PLoS ONE: overudtrykt MicroRNA-182 Fremmer spredning og invasion i Prostata Cancer PC-3 celler ved nedregulere N-myc Downstream Reguleret Gene 1 (NDRG1)

Abstrakt

MikroRNA’er, ikke-kodende 20- 22 nukleotid enkeltstrengede RNA, resultere i translationel undertrykkelse eller nedbrydning og gendæmpning af deres målgener, og bidrage væsentligt til reguleringen af ​​genekspression. I den aktuelle undersøgelse rapporterer vi, at MIR-182-ekspression blev signifikant opreguleret i prostatakræft væv og fire cellelinjer, sammenlignet med benign prostatahyperplasi væv og normal prostataepitelcellelinie (RWPE-1) celler. Ektopisk overekspression af miR-182 fremmer betydeligt spredning, øger invasionen, fremmer G1 /S cellecyklus overgang og reducerer tidlig apotosis af PC-3 celler, mens undertrykkelse af miR-182 faldt spredning og invasion, hæmmer G1 /S cellecyklus overgang og forøgelse tidlig apotosis af PC-3-celler. Derudover viste vi, at miR-182 kunne nedregulere ekspressionen af ​​NDRG1 ved direkte rettet mod NDRG1 3′-utranslateret region. Som konklusion tyder vore resultater, at MIR-182 spiller en vigtig rolle i proliferationen af ​​humane prostatacancerceller ved direkte undertrykke tumoren supressor genet NDRG1. Vi afdækkede en ny epigenetisk regulering af NDRG1

Henvisning:. Liu R, Li J, Teng Z, Zhang Z, Xu Y (2013) overudtrykt MicroRNA-182 Fremmer spredning og invasion i Prostata Cancer PC-3 celler ved Down-Regulering N-myc Downstream Reguleret Gene 1 (NDRG1). PLoS ONE 8 (7): e68982. doi: 10,1371 /journal.pone.0068982

Redaktør: Daotai Nie, Southern Illinois University School of Medicine, USA

Modtaget: April 7, 2013; Accepteret: 8 Juni 2013; Udgivet: den 16. juli, 2013 |

Copyright: © 2013 Liu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra National Natural Science Foundation of China (No: 30.800.226), Tianjin Municipal Videnskab og Teknologi Kommissionen (No: 12ZCDZSY17200) og den anden Hospital i Tianjin Medical University (No: Y1003). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Prostatakræft (PCA) fortsætter med at være en af ​​de største sundhedsproblemer for den aldrende mandlige, med en anslået 238,590 nye tilfælde og 29,720 kræftrelaterede dødsfald forventes i 2013 alene i USA [1]. Selvom kinesiske mænd tilhører gruppe lav risiko for at få PCa, har forekomsten og dødeligheden steget betydeligt på grund af befolkningens aldring, ændringer i livsstil og andre årsager. PCa er blevet en af ​​de mest almindelige maligne sygdomme hos mænd over hele verden, med stærkt varierende satser for tumor progression og reaktioner på behandling. Hvis tumor er begrænset til prostata, kan patienter behandles ved kirurgisk fjernelse af tumoren eller ved stråling, med høj effektivitet. Derimod terapi for unconfined tumorer er stadig et stort problem. Standard behandling for disse patienter er antiandrogener at opnå total androgen blokade [2]. Desværre, at tumorer fremskridt og dermed omgå behandling er en meget hyppig begivenhed, og der er ingen effektive behandlinger for kastration resistente PCa (CRPC) patienter, selvom urolog prøver at bruge kemoterapeutika. Selv om både genetiske og miljømæssige faktorer anses for at være vigtige faktorer, de molekylære mekanismer i PCa udvikling og progression stort set unknown.Therefore, bedre forståelse af patogenesen af ​​PCa og udforske nye interven- mål for PCa er hårdt krævende opgaver.

