PLoS ONE: sphingosinkinase 2 og Ceramide Transport som centrale målsætninger for Natural Flavonoid Luteolin at inducere apoptose i tyktarmskræft Cells

Abstrakt

Anlægget flavonoid luteolin udviser forskellige biologiske virkninger, herunder kræft egenskaber. Der vides kun lidt om de molekylære mekanismer, der ligger sine handlinger i kolorektal cancer (CRC). Her undersøgte vi effekten af ​​luteolin på tyktarmskræft celler, der fokuserer på balancen mellem ceramid og sphingosin-1-fosfat (S1P), to sphingoidbase mediatorer med modsatte roller på celle skæbne. Ved hjælp af dyrkede celler, fandt vi, at fysiologiske koncentrationer af luteolin inducere højde af ceramid, efterfulgt af apoptotisk død tyktarmskræft celler, men ikke af differentierede enterocytter. Pulse undersøgelser viste, at luteolin inhiberer ceramid anabolisme til komplekse sphingolipider. Yderligere eksperimenter førte os til at vise, at luteolin inducerer en ændring af det endoplasmatiske reticulum (ER) -Golgi strøm af ceramid, afgørende for dets metaboliske behandling til komplekse sphingolipider. Vi rapporterer, at luteolin virker ved at hæmme både Akt aktivering og sphingosinkinase (SphK) 2, med den deraf følgende reduktion af S1P, en Akt stimulator. S1P administration beskyttet colon cancerceller fra luteolin-induceret apoptose, sandsynligvis ved en intracellulær, receptor-uafhængig mekanisme. Samlet denne undersøgelse afslører for første gang, at kosten flavonoid luteolin udøver toksiske virkninger på tyktarmskræft celler ved at hæmme både S1P biosyntese og ceramid trafik, tyder på kosten introduktion /tilskud som en potentiel strategi til forbedring af eksisterende behandlinger i CRC.

Henvisning: Abdel Hadi L, Di Vito C, Marfia G, Ferraretto A, Tringali C, Viani P, et al. (2015) sphingosinkinase 2 og Ceramide Transport som centrale målsætninger for Natural Flavonoid Luteolin at inducere apoptose i Colon Cancer Cells. PLoS ONE 10 (11): e0143384. doi: 10,1371 /journal.pone.0143384

Redaktør: Ashley Cowart, Medical University of South Carolina, USA

Modtaget: 15 juli, 2015; Accepteret: November 4, 2015; Udgivet: November 18, 2015

Copyright: © 2015 Abdel Hadi et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden papiret

finansiering:.. forfatterne har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

CRC er en af ​​de mest almindelige neoplasi og en førende dødsårsag på verdensplan. Denne kræft blev anerkendt som, og er stadig, en miljømæssig kræft, forekomsten øges parallelt med den økonomiske udvikling, med de fleste tilfælde, der opstår i de industrialiserede lande, og kan primært henføres til kosten [1, 2]. Talrige undersøgelser har knyttet rigelig indtagelse af fødevarer fra vegetabilske oprindelse med nedsat risiko for at udvikle forskellige kræftformer, en kemo-forebyggende effekt, der er relateret til det høje indhold af flere fytokemikalier med potente anticancer egenskaber [3], herunder forbindelser til flavonoiderne [4 , 5]. En af de mest almindelige komponent af denne familie er luteolin (3 ‘, 4’, 5,7-tetrahydroxyflavone), som er til stede i høje niveauer i fælles frugt, grøntsager og urter, og udviser et bredt spektrum af virkninger, herunder anticancer aktiviteter [6, 7]. Luteolin anti-kræftfremkaldende egenskaber ekspandere over et bredt område af maligniteter og er knyttet til flere virkninger, såsom inhibering af celleproliferation, angiogenese, metastase, induktion af apoptose og sensibilisering over for kemoterapi [6, 7]. Uanset, de molekylære mekanismer bag luteolin handlinger og især dem, der vedrører dens kemoterapeutiske potentiale, stort set uklar.

