lunge /hjerte (L /H) af H 0,05; ** P 0,01; *** P 0,001 er parvise sammenligninger vs EV-Ctrl. D, kvantitativ analyse af orgel-specifikke metastase beregnet ved luciferase signaler som Total Flux (fotoner /sek /cm

2 /sr). Farvekodede histogrammer af signaler for hver gruppe er vist. PTER var mere effektive til at hæmme metastaser i alle organer i forhold til Res i EV-gruppe.