PLoS ONE: GSTP1 DNA-methylering og Expression status er tegn på 5-aza-2′-deoxycytidin Effekt i Human prostatacancerceller

Abstrakt

DNA methylering spiller en vigtig rolle i carcinogenese og reversibilitet denne epigenetiske modifikation gør det til en potentiel terapeutisk mål. Til dato har DNA methyltransferase hæmmere (DNMTi) ikke påvist klinisk effekt i prostatakræft, med en af ​​de største hindringer er den manglende evne til at overvåge narkotika aktivitet under retssagen. I betragtning af den høje frekvens og specificitet af

GSTP1

DNA methylering i prostatakræft, vi undersøgt, om

GSTP1

er en nyttig markør for DNMTi behandlingseffekt. LNCaP-prostatacancerceller blev behandlet med 5-aza-2′-deoxycytidin (5-aza-CdR) enten med en enkelt høj dosis (5-20 uM), hver anden dag (0,1-10 uM) eller daglig (0,005-2,5 uM). En daglig behandlingsregimen med 5-aza-CdR var optimal, med signifikant undertrykkelse af celleproliferation opnås med doser på 0,05 pM eller større (p 0,0001) og induktion af celledød fra 0,5 pM (p 0,0001). I modsætning hertil behandling med en enkelt høj dosis på 20 uM 5-aza-CdR inhiberede celleproliferation, men var ikke i stand til at inducere celledød. Demethylering af

GSTP1

blev observeret med doser på 5-aza-CdR der inducerede signifikant undertrykkelse af celleproliferation (≥0.05 uM). Re-ekspression af GSTP1-protein blev kun observeret ved doser på 5-aza-CdR (≥0.5 uM) forbundet med induktion af celledød. Behandling af LNCaP-celler med en mere stabil DNMTi, zebularin kræves mindst 100 gange højere dosis (≥50 uM) for at inhibere proliferation og var mindre potent til at inducere celledød, hvilket svarede til en mangel på GSTP1 protein re-ekspression. Vi har vist, at

GSTP1

status DNA-methylering og proteinekspression er korreleret med DNMTi behandling respons i prostatacancerceller. Da

GSTP1

methyleres i næsten alle prostatakræft, vores resultater berettiger sin test som en markør for epigenetisk terapi respons i fremtidige kliniske forsøg. Vi konkluderer, at status DNA methylering og protein udtryk for

GSTP1

er gode indikatorer for DNMTi effekt

Henvisning:. Chiam K, Centenera MM, Butler LM, Tilley WD, Bianco-Miotto T ( 2011) GSTP1 DNA-methylering og Expression status er tegn på 5-aza-2′-deoxycytidin Effekt i human prostatacancerceller. PLoS ONE 6 (9): e25634. doi: 10,1371 /journal.pone.0025634

Redaktør: Irina Agoulnik, Florida International University, USA

Modtaget: Marts 7, 2011; Accepteret: September 8, 2011; Udgivet: 28 September, 2011

Copyright: © 2011 Chiam et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Health og Medical Research Council (627.185, WDT, LMB, TBM), det amerikanske forsvarsministerium (W81XWH-04-1-0017, WDT, LMB), Cancer Australien /Prostata Cancer Foundation of Australia ( 627.229, LMB, WDT), prostatakræft Foundation of Australia Equipment Grant (EG0809, WDT, LMB, TBM), W. Bruce Hall Cancer Råd SA Research Fellowship (TBM), og en Cancer Råd SA Senior Research Fellowship (LMB). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Prostatacancer er en af ​​de mest almindeligt diagnosticerede mandlige cancere i de vestlige lande. Nuværende terapier for klinisk lokaliseret sygdom indbefatter kirurgisk fjernelse af prostatakirtlen (prostatektomi) og /eller strålebehandling med eller uden androgen deprivation terapi (ADT). Siden opdagelsen i 1940’erne, at prostatakræft er afhængig af de mandlige kønshormoner [1], oprindeligt kastration og efterfølgende forskellige former for ADT, enten alene eller kombineret med androgen receptor (AR) antagonister, har været den vigtigste terapi for metastatisk sygdom. Efter en indledende variabel varighed tumorregression, mest metastatisk prostatakræft videre til en “kastrationsresistent” fase, der ikke reagerer på ADT. I øjeblikket er der begrænsede behandlingsmuligheder til rådighed for kastrationsresistent prostatacancer og der er derfor en alvorlig behov for at udvikle nye behandlingsformer.