I forskellige tumorceller, ceramid, nøglen mellemprodukt sphingolipid stofskifte, har vist sig at virke som cellulære mægler af flere anticancerforbindelser, at kunne regulere forskellige signalveje, og fører til standsning af cellecyklus og apoptose [8, 9]. Adskillige enzymer i forskellige subcellulære steder er involveret i kontrollen af ​​ceramid niveau [10]. De pro-apoptotiske og tumor-undertrykkende virkninger af ceramid antagoniseres af S1P, en pro-mitogen og overlevelsesfaktor for en række celletyper [11-13]. S1P stofskifte er direkte knyttet til den for ceramid, dets biosyntese kræver sphingosin, stammer fra ceramid hydrolyse, og SphKs (isoform SphK1 eller SphK2). S1P udviser både intracellulære og ekstracellulære aktioner, primært gennem aktivering af pro-mitogen og pro-overlevelse signalering [11, 14]. Den korrekte regulering af sphingolipid rheostat, der er balancen mellem S1P og ceramid, er afgørende for cellulær homeostase, og spiller en fundamental rolle i reguleringen af ​​celle egenskaber og skæbne [11, 13].

ceramidniveauer har været rapporteret at blive reduceret betydeligt i CRC sammenlignet med normal colon væv [15], og flere kemoterapeutika fandtes at påvirke ceramid metabolisme og fremme sin ophobning i colon cancerceller (revideret i [16]). Desuden S1P stimulerer vækst, invasion og overlevelse af colon tumorceller [17, 18], og SphK1 og S1P lyase er op- og nedreguleres, hvilket fører til S1P akkumulering i CRC [19, 20]. Disse beviser tyder på, at ubalance af sphingolipid rheostat favorisere CRC.

På trods luteolin ser lovende ud som kemoterapeutisk i nogle kræftceller [7], lidt er kendt på den rolle sphingolipid rheostat på sine handlinger, og især i CRC. Den foreliggende undersøgelse er designet til at undersøge den potentielle rolle for både ceramid og S1P i luteolin cytotoksicitet i CRC. Brug human Caco-2 celler som CRC model, vores undersøgelse afslører for første gang sphingolipid rheostat som et mål for luteolin cytotoksiske virkninger.

Materialer og metoder

Materialer

Alle reagenser var af højeste tilgængelige analytisk kvalitet. Eagles minimale essentielle medium (EMEM), brefeldin A (BFA), fri fedtsyre-BSA (FFA-BSA), N-acetyl-D-erythro-sphingosin (C2-Cer), N-hexanoyl-D-erythro-sphingosin ( C6-Cer), O-tricyclo [5.2.1.02,6] dec-9-yl dithiocarbonat kaliumsalt (D609), Hoechst 33342, luteolin, pertussistoksin (PTX), og almindelige kemikalier var fra Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA). S1P blev købt fra Enzo Life Sciences (Farmingdale, NY, USA), og bur S1P fra Alexis Biochemicals (Plymouth Meeting, PA, USA). Højtydende TLC (HPTLC) silicagelplader og alle opløsningsmidler var fra Merck (Darmstadt, Tyskland). Føtalt kalveserum (FCS) var fra EuroClone (Milano, Italien). LY294002, SEW2871, og W123 var fra Cayman Chemical (Ann Arbor, MI, USA), og N- (4,4-difluor-5,7-dimethyl-4-bora-3a, 4a-diaza-

s

indacen-3-pentanoy) -Sphingosin (BODIPY-C

5-Cer) fra Life Technologies (Monza, Italien).

3H-serin (30 Ci /mmol),

3H-D-erythro-sphingosin (

3H-Sph) (20,0 Ci /mmol) og D-erythro [4,5

3H] dihydrosphingosin (60,0 Ci /mmol) var fra PerkinElmer Life Sciences (Boston, MA, USA) og amerikansk Radiomærket Chemicals, Inc. (St. Louis, MO, USA).

Cell kultur

den humane coloncarcinom-cellelinie Caco-2 (BS TCL 87) blev opnået fra Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Lombardia e dell’Emilia Romagna (Brescia, Italien), og opretholdt i EMEM suppleret med 15% FCS, 2 mM L- glutamin, 1 mM natriumpyruvat, 100 ug /ml streptomycin, 100 U /ml penicillin og 0,25 ug /ml amphotericin-B ved 37 ° C i en fugtig atmosfære af 5% CO

2. Caco-2-celler blev udpladet ved 1,25 × 10

4 /cm

2, og anvendes enten coloncancercelle model (CC-celler) (ved konfluens, 3 dage efter udpladning), eller differentierede enterocytter (DES) ( 21 dage efter konfluens) [21]. Intestinal differentiering blev bekræftet ved at evaluere specifikke morfologiske træk og biokemiske markører som tidligere rapporteret [21]