MikroRNA’er (miRNA) er en gruppe af små (ca. 20-22 nukleotider) endogene ikke-kodende RNA. Modne miRNA negativt regulere deres målgener gennem ufuldkommen komplementære sekvens parring til den 3 ‘utranslaterede region (UTR) af målgener resulterer i enten mRNA nedbrydning eller translationel undertrykkelse. Talrige undersøgelser har vist, at afvigende ekspression af miRNA er tæt forbundet med proliferation, invasion, metastase og prognosen af ​​forskellige kræftformer, herunder PCa, brystcancer, gliom og lungekræft [3] – [6]. PCa progression er forbundet med ændret ekspression af multiple onkogener og tumor suppressorer, og miRNA kan potentielt regulerer disse gener; imidlertid har forholdet mellem miRNA og PCa begyndte først at blive belyst i de senere år [7]. Mere end 50 miRNA rapporteres at være involveret i PCa; De fleste af de aktuelle data tyder på, at kun et lille antal af disse vedrører patogenesen af ​​PCa [8]. . Flere miRNA bør udvælges og undersøges for bedre at forstå progression af PCa

Hidtil mange artikler undersøgte miRNA ekspression i PCA prøver imidlertid resultaterne var meget inkonsekvent [9] – [15]. Ingen detektion resultater miRNA microarray blev rapporteret fra kinesiske PCA prøver hidtil. I den aktuelle undersøgelse, vi først screenet de miRNA relateret til PCa af miRNA microarrays, og ifølge de foreløbige resultater, vi fandt, at microRNA-182 (MIR-182) blev overudtrykt i PCA væv. Undersøgelser viste, at miR-182 kunne fremme melanom metastase ved at undertrykke FOXO3 og microphthalmia-associeret transkriptionsfaktor [16], i mellemtiden, blev miR-183-96-182 klynge overudtrykt i prostata væv og kunne regulere Zink homeostase i prostata celler [17]. MIR-182 blev anset for at være en vigtig oncomiR. Imidlertid kunne MIR-182 suppresse lunge tumorigenese gennem nedregulering af RGS17 ekspression in vitro [18]. Desuden viste en ny undersøgelse, at miR-182 og microRNA-200a kunne styre G-protein-subunit alfa-13 (GNA13) udtryk og celleinvasion synergistisk i PCA celler [19]. Disse inkonsistente resultater viser, at funktionen af ​​MIR-182 er kompleks og er behov for yderligere undersøgelse. I denne undersøgelse har vi vist, at MIR-182 fremmet PCa PC-3-celler proliferation og invasion ved direkte målretning 3′-UTR af N-myc nedstrøms reguleret gen 1 (NDRG1, NM_006096.3) mRNA. Vores resultater tyder på, at miR-182 kan spille en vigtig rolle i udviklingen og progressionen af ​​PCa.

Materialer og metoder

Etik Statement

Undersøgelsen blev godkendt af den etiske bestyrelse af Anden Hospital i Tianjin Medical University. Alle prøver blev opnået fra patienter, som har underskrevet informeret samtykke om godkendelse af brugen af ​​deres væv til forskningsformål efter drift.

Prostata vævsprøver

Fem PCA væv blev opsamlet efter radikal prostatektomi på afdelingen of Urology af hospitalet mellem januar 2010 og december 2012. Ingen af ​​patienterne havde fået neoadjuverende hormonbehandling før operationen. Tre benign prostatahyperplasi (BPH) væv blev opsamlet efter suprapubisk enucleation af prostata. Friske prostatavæv blev udtaget direkte efter kirurgisk fjernelse af gland.These prøver blev straks nedfrosset i flydende nitrogen og anvendes til miRNA microarray eksperimenter. En diagnostisk H . E sektion var parat til at verificere tumor indhold og eneste tilfælde med mere end 90% tumorvæv blev anset for yderligere analyse

miRNA microarray analyse

Mirna isolation kits (Ambion) var anvendes til at isolere total RNA med beriget miRNA fra prostata vævsprøver. Microarray assay blev udført under anvendelse af en tjenesteudbyder (LC Sciences, Houston, TX, https://www.lcsciences.com) som beskrevet tidligere [20]. Dem med fold forandringer 2 eller -2 og P-værdier 0,05 (t-test) blev betragtet som differentielt udtrykte miRNA. Real-time RT-PCR blev anvendt til bekræftelse af nogle differentielt udtrykte miRNA.