Det er veletableret, at epigenetiske ændringer er almindelige hændelser i carcinogenese, herunder prostatakræft, som kan føre til afvigende ekspression af kritiske gener såsom tumor undertrykkere og onkogener. I modsætning til DNA-mutationer, epigenetiske ændringer er kemisk reversible af agenter kendt som epigenetiske inhibitorer og er derfor potentielle terapeutiske mål. Eksempler på epigenetiske inhibitorer, der har vist succes som terapeutiske midler omfatter DNA methyltransferase-inhibitorer (DNMTi), 5-aza-cytidin (5-aza-CR eller Vidaza) og dens mere potent analog 5-aza-2′-deoxycytidin (5- aza-CdR eller Decitabin). 5-aza-CR og 5-aza-CdR er nukleosid DNMTi oprindeligt udviklet som kemoterapeutiske cancermidler, der i øjeblikket anvendes til behandling af myelodysplastiske syndromer (MDS) [2]. De demethyleringsmiddel aktioner af 5-aza-CR og 5-aza-CdR stole på deres evne til at inkorporere i replikerende DNA, og kovalent binder til DNMT1 enzymet på en irreversibel måde, hvilket fører til DNMT1 proteinnedbrydning [2], [3]. Som DNMT1 er nødvendig for at opretholde DNA methylering under replikation, nedbrydning af DNMT1 efterfølgende resulterer i et tab af DNA methylering.

Afvigende udtryk for epigenetiske modificerende enzymer involveret i reguleringen af ​​DNA methylering er blevet observeret i alle faser af prostatakræft progression [4], [5], [6]. Globalt niveau af 5-methylcytosin og epigenetiske modificerende enzymer involveret i DNA-methylering (dvs. DNMTs) forudsige sandsynligheden for sygdomsprogression i prostatacancer. Dette fund tyder på, at DNA-methylering kan være vigtig i udviklingen af ​​prostatakræft og derfor bør DNMTi betragtes som en potentiel behandling mulighed [7], [8], [9]. Mens

in vitro Salg forsøg og dyremodeller har vist, at 5-aza-CdR har antitumoraktiviteter i flere kræftformer, herunder prostatacancer [10], [11], [12], [13], [14 ], har kliniske studier af 5-aza-CdR til behandling af solide tumorer ikke været en succes på grund af lægemiddelrelaterede bivirkninger såsom myelosuppression, kvalme og opkastning [15], [16], [17]. Ud over toksicitet spørgsmål, effektivitet levering og optagelsen af ​​5-aza-CdR til tumorvæv, der er usikkerhed om den optimale dosis-tidsplan for specifikke tumortyper [18]. Til dato har kun en lille fase II studie med 5-aza-CdR i prostatacancer blevet offentliggjort, omtrent et årti siden [16]. Mens der er igangværende kliniske forsøg for 5-aza-CdR i forskellige solide tumorer, ingen af ​​disse forsøg er kræft-specifikke heller ikke omfatter prostatakræft (National Institutes of Health, USA, clinicaltrials.gov).

In vitro

studier, der undersøger effekten af ​​5-aza-CdR i prostatakræft-cellelinjer (se tabel S1) har anvendt forskellige behandlingsregimer og forskellige definitioner for lav og høj 5-aza-CdR doser, hvilket gør det vanskeligt at sammenligne mellem undersøgelser og definere den optimale behandling regime, herunder dosis-liste for prostatakræft. Overraskende meget få af de

in vitro

studier (tabel S1A) har undersøgt effekten af ​​5-aza-CdR om spredning og overlevelse af prostata kræftceller, men snarere har undersøgt effekten af ​​5-aza CdR på genekspression for at identificere kandidat epigenetisk-regulerede gener (tabel S1B).