Cell behandlinger

Stamopløsninger af de administrerede molekyler blev fremstillet ved at opløse dem som følger:. Luteolin, SEW2871 , W123, og anbragt i bur S1P i DMSO, C2-Cer og BFA i absolut ethanol, C6-Cer som 1: 1-kompleks med FFA-BSA, og S1P i FFA-BSA (4 mg /ml i PBS). På tidspunktet for eksperimenterne blev stamopløsninger fortyndet i frisk medium til den passende koncentration og administreres til celler. I parallelle forsøg blev celler inkuberet med fortyndede køretøjer som kontrol. Alle opløsningsmidler, ved de anvendte slutkoncentrationer, blev fundet uden virkning på hverken sphingolipid metabolisme eller celleoverlevelse. Når de anvendes, blev W123 og PTX administreret 1 time før og under behandling. Til intracellulær S1P generering blev CC-celler fyldt med bur S1P (i EMEM indeholdende 1 mg /ml FFA-BSA) ved 37 ° C i 2 timer. Mediet blev derefter fjernet, og fotolyse blev udført ved en 30-s UV puls ved 360 nm med den maksimale intensitet.

Bestemmelse af cellelevedygtighed og apoptose

Cellelevedygtighed blev bestemt ved MTT assay. Kort beskrevet efter behandling i angivne tidsrum blev mediet erstattet med MTT opløst i frisk medium (0,8 mg /ml) i 4 timer. Formazankrystallerne blev derefter solubiliseret i isopropanol /myresyre (95: 5 v /v) i 10 minutter, og absorbansen (570 nm) blev målt under anvendelse af en mikropladelæser (Wallack Multilabel Counter, Perkin Elmer, Boston, MA, USA).

at evaluere apoptose, Hoechst farvning og analyse af caspase 3 spaltning blev udført. Især blev celler dyrket på dækglas mærket med 10 pM Hoechst 33342 farvestof i 15 min ved 37 ° C, i mørke. Efter vask med PBS blev cellerne fikseret med 0,5% glutaraldehyd i PBS (10 min, 4 ° C). Den nukleare morfologi blev undersøgt ved et fluorescensmikroskop (Olympus BX-50), udstyret med en hurtig høj opløsning CCD-kamera (Colorview 12) og et billede analytisk software (Analyse fra Soft Imaging System GmbH). Caspase-3-spaltning blev vurderet ved Western blotting (se nedenfor).

ceramid kvantificering og metaboliske undersøgelser

For at vurdere ceramid indhold og sphingolipid metabolisme, blev celle sphingolipider mærket med 25 nM

3H-Sph (0,5 uCi /ml) eller 200 nM L-

3H-serin (6,0 uCi /ml) som tidligere rapporteret [22, 23], i forskellige tidsrum. Især for ceramid kvantificering, udførte vi en 6 timer impuls efterfulgt af en 24 h chase, en tilstand berettiger til en steady state metabolisk mærkning. For metaboliske undersøgelser blev udført puls eksperimenter i 1-2 timer. Ved slutningen af ​​impulsen /chase tid blev mediet omhyggeligt opsamlet, celler blev skrabet af pladen og sphingolipider og S1P blev ekstraheret og delvist oprenset som beskrevet tidligere [22, 24]. Efter tælling for radioaktivitet ved væskescintillation blev de endelige organiske og vandige faser forelagt HPTLC, anvendelse af chloroform /methanol /vand 55: 20: (. Efter volumen) 3 og i n-butanol /eddikesyre /vand 3: 1: 1 (efter volumen.) til adskillelse af komplekse sphingolipider og SLP henholdsvis. HPTLC plader blev derefter forelagt digital autoradiografi med Beta-Imager 2000 instrument (Biospace, Paris, FR). Radioaktiviteten forbundet med individuelle lipider blev bestemt med M3-Vision følger med instrumentet.

3H-sphingolipider blev identificeret ved co-migrering med interne standarder chromatograferet i den samme plade. Ceramid blev bestemt ved at beregne steady-state

3H-ceramid /

3H-sphingomyelin-forhold, og at multiplicere det for endogen sphingomyelin indhold (22, 23). Lignende ceramidniveauer (forskellige for mindre end 12%) blev opnået efter celle mærkning ved ligevægt med

3H-Sph og

3H-serin.