Cell Kultur

Menneskelig PCA cellelinjer LNCaP, PC-3, DU145, 22Rv1 og normal prostata epitelial cellelinje RWPE-1 blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA) og holdt i vores laboratorium. Celler blev dyrket i RPMI-1640 (Gibco) suppleret med 10% føtalt-kalv-serum og penicillin (100 U /ml). Kulturer blev opretholdt under en atmosfære indeholdende 5% CO

2.

Total RNA Extraction og Real-time RT-PCR

Samlet RNA blev ekstraheret ved anvendelse Trizol Reagent (Invitrogen, CA, USA ). cDNA blev syntetiseret under anvendelse af M-MLV MicroRNA Reverse Transcription Kit (Promega, USA). Real-time RT-PCR blev udført med SYBR® Premix Ex Taq ™ (Takara, Biotech Co., Ltd, Dalian, Kina). RT primer for miR-182 var 5’GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTGCACTGGATACGACAGTGTGA -3 “, PCR primer for miR-182 var 5′-TGCGGTTTGGCAATGGTAGAAC-3 ‘(fremad), 5′-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3’ (tilbage). Udtrykket niveau var normaliseret til U6. RT primer til U6 var 5’GTCGTATCCA GTGCAGGGTCCGAGG TGCACTGGATACGACAAAAT ATGG -3 “, PCR primer for U6 var 5’TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAGC -3« (fremad), 5’CCAGTGCAGGGTCCGAGGT -3 «(tilbage). PCR blev udført under følgende betingelser: 94 ° C i 4 min, efterfulgt af 40 cykler ved 94 ° C i 30 s, 50 ° C i 30 s og 72 ° C i 40 s. Hver prøve blev kørt tredobbelt.

Western Blotting

Western blotting blev udført for at bestemme NDRG-1-protein-ekspression. Alle proteiner blev opløst på en 8% SDS-denatureret polyacrylamidgel og blev derefter overført til en nitrocellulosemembran. Membraner blev inkuberet med blokeringsbuffer i 90 minutter ved stuetemperatur og derefter inkuberet med et antistof mod NDRG-1 eller beta-tubulin med Blotto natten over ved 4 ° C. Membranerne blev vasket og inkuberet med et peberrodsperoxidase (HRP) -konjugeret sekundært antistof. Proteinekspression blev vurderet ved forøget kemiluminescens og udsættelse for kemiluminescerende film. Den Labworks indsamling og analyse billede software (UVP, LLC) blev anvendt til at kvantificere båndintensiteter. Alle antistoffer blev indkøbt fra Saier Biotechnology (Tianjin, Kina).

celletransfektion

Transfektioner blev udført under anvendelse af Lipofectamine 2000 (Invitrogen, CA, USA) ifølge producentens protokol. Kort fortalt blev PC-3-celler udpladet i seks-brønds plader og dyrket uden antibiotika til 60-80% konfluens. Hver godt modtaget 10 pi Lipofectamine reagens og 50 pmol af syntetiske miR-182 efterligner (GenePharma Co, Ltd, Shanghai, Kina), syntetiske negative kontrol miRNA (MIR-182 efterligner-NC), syntetisk miR-182-inhibitor sekvens eller syntetisk mIR-182-inhibitor negativ kontrol (mIR-182-inhibitor-NC). Sekvenser af MIR-182 efterligner blev MIR-182 efterligner-NC, MIR-182-inhibitor og MIR-182-inhibitor-NC vist i tabel 1. Alle efterligner og inhibitorer blev mærket med FAM (carboxyfluorescein). Seks timer efter transfektion PC-3-celler blev observeret under anvendelse fluorescensmikroskop og serumfrit medium blev ændret til komplet medium.

MTT assay

PC-3-celler transficeret med enten miR- 182 efterligner eller mIR-182 efterligner-NC eller mIR-182-inhibitor og mIR-182-inhibitor-NC blev udpladet på 96-brønds plader med 1 x 10

4 celler /brønd. Levedygtige celler blev målt 1, 2, 3, 4, og 5 dage efter udpladning. Efter inkubering med 3- (4, 5- dimethylthiazolyl-2) -2, 5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) blev cellerne lyseret i 150 ml 100% dimethylsulfoxid (DMSO) og UV-synlig absorbans blev aflæst ved 490 nm ved anvendelse af 96-brønds plade-læser. Hver prøve blev kørt i tre eksemplarer.