Formålet med denne undersøgelse var at undersøge de dosisafhængige virkninger af 5-aza-CdR i prostata cancer celler med henblik på at giver et grundlag for at udvikle en optimal 5-aza-CdR behandling ordning for prostatakræft. Vi undersøgte også den relative toksicitet af 5-aza-CdR og zebularin i LNCaP prostata kræftceller. Zebularin er en cytidinanalog, som har lignende funktioner til 5-aza-CdR som demethyleringsmiddel, men er mindre toksisk og har en mere stabil halveringstid (~508 timer ved 37 ° C, pH 7) end 5-aza-CdR ( 12 timer ved 37 ° C, pH 7) [19], [20]. Identifikation af en god markør for DNMTi virkningsfuldhed til kliniske forsøg, ligesom målingen af ​​serum PSA niveauer til at overvåge effektiviteten af ​​ADT [21], ville have potentiale til at støtte kliniske behandling af patienter med prostatacancer behandlet med epigenetiske terapier. For at undersøge effekten af ​​5-aza-CdR og zebularin i prostatacancerceller undersøgte vi DNA-methylering og ekspression status for glutathion-S-transferase P1 (

GSTP1

) genet.

GSTP1

er hypermethyleret i næsten alle menneskelige prostatakræft og dens promoter DNA methylering niveau er i stand til at skelne mellem benign prostatahyperplasi og forskellige kvaliteter af prostata adenocarcinom [6], [22], [23], [24] , [25]. Mens de nuværende undersøgelser har fokuseret på at bruge

GSTP1

som en potentiel markør for tidlig påvisning af prostatakræft, foreslår vi, at vurdere DNA methylering af

GSTP1

promoter region, samt udtryk for GSTP1 , har potentialet til at være et nyttigt redskab til at bestemme DNMTi effekt i prostatakræft.

Materialer og metoder

Måling af cellernes levedygtighed

LNCaP og PC3 humane prostata carcinomaceller ( American Type Culture Collection, ATCC) blev opretholdt i RPMI 1640 suppleret med 5% eller 10% føtalt bovint serum (FBS). 5-aza-CdR og zebularin (Sigma, A3656 og Z4775) blev opløst i dimethylsulfoxid (DMSO) og Hanks pufrede saltopløsning hhv. For det indre og dagligt alternativ behandling med 5-aza-CdR blev celler podet tredobbelt i 24-brønds plader ved en densitet på 2,5 x 10

4 celler per brønd i 1 ml RPMI-medium. For 5-aza-CdR daglig behandling og zebularin behandling blev celler podet tredobbelt i 12-brønds plader ved en densitet på 1 x 10

4 celler per brønd i 1 ml RPMI-medium. Celler lodes binde til 241h eller 48 timer, når cellekonfluens blev nået, og derefter inkuberet med medium indeholdende 5-aza-CdR ved koncentrationer på 0-20 uM eller zebularin ved koncentrationer på 50-1000 pM. For efterfølgende eller yderligere behandlinger, blev frisk 5-aza-CdR eller zebularin fortyndet i medier tilsættes til cellerne. Medier, der indeholder de respektive agenter blev frisklavet fra 10 mM 5-aza-CdR og 70 mM zebularin lagre før hver behandling. Celler blev trypsinbehandlet og talt ved anvendelse af et hæmocytometer ved de specificerede tidspunkter efter initiering af behandling og cellelevedygtighed vurderes ved trypanblåt-udelukkelse som tidligere beskrevet [26]. Data er udtrykt som middelværdien +/- SE for tredobbelte brønde og er repræsentative for mindst to uafhængige forsøg.