3H-S1P nedbrydning blev evalueret som tritieret vand ved fraktioneret destillation af den vandige fase fra dyrkningsmediet, og måling af radioaktivitet ved væskescintillation [22]. Kontrol eksperimenter med tilsat

3H

2O viste, at intet tab af tritium ved fordampning indtraf under de anvendte forsøgsbetingelser.

Intracellulær lokalisering af fluorescerende ceramid

ER-Golgi transport af ceramid blev kvalitativt evalueret med BODIPY-C

5-Cer som tidligere rapporteret [25]. Kort fortalt blev celler dyrket på dækglas fyldt med 2,5 uM BODIPY-C

5-Cer i 30 minutter, ved 4 ° C, og derefter inkuberet i konditioneret medium (30 min ved 37 ° C), i fravær eller nærvær af luteolin. Prøverne blev derefter fikseret med glutaraldehyd, og analyseret ved fluorescensmikroskopi (se ovenfor).

SphK aktivitet

Celler blev høstet i SphK puffer (20 mM Tris-HCI, pH 7,4, indeholdende 40 mM β-glycerophosphat, 1 mM EDTA, 0,5 mM deoxypyridoxin, 15 mM NaF, 1 mM β-mercaptoethanol, 1 mM Na

3VO

4, 0,4 mM PMSF, 10% glycerol og komplette proteasehæmmere), og sprængt ved frysetørring. Lige store mængder proteiner [26] blev analyseret for SphK aktivitet under anvendelse forsøgsbetingelser kendt for selektivt favoriserer SphK1 eller SphK2 aktivitet [27, 28]. Blandingen blev inkuberet ved 37 ° C i 15-30 min. Reaktionen blev afsluttet ved tilsætning af chloroform /methanol (2:. 1, efter volumen), efterfulgt af dobbelt partitionering, først i alkalisk og derefter under sure betingelser. S1P i den endelige organiske fase blev løst ved HPTLC, og kvantificeres ved digital autoradiografi. Baggrundsværdier blev bestemt i negative kontroller, hvor ATP ikke blev tilsat til reaktionsblandingen.

Western blotting

Celler blev lyseret (20 minutter ved 4 ° C) i Tris-saltvand (20 mM Tris-HCI, pH 7,4, 150 mM NaCl) indeholdende, 1% Nonidet P-40, 10 mM NaF, 1 mM Na

3VO

4, 10 mM natriumpyrophosphat, 1 mM PMSF, og proteasehæmmere. Efter centrifugering blev supernatanter analyseret for proteiner [26], og samme mængde af proteiner (15-30 ug) blev underkastet SDS-PAGE på 10% polyacrylamidgel. Efter overførsel på nitrocellulosemembraner blev prøver inkuberet (natten over, 4 ° C) med de følgende antistoffer: anti-SphK1 og anti-SphK2 (Abcam, Cambridge, UK), anti-phospho-Akt, anti-caspase-3-antistof (Cell Signaling Technology, Inc., Danvers, MA), og derefter med et anti-HRP-konjugeret antistof (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Anti-β-actin (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) og anti-GAPDH antistoffer (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) blev anvendt som indlæsning kontrol. Immunoreaktive signaler blev visualiseret ved Supersignal West Femto (Thermo Scientific (Rockford, IL), og udsættelse for Kodak Biomax film (Rochester, NY) Immunoreaktivt band densitet blev bestemt med et densitometer (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA;. Mængde One-software ).

Statistisk analyse

data er udtrykt som middelværdi ± SD af mindst tre uafhængige forsøg i to eksemplarer. data blev analyseret ved hjælp StatMate software, version 4.0 (GraphPad). Statistisk analyse blev udført ved hjælp af Students