Cell Cycle Analysis

PC-3-celler transficeret med enten miR-182 efterligner eller miR-182 efterligner-NC eller miR-182-hæmmer og miR- 182 inhibitor-NC blev høstet 72 timer efter transfektion vaskes med koldt phosphatbufret saltvand (PBS) og fikseret i 1 ml 70% ethanol. Efter inkubation natten over ved 4 ° C i ethanol blev celler vasket i PBS og suspenderet i 500 ml propidine iodid (PI) 30 min før flowcytometri. Populationer i G0-G1, S og G2-M-fasen blev målt ved flowcytometri (BD Biosciences, USA), og dataene blev analyseret ved hjælp Multicycle-DNA Cell Cycle Analyseret software til billedtelefoni.Sættet måling blev udført tre gange.

Påvisning af Cell Tidlige Apoptose

PC-3-celler transficeret med enten mIR-182 efterligner eller mIR-182 efterligner-NC eller mIR-182-inhibitor og mIR-182-inhibitor-NC blev opsamlet og fikseret med 70% ethanol til påvisning af tidlig apoptose. Farvning af celler blev udført i henhold til instruktionerne af Annexin V-R-PE-celle apoptose afsløring kit (SouthernBiotech, USA). Flowcytometri (BD Biosciences, USA) blev anvendt til at detektere andelen af ​​tidlig apoptose. Målingen blev udført tre gange.

Transwell Cell Invasion Assay

PC-3-celler transficeret med enten miR-182 efterligner eller miR-182 efterligner-NC eller miR-182-hæmmer og miR -182 inhibitor-NC blev opsamlet. 5 × 10

4 PC-3-celler blev anbragt på det øvre kammer af hver indsats belagt med 50 pi 2 mg /ml Matrigel (vækstfaktor reduceret BD MatrigelTM matrix), og 600μl RPMI 1640 med 20% FBS blev tilsat til den nedre del af kammeret. Efter inkubation i 24 timer blev kamrene adskilles, og membranerne blev farvet med en 2% krystalviolet opløsning i 15 minutter og anbragt på en glasplade. Derefter blev celler, der var migreret over membranen talt i fem tilfældige visuelle felter ved brug af et lysmikroskop. Alle analyser blev udført tre uafhængige gange i tre eksemplarer.

miRNA Mål Forudsigelse

De formodede miRNA mål blev forudsagt ved hjælp af Targetscan (https://www.targetscan.org/vert_50/), miRBase (https://www.mirbase.org/index.shtml), og PicTar (http: //pictar.mdc – berlin.de/). algoritmer

Plasmid Construction

PmirGLO- Dual-luciferase reporter vektoren (7350 bp, Promega, Madison, WI, USA) blev anvendt til at bekræfte funktionen af ​​det formodede mIR-182 bindingssted i NDRG1 3′-UTR. Ifølge den potentielle MIR-182 bindende sekvens af NDRG1 3′-UTR, en dobbelt – var strandet sekvens opnået ved annealing anvendelse af to enkelt-strenge NDRG1-Top, (Nhel) 5′-CTAGCTAGCGGCCGCTAGT CCTC AGAGAC ACCAAACTGCCAAAAG- 3 ‘; NDRG1-Bot (Sall) 5’-TCGACTTTTGGCA GTTTGGTGTC TCTGAGG ACTAGCGGCCGCTAG- 3 ‘, og derefter klonet ind i NheI /Sall-stederne i pmirGLO-Dual-luciferase reporter vektor. Annealing blev udført som: 95 ° C i 5 min og stuetemperatur i 2 timer. Den rekonstruerede plasmid blev bekræftet ved restriktionsendonukleasespaltning og sekventering, og blev opkaldt pmirGLO /NDRG1-UTR.