immunblotting

LNCaP-celler blev podet i 6-brønds plader ved en densitet på 2 × 10

4 celler per brønd i 2 ml RPMI-medium indeholdende 10% FBS. Celler lodes binde i 24 timer før mediet blev erstattet med medium indeholdende behandlinger. Cellerne blev lyseret ved tilsætning radioimmunpræcipitationsanalyse lyseringsbuffer (10 mM Tris-HCI, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100) indeholdende mini-komplet proteasehæmmere pellets (Roche). Lysater (15-30 ug) blev elektroforesebehandlet gennem 5% eller 12% polyacrylamidgeler, overført til nitrocellulosemembran (Amersham Biosciences), og blokeret i 5% fedtfri mælkepulver i TBS indeholdende 0,05% Tween 20 natten over. Immundetektion blev udført med det specifikke primære antistof fortyndet i 1% fedtfri mælkepulver i TBS indeholdende 0,05% Tween20. GSTP1-antistof (Chemicon, AB8902) blev anvendt i en fortynding på 1:5000 og inkubation natten over ved 4 ° C. Hsp90-antistof (Santa Cruz Biotechnology), blev anvendt ved en fortynding på 1:1000 og 30 minutters inkubation ved stuetemperatur. Peberrodsperoxidase-konjugeret anti-kanin sekundært antistof (DAKO, E0432) blev anvendt i en fortynding på 1:2000 og 30 minutters inkubation ved stuetemperatur. Resultaterne blev visualiseret på Hyperfilm (GE Healthcare) ved hjælp af forbedret kemiluminescensdetektion (GE Healthcare).

DNA methylering analyse

Efter vurdering cellernes levedygtighed, de resterende LNCaP celler blev indsamlet til genomisk DNA ekstraktion ved hjælp af TES (10 mM Tris-HCI ved pH 8, 0,1 M NaCl, 1 mM EDTA) -buffer, proteinase K og 20% ​​SDS som tidligere [27] beskrevne. DNA (1-2 ug per prøve) blev bisulfit modificeret med MethylEasy ™ DNA Bisulfit Modification Kit (Human Genetic Signatures Pty Ltd) ifølge producentens protokol. En samlet volumen på 25 pi eller 50 pi PCR-reaktionsblandingen blev gjort med 3-5 pi af bisulfit modificerede DNA og 2,5 enheder HotstarTaq DNA-polymerase (Qiagen).

GSTP1

Methylering-Specific Polymerase kædereaktion (MSP) [28] og kombineret Bisulfite Restriction Analysis (COBRA) [29] primere blev købt fra Geneworks (South Australia, Australien).

GSTP1

MSP primersekvenser var som beskrevet tidligere [24] og alle primersekvenserne anvendt i denne undersøgelse er givet i figur S1. Annealing temperaturer for de respektive primere var: 40 cykler ved 64,3 ° C i methylerede

GSTP1

MSP primere; 45 cyklusser ved 61,6 ° C i umethyleret

GSTP1

MSP primere; 45 cyklusser ved 56,8 ° C i

GSTP1

COBRA primere. PCR-produkter fra

GSTP1

COBRA analyser blev fordøjet med restriktionsenzymer BstUI og Hhal (New England BioLabs). PCR-produkter blev visualiseret ved agarosegel electropheresis med AlphaImager 2200 gel dokumentationssystem (San Leandro).

Statistisk analyse

En-vejs variansanalyse (ANOVA) med en post-hoc Dunnet multiple sammenligningstest blev anvendt til at sammenligne cellelevedygtighed mellem behandlinger og vehikelkontrollen når en enkelt time-point blev vurderet. To-vejs ANOVA med en post-hoc Bonferroni testen blev anvendt til at sammenligne cellernes levedygtighed mellem behandlinger og kontrol bilen, når flere tidspunkter blev vurderet. Analyser blev udført med GraphPad Prism 5 software (GraphPad Software, Inc., CA USA) og statistisk signifikans blev sat til p. 0,05 (to-sidet)