t

-test Forskelle blev betragtet som statistisk signifikant på

s

. . 0,05

Resultater

Luteolin inducerer apoptose i CC celler

Vi først evalueret effekten af ​​luteolin på dES og levedygtighed CC celle. Som vist i figur 1A, op til 100 uM luteolin udøver nogen tydelig toksisk effekt i des, og selv ved den højeste koncentration (200 uM), en beskeden eventuelle iagttoges cytotoksiske virkning. til det modsatte, i den samme koncentration interval, luteolin inducerede en dosisafhængig reduktion af CC cellelevedygtighed (figur 1A). Ved luteolin højere koncentrationer end 20 uM, ændringer i CC cellemorfologi karakteristisk for apoptotiske celler, herunder krympning og omfattende adskillelse fra kulturen undergrunden, blev observeret (ikke vist). Efter 24 timer behandling med cytotoksiske doser af luteolin, fluorescens mikroskopiske analyser med Hoechst 33342 afslørede, at CC celler præsenteres apoptotiske morfologiske ændringer, med kondens og fragmentering af kerner, og udstillet strålende blå fluorescens (fig 1B, højre). Omvendt i de samme betingelser, blev DES fundet med normalt udseende, og det fluorescerende farvestof farvede morfologisk normale kerner, med en dæmpet blå fluorescens (fig 1B, venstre). Desuden immunfarvning af caspase-3 afslørede, at luteolin induceret pro-caspase-3 aktivering i CC-celler, men ikke i DES (fig 1C).

(A) CC-celler (CCS) og DES blev behandlet med forskellige koncentrationer af luteolin og efter 48 timer cellelevedygtigheden blev analyseret ved MTT. Dataene er middelværdien ± SD af tre uafhængige forsøg; *, P 0,05 og **, p 0,01 over for kontrol. (B) Repræsentative mikroskopiske billeder af Des og CCS farvet med Hoechst 33342 efter behandling med 100 uM luteolin for 36 timer. (C) Western blot-analyse af Pro-caspase-3 og aktive caspase-3 intracellulære niveauer af Des og CCS behandlet eller ikke med 100 uM luteolin i 36 timer.

Akkumulering af ceramid er involveret i luteolin -induceret apoptose

i de anvendte forsøgsbetingelser, det basale niveau af ceramid signifikant lavere hos CC-celler end i dES (2,45 ± 0,38 og 4,73 ± 0,59 nmol /mg protein, henholdsvis). Efter 24 timer behandling med cytotoksiske doser af luteolin, fandt vi, at ceramid niveau af CC-celler var signifikant forøget (mere end 3-fold) af luteolin ved giftige, men ikke sub-toksiske doser (Fig 2A). Den luteolin-inducerede ceramid Stigningen måles i CC celler forud for tydelige morfologiske og nukleare ændringer. I de samme betingelser for luteolin behandling blev ingen signifikant variation i ceramid indhold observeret i Des (Fig 2A). Disse resultater fik os til at undersøge mekanismerne bag luteolin-induceret ceramid stigning med fokus på CC celler.

(A) Des og CC celler blev behandlet med luteolin, og efter 24 timer blev cellulære ceramid kvantificeret. (B) og (C) CC-celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af C2-Cer (B, firkant), C6-Cer (B, trekant) eller D609 (C), og efter 48 timer cellelevedygtighed blev vurderet ved MTT. Alle data er middelværdier ± S.D. af tre uafhængige forsøg. *, P 0,05; **, P 0,01 vs kontrol.

Eksponeringen af ​​CC-celler til stigende doser af celle permeable C2 og C6-Cer resulterede i en dosisafhængig cytotoksisk virkning (figur 2B). Styrken af ​​disse ceramid analoger til at inducere CC celledød blev omvendt relateret til deres længde af deres acylkæde, som forventet på grundlag af deres celle permeabilitet. Desuden celle behandling med D609, en inhibitor af sphingomyelin syntase [29], inducerede en cytotoksisk virkning også (fig 2C). D609 behandling (0,5 mM i 24 timer), inducerede en signifikant stigning (1,94-fold, s 0,01) af ceramid (fra 2,45 ± 0,38 til 4,76 ± 0,59), hvilket indikerer, at denne behandling var effektiv til at forhøje intracellulært ceramid. CC celler behandlet med ceramider eller D609 viste chromatinkondensering og caspase-3-aktivering (ikke vist), hvilket indikerer en induceret forøgelse af cellulær ceramid blev i stand til at efterligne luteolin i inducere apoptose.

Luteolin hæmmer ceramid metabolisme til komplekse sphingolipider

for at undersøge mekanismen ligger til grund for ceramid ophobning fremkaldt af luteolin, så udførte vi puls eksperimenter med mærket sphingosin. Vi fandt, at

3H-Sph blev hurtigt inkorporeret i CC-celler uafhængigt af luteolin behandling. Faktisk alt inkorporeret radioaktivitet udgjorde 373 ± 20 og 385 ± 25 nCi /skål i kontrol og luteolin-behandlede CC-celler. I begge tilfælde efter en times puls, niveauet af intracellulær