Dual luciferasereportergen Assay

PC-3 celler blev inddelt i fem grupper efter forskellige transfektion indhold: a: (blank) pmirGLO /NDRG1-UTR; b: pmirGLO /NDRG1-UTR + MIR-182-inhibitor-NC; c: pmirGLO /NDRG1-UTR + MIR-182-inhibitor; d: pmirGLO /NDRG1-UTR + MIR-182 efterligner-NC; e: pmirGLO /NDRG1-UTR + MIR-182 efterligner. PC-3-celler blev podet tredobbelt i 96-brønds plader, fik lov at bundfælde i 24 timer og derefter co-transficeret med forskelligt indhold ved hjælp af Lipofectamine 2000 (Invitrogen, CA, USA). Luciferase og Renilla-aktivitet blev målt 48 timer efter transfektion under anvendelse af Dual LuciferaseReporter Assay Kit (Promega) ifølge producentens instruktioner. Tre uafhængige forsøg blev udført, og dataene er vist som middelværdi ± SD. Luciferaseaktivitet værdier normaliseret til Renilla aktivitet som relativ lys enhed (RLU)

Statistisk analyse

De to-tailed t-test blev anvendt til at vurdere betydningen af ​​forskellene mellem to grupper.;

P

værdier. 0,05 blev betragtet som signifikante

Resultater

MIR-182 blev opreguleret i PCA væv

Efter primær miRNA microarray analyse, i PCA væv fem miRNA (miR-345, mir-145, miR-221, miR-27b og miR-378) blev nedreguleret og toogtyve miRNA var opreguleret (Figur 1). MIR-182 var opreguleret med fold ændring på 6,14 og yderligere bekræftet af real-time RT-PCR med fold ændring på 5,70. Som den mest betydelige differentielt udtrykte miRNA mellem PCA og BPH væv, blev miR-182 valgt til yderligere undersøgelse. Alle differentielt udtrykte miRNA blev set i tabel S1.

I PCA væv blev fem miRNA nedreguleret og toogtyve miRNA blev opreguleret. miRNA-182 blev opreguleret med fold ændring på 3,07 og yderligere bekræftet af real-time RT-PCR med fold ændring på 2,85.

MIR-182 blev opreguleret i PCA cellelinier

Real-time RT-PCR-analyse afslørede, at mIR-182-ekspression blev markant forøget i fire fælles PCA testede cellelinjer (PC-3, DU145, 22Rv1 og LNCaP), sammenlignet med den normale prostata epitelial RWPE-1-celle, hvilket indikerer, at miR -182 opreguleres i PCA-cellelinier og PC-3 har det højeste ekspressionsniveau (figur 2). Derefter blev PC-3-celler udvalgt til yderligere undersøgelse.

Real-time RT-PCR viser, at den relative ekspression niveauet af PC-3-celler er den højeste i fire prostatacancercellelinjer og RWPE-1 har den laveste ekspressionsniveau. Værdier repræsenterer midler fra tre separate forsøg og fejl søjler repræsenterer SD.

MIR-182 Expression Level er ændret væsentligt efter transfektion med Efterligner eller inhibitorer

MIR-182 ekspressionsniveauet blev påvist af real-time RT-PCR efter transfektion med efterligner eller inhibitorer i PC-3 celler. Resultaterne viste, at efterligner eller inhibitorer effektivt blev transficeret (figur 3) og ekspressionsniveauet er højest i MIR-182 efterligner gruppe og mindst i MIR-182 inhibitor gruppe (figur 4). Disse resultater viste, at disse mimetika eller inhibitorer kan efterligne eller inhibere MIR-182 effektivt.

Resultater viser, at transfektion sats er mere end 80%. Repræsentative billeder og tilfældigt udvalgte felter er vist.

Blank gaver blindprøvekontrollen. Resultaterne viser, at ekspressionsniveauet er højest i MIR-182 efterligner gruppe og mindst i MIR-182 inhibitor gruppe. Værdier repræsenterer midler fra tre separate forsøg og fejl søjler repræsenterer SD.