Resultater

Dagligt 5- aza-CdR behandling er nødvendig for at fremkalde en optimal hæmning af proliferation og induktion af celledød i LNCaP prostatacancerceller

for at undersøge effekten af ​​forskellige 5-aza-CdR behandlingsplaner, vi udførte celle spredning og levedygtighed analyser på LNCaP prostatacancerceller og sammenlignet følgende: en enkelt behandling, alternative dag behandlinger og daglige behandlinger. Sammenlignet med kontrolgruppen (vehikel), en enkelt behandling af 5-aza-CdR undertrykkes effektivt LNCaP prostatacancer celleproliferation ved alle koncentrationer anvendes (5-20 pM) (figur 1A, Dag 4: p 0,001 for 5 uM og p 0,0001 for alle doser), men inducerede ikke signifikant celledød 6 dage efter behandling (figur 1B). Når 5-aza-CdR blev tilsat hver anden dag (alternativ dages behandling), lavere doser af 5-aza-CdR (0,1, 0,5 og 2,5 uM) sammenlignet med doser, der anvendes i det indre behandlingsskema resulterede i en signifikant dosisafhængig inhibering af celleproliferation i forhold til vehikelbehandlede LNCaP celler (figur 1C, dag 4 og 6: p 0,0001 for alle doser). Kun doser af 5-aza-CdR på 2,5 uM eller større induceret betydelig celledød sammenlignet med den for bærerbehandlede celler (figur 1D, Dag 6: p 0,001 i 2,5 uM og p 0,0001 til 10 uM). I modsætning hertil daglig behandling af 5-aza-CdR opnåede signifikant hæmning af spredning ved lavere koncentrationer (0,05 uM) (figur 2A, Dag 6: p 0,05 for 0,05 uM, s 0,001 for alle doser 0,5 uM eller større, dag 8 : p 0,05 for 0,01 uM og p 0,001 for alle doser 0,05 uM eller større) og øget celledød i LNCaP-celler (figur 2B, Day 8: p 0,001 for doser på 0,5 uM eller større) sammenlignet med tilsvarende doser givet hver anden dag. Dosisafhængig inhibering af proliferation blev opnået med 5-aza-CdR daglige doser på 0,05 pM eller derover resulterer i en reduktion i celleantal 62% sammenlignet med vehikelbehandlede celler og fuldstændig inhibering af proliferation i doser på 0,5 uM eller mere (figur 2A og 2E, s 0,0001). I doser, der forårsagede fuldstændig inhibering af proliferation, der var også en signifikant stigning i celledød, af ca. 3 gange, sammenlignet med vehikelkontrol (figur 2B og 2F, s 0,0001).

LNCaP prostata kræftceller (2,5 x 10

4 celler per brønd i plader med 24 brønde) blev behandlet med stigende doser af 5-aza-CdR (5-20 uM) indgives (A-B) en gang på dag 0 eller (C- D) med stigende doser af 5-aza-CdR (0,1-10 uM) genopfyldes hver anden dag i op til 6 dage. (A) og (C) celler blev talt med regelmæssige intervaller under anvendelse af et hæmocytometer, og antallet af levedygtige celler blev vurderet ved trypanblåt-udelukkelse. (B) og (D) antallet af døde celler udtrykkes som en procentdel af det samlede antal talte celler. Data på hvert tidspunkt repræsenterer middelværdien +/- SE for tredobbelte brønde. * To-vejs ANOVA: p 0,0001 for (A), (C) og (D) (10 uM); p. 0,001 for (D) (2,5 uM) sammenlignet med køretøj kontrol (VEH) på sidste dag i behandling

(A-B) LNCaP og (C-D) PC3 prostatacancerceller (1 × 10

4 celler per brønd i plader med 12 brønde) blev behandlet med stigende doser af 5-aza-CdR (0,005-2,5 uM) genopfyldes dagligt i op til 8 dage. (A) og (C) celler blev talt med regelmæssige intervaller under anvendelse af et hæmocytometer, og antallet af levedygtige celler blev vurderet ved trypanblåt-udelukkelse. (B) og (D) antallet af døde celler udtrykkes som en procentdel af det samlede antal talte celler. (E) og (F) i forhold cellelevedygtighed efter 6 eller 8 dages behandling med 5-aza-CdR blev præsenteret som procentdelen af ​​levedygtige celler sammenlignet med vehikelkontrol (VEH) og den relative celledød som fold procent af døde celler sammenlignet med VEH kontrol. Data på hvert tidspunkt repræsenterer middelværdien +/- SE af tredobbelte brønde fra mindst to eksperimenter. * To-vejs ANOVA: p 0,05 for (A) (0,01 uM); p 0,001 for (A) (0,05-2,5 uM), (B) og (D) (0,5 uM); p 0,0001 til (C) og (D) (1, 2,5 uM) sammenlignet med vehikelkontrol (VEH) på sidste behandlingsdag