3H-Sph udgjorde mindre end 5% af den samlede inkorporeret radioaktivitet (ikke vist), hvilket indikerer en effektiv sphingosin metabolisme forekom i CC-celler, og var upåvirket af luteolin. Hovedparten af ​​inkorporeret radioaktivitet blev associeret til N-acylerede sphingosin-derivater, hovedsageligt repræsenteret af ceramid og sphingomyelin, og, i meget lavere mængder, ved glycosphingolipider. Luteolin behandling signifikant øget mængden af ​​radioaktivitet inkorporeret i N-acylerede metabolitter (213,7 ± 17,3 og 282,4 ± 24,9 nCi /skål, i kontrol og luteolin-behandlede celler), og ændret dens fordeling mellem forskellige sphingosin metabolitter. Faktisk, i luteolin-behandlede celler blev radiomærket ceramid fundet mere end 2 gange højere end den for kontrolceller (fig 3A, øvre panel), og blev modsvaret af en betydelig reduktion af komplekse sphingolipider, herunder både sphingomyelin og glycosphingolipider (Fig 3A , øvre panel). Lignende resultater blev opnået i puls eksperimenter med mærket serin, der anvendes som precursor for de novo sphingolipid syntese (fig 3A, nedre panel). I det hele taget disse variationer medført en betydelig forøgelse af ceramid /komplekse sphingolipid forholdet i luteolin-behandlede celler i forhold til at styre dem (mere end 10- og 7 gange efter

3H-Sph og

3H-serin puls, henholdsvis p. 0,001)

(A) CC celler blev pulset med 25 nM

3H-Sph (øverste panel) eller 200 nM

3H-serin (nederste panel) i fravær (hvid søjle) eller nærvær (grå bar) på 100 uM luteolin i 2 timer. Ved afslutningen indholdet af cellulære radiomærkede ceramid (Cer), sphingomyelin (SM) og glycosphingolipider (GSL’er) blev målt. **, P 0,01. (B) CC-celler blev inkuberet i fravær (CT) eller nærvær af luteolin (LU), derefter med BODIPY-C

5-Cer og analyseret ved fluorescensmikroskopi (bar, 10 um). (C) CC-celler blev inkuberet uden (a) eller med (b) BFA (1 ug /ml) i 30 min, og derefter pulseret med

3H-Sph eller

3H-serin med luteolin (100 uM) i 2 timer. Ceramidet /kompleks sphingolipid forholdet er rapporteret. Data er den gennemsnitlige ± standardafvigelse af to uafhængige forsøg. **, P 0.01.

Efter en 2 timer puls med L-

3H-serin, kontrol og luteolin-behandlede celler indarbejdet tilsvarende mængder af radioaktivitet i alt sphingolipider (22,3 ± 2,7 og 24,9 ± 3,0 nCi /fad). I de anvendte forsøgsbetingelser,

3H-ceramid repræsenterede den største mærkede sphingolipid, og blev fundet signifikant forøget i luteolin-behandlede celler (fig 3A, nedre panel). Som i tilfældet med

3H-Sph puls, ceramid elevation var ledsaget af en signifikant reduktion af både sphingomyelin og glycosphingolipider (fig 3A, nedre panel).

Luteolin forringer ER-Golgi trafik af ceramid

om baser af de ovennævnte resultater, var det af interesse at undersøge, om reduktionen af ​​ceramid metabolisme til komplekse sphingolipider skyldes ændringer af dets transport fra eR til Golgi-apparatet. Til dette formål, vi først undersøgte effekten af ​​luteolin på den intracellulære transport af BODIPY-C

5-Cer, et fluorescerende ceramid analog stand til at efterligne ER-Golgi trafik af naturlige ceramid i levende celler [30]. Efter mærkning kontrol celler med BODIPY-C

5-Cer, stærkt fluorescerende intracellulære vesikler akkumuleret i kompakte perinukleære strukturer, repræsentant for Golgi apparatet (fig 3B, venstre), der angiver den normale afgangen af ​​ceramid fra ER. Derimod i luteolin-behandlede celler en fluorescens breder sig i hele cellerne med en diffus retikulære mønster, og ledsaget af en reduktion af perinukleær fluorescens var tydelig (Fig 3B, højre). Disse variationer, sammen med resultaterne af den puls undersøgelse, er i overensstemmelse med den hypotese, at cytotoksiske doser af luteolin forringe ceramid transport fra ER til Golgi. For yderligere at underbygge denne, undersøgte vi virkningen af ​​BFA, som bringer forstyrrelse i Golgi ved at inducere dets fusion med ER [31], på luteolin-induceret forringelse af ceramid metabolisme. Vi fandt, at BFA signifikant reduceret luteolin-induceret ceramid akkumulering, og dette blev parallelt med højden af ​​både sphingomyelin og glucosylceramid. Som følge heraf, i nærværelse af BFA, den luteolin-inducerede forhøjelse af ceramid /komplekse sphingolipider forholdet blev markant reduceret (figur 3C).