Overekspression af miR-182 Fremmer spredning i PC-3 Celler

For at undersøge funktionen af ​​miR- 182 i PCa, vi transficeret miR-182 efterligner eller inhibitros i PC-3 PCA celler og målte celledeling. Ved hjælp af MTT-analyser, vi observeret, at vækstraten for miR-182 overekspression celler dramatisk blev øget, sammenlignet med miR-182 efterligner -NC-transficerede celler (

P

0,05). Tværtimod efter nedregulering af miR-182 med et inhiobitor, at vækstraten for PC-3 celler blev dramatisk faldt sammenlignet med miR-182 hæmmer -NC-transfekterede celler (

P

0,05) (Figur 5). Disse resultater viste, at opregulering af miR-182 fremmer udbredelsen af ​​PC-3 celler.

Blank gaver blindprøvekontrollen. UV-synlig absorbans blev målt ved 490 nm. Den relative absorbans var signifikant forskellig 3 dage efter transfektion (

P

0,05). Værdier repræsenterer midler fra tre separate forsøg.

Overekspression af miR-182 Fremmer G1 /S Cell Cycle Transition i PC-3 Celler

Vi undersøgt yderligere effekten af ​​miR-182 på proliferation under anvendelse af flowcytometri. MIR-182-overekspression PC-3-celler havde en signifikant lavere procentdel af celler i G0 /G1-fasen og forøget procentdelen af ​​celler i S-fasen, i forhold til MIR-182 efterligner-NC-transficerede celler. Tværtimod efter nedregulering af MIR-182 ved en inhiobitor, PC-3-celler havde en signifikant højere procentdel af celler i G0 /G1-fasen og faldt procentdelen af ​​celler i S-fasen, i forhold til MIR-182 inhibitor-NC- transficerede celler (figur 6). Disse data antydede, at overekspression af miR-182 kunne fremme G1 /S cellecyklus overgang, og kan derfor, øge udbredelsen af ​​PC-3 celler.

Blank gaver blindprøvekontrollen. Værdier repræsenterer middelværdier fra tre separate forsøg og fejlsøjler repræsenterer SD. (*

P

0,05).

Overekspression af miR-182 Reducerer Tidlig apotosis af pc-3 Cells

For at undersøge den mulige regulerende inddragelse af miR -182, tidlig apoptose af PC-3-celler blev påvist efter transfektion. Resultaterne viste, at tidlig apoptose på MIR-182 overudtrykker celler dramatisk faldt sammenlignet med MIR-182 efterligner-NC-transficerede celler. Tværtimod efter nedregulering af MIR-182 ved en inhiobitor, den tidlige apoptose på PC-3-celler blev dramatisk forøget sammenlignet med MIR-182-inhibitor-NC-transficerede celler (figur 7). Disse resultater viste, at opregulering af miR-182 reducerer tidlig apoptose af PC-3 celler.

Blank gaver blindprøvekontrollen. Resultaterne viser, at den tidlige apoptose sats er lavest i miR-182 efterligner gruppe og højest i miR-182-hæmmer gruppe (*

P

0,05, **

P

0,01) . Repræsentative billeder blev vist og tidlige apoptose celler blev angivet ved Q4 (LR) område.

Overekspression af miR-182 Øger Invasion i PC-3 Cells

Overekspression af miR-182 signifikant forøgede invasive potentiale PC-3-celler ved transfektion med mIR-182 efterligner sammenlignet med kontrolceller i Transwell assay med Matrigel, og celler transficeret med mIR-182-inhibitor resulterede i en signifikant decresed invasiv potentiale (figur 8). Disse data antyder, at MIR-182 øger invasion i PC-3-celler

in vitro

.

Invasion assays blev udført med PC-3-celler transficeret med MIR-182 efterligner eller inhibitorer. Blank præsenterer blindprøvekontrollen. Repræsentative billeder og tilfældigt udvalgte felter er vist (*

P

0,05, **

P

0,01).

Identifikation af miR-182 Binding steder i NDRG1 3′-UTR Region

Efter forudsigelse med online miRNA Mål værktøjer, mange formodede gener blev forudsagt. Gener relateret med celleproliferation, apoptose, invasion og metastase blev udvalgt, herunder NDRG1. Endvidere fandt vi, at NDRG1 var en metastase supressor gen [21] – [25] eller tumorsuppressorgen [26], og NDRG1 var nødvendigt for p53-afhængig apoptose [27]. Vores undersøgelse viste også, at NDRG1 blev nedreguleret i PCA væv og PC-3-celler sammenlignet med BPH væv og RWPE-1-celler (data ikke vist). Endelig blev NDRG1 udvalgt til yderligere undersøgelse. Dernæst fandt vi, at NDRG1 3′-UTR-regionen har kun én højt konserverede MIR-182-bindingssteder (figur 9).