Virkninger af 5-aza-CdR på prostatacancer. cellelevedygtighed er uafhængig af AR

for at bestemme om virkningen af ​​5-aza-CdR i LNCaP-celler var afhængig af et funktionelt AR, en daglig behandlingsplan, blev også udført i PC3-celler, som mangler et funktionelt AR. Ved behandling med 5-aza-CdR i doser på 0,005 til 2,5 uM, var der en lignende dosisafhængig inhibering af proliferation og induktion af celledød i PC3-celler, som der var i LNCaP-celler (figur 2A-D). Henviser en omtrentlig 3-fold induktion af celledød blev set med 0,5 pM 5-aza-CdR i begge cellelinier (figur 2F) i PC3-celler, lavere doser af 5-aza-CdR (0,005 pM og 0,01 pM) resulterede i en signifikant reduktion i celleantal (p 0,0001, figur 2E), og dette skete på et tidligere tidspunkt-punkt (4 dage) sammenlignet med LNCaP-celler (6 dage) behandlet identisk (figur 2a og 2c). Siden 5-aza-CdR afhængig af delende celler til inkorporering for at fremkalde dets virkninger, forskellen i fordoblingstid mellem de 2 cellelinjer, ca. 24 timer i PC3-celler sammenlignet med 48 timer i LNCaP-celler, kan forklare den forøgede styrke af 5 aza-CdR på PC3 cellelevedygtighed. Androgen-uafhængig inhibition af proliferation og induktion af celledød ved 5-aza-CdR i prostatacancerceller blev yderligere bekræftet ved cellelevedygtighedsassays udført i LNCaP-celler dyrket i steroid-depleterede medium (figur S2).

langvarig 5-aza-CdR behandling resulterer i lignende celledød uanset behandlingsregimet

for yderligere at karakterisere forskellene mellem den anden dag og daglig behandling regime, den højeste anden dag behandling (10 uM) og den højeste daglige behandling (2,5 uM) blev sammenlignet i en udstrakt vækstkurve (figur 3). LNCaP-prostatacancerceller blev behandlet med vehikelkontrol eller 5-aza-CdR genopfyldes på skiftende dage eller dagligt, som ovenfor. Celleviabilitet og celledød blev vurderet efter 6 dages behandling. Et sæt celler derefter fortsat modtog 5-aza-CdR genopfyldes hver anden dag eller dagligt indtil dag 12 (betegnet som 10 uM-12d eller 2,5 uM-12d, figur 3), mens det andet sæt af celler modtagne medier indeholdende vehikelkontrol ( betegnet som 10 uM-6d eller 2,5 uM-6d, figur 3). Efter 6 dages behandling, både den alternative dag og daglige behandlinger inducerede væksthæmning sammenlignet med vehikelkontrol, men kun den daglige behandling resulterede i celledød (figur 3). Som kontrolcellerne havde nået sammenflydning ved dag 6, blev disse celler ekskluderet for resten af ​​eksperimentet. Med fortsat behandling på begge regime mængden af ​​celledød fortsatte med at stige i de 12 dage, nåede 61,4% for den anden dag behandling og 68,6% for den daglige behandling. Interessant, de celler, der kun modtog behandling i 6 dage viste tilsvarende niveauer af celledød til dem, der modtog behandling i 12 dage (figur 3).

(A) og (C) LNCaP-prostatacancerceller (2,5 x 10

4 celler per brønd i plader med 24 brønde) blev behandlet med 10 pM 5-aza-CdR eller vehikelkontrol, genopfyldes hver anden dag. (B) og (D) LNCaP prostatacancerceller (1 × 10

4 celler per brønd i plader med 12 brønde) blev behandlet med 2,5 pM 5-aza-CdR eller vehikelkontrol, genopfyldes dagligt. Efter 6 dages behandling blev kontrolceller ophørt, og de resterende celler enten fortsat modtog 5-aza-CdR (10 uM-12d eller 2,5 uM-12d) eller modtog frisk medium indeholdende vehikel (10 uM-6d eller 2,5 uM -6d). (A) og (C) celler blev talt på dag 6, 8 og 12 under anvendelse af et hæmocytometer, og antallet af levedygtige celler blev vurderet ved trypanblåt-udelukkelse. (B) og (D) antallet af døde celler udtrykkes som en procentdel af det samlede antal celler talt.