Akt er involveret i luteolin-induceret svækkelse af ceramid trafik

Som aktiveringen af ​​serin-threonin-kinase Akt (protein kinase B) afgørende er involveret i overlevelse signalering i forskellige celletyper [32], Derefter undersøgte vi, hvorvidt Akt er involveret i luteolin toksicitet. Vi fandt, at luteolin behandling forårsagede en dosisafhængig reduktion af phosphoryleret Akt i CC-celler (Fig 4A). Endvidere LY294002, en specifik inhibitor af PI3K /Akt, var i stand til at efterligne de luteolin virkninger på ceramid metabolisme, ved at øge ceramid og reducere komplekse sphingolipider (Fig 4B).

(A) CCs blev behandlet med 50 og 100 uM luteolin i 2 timer og underkastes immunoblotting med anti-Pakt antistoffer. p-actin blev anvendt som indlæsning kontrol. (B) Celler blev forelagt pulsere med

3H-Sph i fravær (CT) eller tilstedeværelse af LY294002 i 2 timer. Niveauerne af ceramid (CER), sphingomyelin (SM) og glycosphingolipider (GSL’er) er rapporteret som middel ± S.D. af mindst tre uafhængige forsøg. **, P 0,01 vs CT celler.

Luteolin ubalancer den sphingolipid rheostat ved at hæmme SphK2

Analyserne af 1-phosphoryleringsbegivenheder metabolitter af

3H-Sph (herunder

3H- S1P og

3H-vand, dets nedbrydningsprodukt) viste, at både S1P- og vand-associeret radioaktivitet signifikant reduceret med luteolin (fig 5A og 5B). Konstateringen af, at luteolin inducerede et fald i både S1P og dets nedbrydningsprodukt fik os til at vurdere den mulige effekt af cytotoksiske koncentrationer af luteolin på SphK udtryk og aktivitet. Western blots viste ingen væsentlige forskelle i ekspression af både SphK1 og SphK2 proteiner (figur 5C). Af interesse, fandt vi, at 50-100 uM luteolin signifikant hæmmet SphK2 aktivitet på en dosisafhængig måde, men var ineffektive på SphK1 (Fig 5D). Salg

(A) og (B) CC-celler blev pulseret med

3H-Sph i 2 h i fravær (hvid bar) eller tilstedeværelse af 100 uM luteolin (grå bar). I slutningen, blev mærket S1P (A) og vand (B) evalueret i celler og medium, hhv. (C) CC-celler blev behandlet med 50-100 uM luteolin i 2 timer, og lige mængder af proteiner blev derefter analyseret for SphK1 og SphK2 proteiner ved immunblotting. GAPDH blev anvendt som indlæsning kontrol. (D) SphK1 og SphK2 aktiviteter blev analyseret i fravær eller nærvær af luteolin, hjælp CC cellehomogenatet som enzymkilde. Dataene er gennemsnit ± standardafvigelse af tre eksperimenter in duplo. **, P 0,01 vs. kontrol

luteolin-induceret hæmning af både ceramid anabolisme og SphK2 aktivitet ført til en betydelig forøgelse af ceramid /S1P-forhold (mere end 6 gange, s 0,01)., der er en relevant ubalance på den sphingolipid rheostat.

reduktion S1P er funktionelle til luteolin toksicitet

luteolin-induceret reduktion af intracellulær S1P førte os til at vurdere, om S1P administration påvirker luteolin cytotoksicitet. Vi fandt først, at S1P behandling signifikant forøget Akt phosphorylering i CC-celler (Fig 6A, op). Derudover co-administration af S1P og luteolin resulterede i en signifikant stigning af levedygtige celler (Fig 6A, ned), og reducerede luteolin hæmning af Akt-phosphorylering (Fig 6B)