NDRG1 3′-UTR-regionen har kun én højt konserverede MIR-182 bindingssteder efter bioinformatik analyse.

mIR-182 Direkte Mål den Metastase supressor Gene NDRG1 i PC-3 Cells

Western blotting resultaterne viste, at overekspression af miR-182 i PC-3 celler faldt betydeligt i protein ekspressionsniveauer af NDRG1 efter transfektion med mIR-182 efterligner sammenlignet med mIR-182 efterligner -NC-transficerede celler. Tværtimod efter nedregulering af MIR-182 ved en inhiobitor proteinet ekspressionsniveauer af NDRG1was dramatisk øget i forhold til MIR-182-inhibitor-NC-transficerede celler (figur 10), hvilket indikerer, at NDRG1 er en potentiel MIR-182 målgen.

blank gaver blank kontrol. Overekspression af miR-182 faldt betydeligt protein ekspressionsniveauerne af NDRG1 og nedregulering af miR-182 dramatisk øget protein ekspressionsniveauerne af NDRG1 (*

P

0,05, **

P

0,05, **

P

0,01).

diskussion

i de seneste år har hundredvis af miRNA vist sig at spille en vigtig rolle i regulering af genekspression gennem nedbrydning af mRNA eller undertrykkelse af oversættelse i en række modelsystemer [28] – [29]. Meget tyder på, at miRNA kan fungere som en ny klasse af både tumorigene og tumor-undertrykkende gener [30]. I denne undersøgelse, vi først forberedt ti PCA prøver og ti BPH prøver dog kun fem PCA prøver og tre BPH prøver mødte screening standard af microarray test. Efter miRNA microarray analyse og real-time RT-PCR bekræftelse, vi demonstreret, at MIR-182 opreguleres i kinesiske PCA væv, sammenlignet med BPH-væv. Opreguleringen resultat af MIR-182 var i overensstemmelse med den undersøgelse, som Schaefer A et al [14]. Derefter viste vi, at MIR-182-ekspression blev markant forøget i fire fælles PCA testede cellelinjer (PC-3, DU145, 22Rv1 og LNCaP), sammenlignet med den normale prostata epitelial RWPE-1-celle, hvilket indikerer, at MIR-182 opreguleres i PCa celle linjer og PC-3 har den højeste ekspressionsniveau. Derefter blev PC-3-celler udvalgt til yderligere undersøgelse. Næste vi bevise, at miR-182 specifikt retter sig mod NDRG1 3′-UTR i PC-3 celler.

Tidligere undersøgelser afslørede, at NDRG1 var en metastase supressor gen eller tumorsuppressorgen af ​​PCa [21], [24] , [25]. Vores undersøgelse viste også, at NDRG1 blev nedreguleret i PCA væv og PC-3-celler sammenlignet med BPH væv og RWPE-1-celler (data ikke vist). Yderligere funktionelle Forsøget viste, at nedregulering af NDRG1 kunne øge proliferation og invasion af PC-3-celler, og opregulering af NDRG1 kunne mindske spredning og invasion af PC-3-celler (data ikke vist). Undersøgelser viste, at den molekylære regulering af NDRG1 invovles PTEN [21], [26], P21 [22], Wnt-β-catenin [23], at aktivere transskription faktor 3 [24], ATF3-NF kappaB kompleks [25] og p53 [27]. Men der var ingen rapport om NDRG1 reguleret af microRNA i PCa at fremme spredning klart og direkte endnu. Det er den første for os at afdække det nye forhold af regulering af NDRG1 og microRNA i PSA. Vi observerede, MIR-182 blev signifikant overudtrykt i PCA cellelinjer, sammenlignet med RWPE-1. Desuden ektopisk overekspression af miR-182 fremmer betydeligt spredning, øger invasionen, fremmer G1 /S cellecyklus overgang og reducerer tidlig apotosis af PC-3 celler, mens undertrykkelse af miR-182 faldt spredning og invasion, hæmmer G1 /S cellecyklus overgang og forøgelse tidlig apotosis af PC-3-celler. For at undersøge mekanismen for MIR-182 identificerede vi NDRG1 som et formodet MIR-182 målgen under anvendelse bioinformatisk analyse, og bekræftede, at NDRG1 er et direkte mål for MIR-182 ved dobbelt luciferasereportergen assay. Disse resultater viste, at MIR-182 øger proliferation og invasion af PCA PC-3-celler ved direkte målretning af NDRG1 3′-UTR at nedregulere NDRG1.