GSTP1

promotor DNA-methylering status og protein re-ekspression som markører af 5-aza-CdR effekt

for at undersøge, hvordan de anti-proliferative virkninger af 5-aza-CdR vedrører landets demethylere aktivitet, blev MSP udført for at vurdere status DNA methylering af

GSTP1

promotor (figur 4A). Hypermethyleret

GSTP1

promotor DNA var til stede i LNCaP celler behandlet med kontrol køretøj. I modsætning hertil umethyleret

GSTP1

promotor-DNA blev detekteret i LNCaP-celler behandlet dagligt med 0,05 uM eller større 5-aza-CdR, men helt demethyleres

GSTP1

promotor-DNA blev ikke observeret med selv den højeste koncentration af 5-aza-CdR. Demethylering af

GSTP1

promotoren ved 5-aza-CdR ved doser spændende end eller lig med 0,05 pm faldt sammen med evnen hos 5-aza-CdR til i det væsentlige at inhibere celleproliferation ved disse koncentrationer (figur 2A-B) .

DNA og proteiner blev ekstraheret fra LNCaP-celler behandlet med stigende doser af 5-aza-CdR (0,005-2,5 gM). Celler blev behandlet dagligt og DNA og protein høstet efter 6 dages behandling. (A) MSP blev udført på bisulfit-modificeret DNA med primere rettet bisulfit-modificerede methylerede

GSTP1

promotor eller umethyleret

GSTP1

promotor. (B-C) den relative status for methylering af GSTP1-promotoren efter 5-aza-CdR behandling blev yderligere vurderet ved COBRA anvendelse af to restriktionsenzymer, BstUI og Hhal. MDA-MB-231 brystcancerceller blev anvendt som kontrol for ikke-methyleret

GSTP1

promotor. (D) Immunoblot blev udført for at analysere GSTP1 proteinekspression. Påvisning af Hsp90 blev anvendt som en belastning kontrol.

For yderligere at undersøge den relative DNA methylering status for de

GSTP1

promotor i det 5-aza-CdR behandlede LNCaP celler, COBRA var udført under anvendelse BstUI og Hhal restriktionsenzymer (figur 4B-C). Den ikke-methyleret

GSTP1

promotor til stede i MDA-MB-231 brystcancerceller blev ikke spaltet af BstUI eller Hhal (figur 4B). I overensstemmelse med MSP resultater, methylerede

GSTP1

promotor blev påvist i vehikelbehandlede (kontrol) og 5-aza-CdR behandlede LNCaP-celler ved doser på 0,005 til 0,5 uM. Betydelig

GSTP1

promotor-DNA demethylering blev kun set i respons på 0,5 pM 5-aza-CdR, hvilket er det laveste 5-aza-CdR dosis tilstrækkelig til at inducere fuldstændig inhibering af LNCaP celleproliferation og celledød påvist i cellelevedygtighedsassays (Figur 2A-B). Disse resultater antyder, at virkningen af ​​0,5 uM 5-aza-CdR skyldes dens evne til at inducere større DNA demethylering af

GSTP1

sammenlignet med lavere doser.