(A) Overpanel.: CC-celler blev behandlet med 0,5-1 uM S1P i 2 timer. Lige mængder af celleproteiner blev derefter analyseret for phosphoryleret Akt (Pakt) ved immunblotting. Nedre panel: CC-celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af S1P under tilstedeværelse af 50 uM luteolin, og efter 48 timer cellelevedygtigheden blev analyseret ved MTT-assayet. (B) P-Akt /β-actin-forhold (middelværdi ± standardafvigelse) før og efter behandling af CC-celler med 1 pM S1P og /eller 50 uM luteolin i 2 timer. *, P 0,05 og **, p 0,01 vs. ubehandlede celler; #, S 0,05 over luteolin-behandlede celler. Et repræsentativt Western blot er rapporteret i den nedre del. (C) CC-celler blev inkuberet med luteolin alene (Lu) eller i nærvær af 1 uM S1P og /eller 1 uM SEW2871; 5 uM W123; eller 100 ng /ml PTX. (D) CC-celler blev inkuberet med luteolin i fravær eller nærvær af 1 uM bur S1P uden eller med 100 ng /ml PTX i 48 timer. Cellelevedygtighed blev målt uden (mørkegrå) eller med (lysegrå) UV-bestråling i 30 s. I (C) og (D), blev cellelevedygtighed bestemt ved MTT-assay, og levedygtigheden af ​​luteolin-behandlede celler blev betragtet som 100%. Dataene er gennemsnit ± standardafvigelse af mindst to uafhængige forsøg. **, P 0.01.

For at afgøre, om S1P udøver beskyttende virkninger på luteolin-induceret død gennem en vej, der involverer S1PRs, to farmakologiske hæmmere med forskellige virkningsmekanismer blev udnyttet. Da binding af S1P til S1P1 receptor har vist sig at være involveret i colitis-induceret kræft [33], vi først vurderet den mulige rolle af S1P1 receptor i S1P effekt på CC celler. Den specifikke S1P1 agonist SEW2871 var ikke i stand til at efterligne S1P beskyttende-effekt på luteolin toksicitet (Fig 6C), og S1P antagonisten W123 var uden relevante virkninger på S1P-medieret overlevelse af CC-celler (Fig 6C, bane 3 og 4, henholdsvis). At behandle spørgsmålet om, hvorvidt S1P inducerede pro-overlevelsesvirkninger var afhængige af de specifikke G-protein-koblede receptorer, vi analyseret celleoverlevelse i nærvær af PTX, fordi alle kendte S1P receptorer er, i det mindste delvist, kombineret med Gi /o protein [34]. Som vist i fig 6C, PTX var ikke i stand til at påvirke den stimulerende virkning af S1P på celleoverlevelse, hvilket antyder, at PTX-sensitive G-proteiner ikke er involveret i de signalveje af S1P forøgelse af celleoverlevelse. Endelig, for at undersøge evnen hos S1P til at fungere som intracellulær mediator anbragte vi CC-celler med en photolysable (bur) derivat af S1P. Som vist i fig 6D, efter fotolyse, bur S1P udviste en significative, beskyttende virkning mod luteolin-induceret celledød, og denne virkning holdt sig unmodified.in tilstedeværelsen af ​​PTX.

Discussion

denne undersøgelse, vi oprindeligt rapporterer, at, luteolin viser en dosisafhængig apoptotisk virkning på CC-celler i området fra 50-200 pM, kendt som fysiologiske koncentration af diætetiske polyphenoler i mave-tarmkanalen [35]. Af relevans i samme koncentrationsområde viste Flavone ingen toksicitet i Des, der anvendes som model for normale intestinale epitelceller. fremgår det således, at luteolin udviser cytotoksisk aktivitet mod humane CC celler med ringe eller ingen effekt på normale celler, hvilket tyder på det kan udgøre en ideel kandidat til nye lægemidler.

Vores undersøgelse afslører også for første gang, at et øget indhold af cellulære ceramid er ved roret i de forskellige følsomhed dES og CC celler til luteolin toksicitet. Vi oprindeligt fandt, at i de anvendte dyrkningsbetingelser, viste CC-celler ca. halvdelen af ​​niveauerne af ceramid sammenlignet med DES. Af interesse blev en lignende fald i det cellulære indhold af ceramid fundet i human coloncancer sammenlignet med normal colon mucosa (15), hvilket antyder, at CC-celler er særligt følsomme over højden af ​​ceramid. Desuden fandt vi, at luteolin behandling forbedret ceramid niveau CC celler, men ikke i Des.