I de senere år har NDRG1 blevet beskrevet som en potentiel tumorsuppressor genet i forskellige humane cancere, og kan være forbundet med tumor aggressivitet og metastase [31] – [34]. Imidlertid er lyddæmpende machanism af NDRG1 er stadig ikke klar. En måde, hvorpå cancerceller stilhed tumorsuppressorgen ekspression er epigenetiske ændringer, som omfatter DNA-hypermethylering af promotor- CpG-øer og /eller ændringer i tilknytning posttranslationelle histon modifikationer fører til transkriptionel repression [35]. Initiativtageren til NDRG1 indeholder en stor CpG ø, øge muligheden, at det kunne bringes til tavshed ved DNA hypermethylering i kræft. Derfor forskere begynde at studere den epigenetiske regulering af NDRG1 nylig. Angst et al [36] undersøgelse viste, at NDRG1 ekspression kan reguleres af den farmakologiske inhibering af DNA-methylering og histondeacetylering i bugspytkirtelkræftceller. Der blev dog ikke methylering af CpG ø i NDRG1 promotor fundet i bugspytkirtelkræftceller, hvilket tyder på en indirekte mekanisme til NDRG1 de-undertrykkelse af disse behandlinger. Li og Chen [37] undersøgelse viste, at nedregulering af NDRG1 i colon cancer cellelinier SW620 og SW480 skyldtes histon modifikationer, bortset promotor hypermethylering. Chang et al [38] undersøgelse viste imidlertid, at nedsat ekspression af NDRG1 mRNA og protein i gastrisk cancer-cellelinjer og væv skyldtes methylering af NDRG1 genpromotor. Disse undersøgelser antyder, at den epigenetiske regulering af NDRG1 er forskellig i forskellige typer af cancerceller. I denne undersøgelse viste vi, at NDRG1 kunne målrettes direkte af MIR-182 og udækket en ny epigenetisk regulering af NDRG1, hvilket antyder, at opregulering af MIR-182 kan tilvejebringe en alternativ mekanisme til den reducerede ekspression af NDRG1 tumor suppressor protein i PCA-celler . der er stadig behov

yderligere forskning for at undersøge, om andre miRNA eller signalveje kan regulere NDRG1 i PCa, fordi vi ikke kunne udelukke, at der kan være andre microRNA, som ikke findes endnu, til at spille en vigtig rolle i reguleringen NDRG1 i PCa, og om miR-182 kan målrette andre medlemmer af NDRG1 familien. For eksempel ville det være interessant at vide, om andre veje er involveret i antiproliferative effekt af NDRG1 og undersøge, hvilke andre komponenter i den maligne fænotype bestemmes af NDRG1 og miRNA i PCA celler, og disse spørgsmål er i øjeblikket under yderligere efterforskning i vores laboratorium.

konklusioner

sammenfattende vigtigt resultat af den nuværende undersøgelse er, at miR-182 kan øge udbredelsen af ​​PCA-cellelinjer ved at målrette NDRG1. Disse data tyder på, at miR-182 spiller en afgørende rolle i reguleringen af ​​PCa celledeling og kan fungere som et kræftpsykologisk miRNA. MIR-182 kan sever som en ny terapeutisk mål for behandling af PSA.

Støtte oplysninger

tabel S1.

differentielt udtrykte miRNA mellem PCA og BPH væv. Fed Mirs blev nedreguleret Mirs i PCA væv

doi:. 10,1371 /journal.pone.0068982.s001

(DOC)