Den større demethyleringsmiddel effekt på 0,5 uM sammenlignet med 0,05 uM 5-aza-CdR svarer med GSTP1 protein re-ekspression observeret ved 0,5 uM 5-aza-CdR eller større (figur 4D). I overensstemmelse med denne, de 5-aza-CdR doser, der resulterer i re-ekspression af GSTP1-protein også inducere signifikant celledød i LNCaP-celler (figur 2B og 2F).

zebularin inhiberer proliferation af prostatacancerceller men har begrænsede virkninger på celledød

LNCaP-celler blev behandlet med zebularin (0-1000 uM; højeste dosis anvendt i tidligere undersøgelser [30]), mens PC3-celler blev behandlet med zebularin doser på op til 400 uM. Zebularin blev givet på dag 0 og genopfyldes igen halvvejs gennem behandlingsperioden. Zebularin forårsagede en dosisafhængig inhibering af proliferation i både LNCaP og PC3-prostatacancerceller (figur 5A og 5C, p 0,0001), hvilket antyder, at zebularin har en lignende AR-uafhængig vækstinhiberende virkningsmekanisme på prostatacancerceller som 5-aza -CdR. En betydelig reduktion i antallet af levedygtige celler blev observeret med 100 til 200 uM zebularin, og fuldstændig hæmning af celleproliferation blev observeret ved 400 pM eller mere i både LNCaP og PC3-celler (figur 5A og 5C, s 0,0001). Betragtninger zebularin undladt at inducere celledød i forskellige doser i LNCaP-celler (figur 5B), blev betydelig celledød induceret af 400 uM zebularin i PC3-celler (figur 5D, p = 0,0004).

(AB) LNCaP og (C-D) PC3 prostatacancerceller (1 × 10

4 celler per brønd i plader med 12 brønde) blev behandlet med stigende doser af zebularin (0-400 uM, op ​​til 1000 uM for LNCaP-celler) genopfyldes én gang på dag 4 i en periode på 6 dage for PC3 celler og 8 dage for LNCaP-celler. (A) og (C) celler blev talt med regelmæssige intervaller under anvendelse af et hæmocytometer og cellelevedygtighed blev vurderet ved trypanblåt-udelukkelse. (B) og (D) antallet af døde celler udtrykkes som en procentdel af det samlede antal talte celler. Data på hvert tidspunkt repræsenterer middelværdien +/- SE for tredobbelte brønde. * En-vejs ANOVA; p 0,0001 for (A) og (C); p = 0,0004 for (D) sammenlignet med vehikel-kontrol (VEH).

zebularin har svagere demethylering handlinger på

GSTP1

promotor i forhold til 5-aza-CdR

for at undersøge demethyleringsmiddel aktivitet zebularin blev MSP udført for at undersøge status DNA methylering af

GSTP1

promotor i LNCaP-celler (figur 6A). Efter 8 dages behandling, methyleret

GSTP1

var til stede i vehikelkontrollen og alle zebularin behandlede prøver (0-400 uM), mens demethylering af

GSTP1

promotor manglede dosisafhængighed (figur 6A). Når den relative status DNA methylering af

GSTP1

promotorregion i disse zebularin-behandlede LNCaP-celler blev sammenlignet ved COBRA hjælp BstUI og Hhal restriktionsenzymfordøjelse, ingen ikke-methyleret

påvistes GSTP1

(figur 6B ). De svage og usammenhængende demethylere handlinger zebularin på LNCaP celler afspejles også i den manglende GSTP1 protein re-udtryk efter 8 dages behandling (figur 6C).

DNA og proteiner blev udvundet fra LNCaP celler efter 8 dage af behandling med stigende doser af zebularin (0-400 uM). (A) DNA var bisulfit-modificerede og MSP blev udført med primere rettet mod bisulfit-modificerede methylerede

GSTP1

eller umethyleret

GSTP1

. (B) Den relative DNA methylering status for

GSTP1

promotor efter zebularin behandling blev vurderet ved COBRA hjælp af to restriktionsenzymer, BstUI eller Hhal. (C) Immunoblot blev udført for at analysere GSTP1 proteinekspression i LNCaP-celler efter 8 dages zebularin behandling. Proteiner blev ekstraheret fra LNCaP-celler behandlet med stigende doser af zebularin (0-400 uM). PC3 celler udtrykker endogene GSTP1-protein og blev anvendt som positiv kontrol.

Diskussion

Mens DNMTi 5-aza-CdR er effektiv i behandlingen af ​​hæmatologiske tilstande, kliniske forsøg i fast tumorer og i prostatacancer har vist begrænset eller ingen effekt. Den manglende af tidligere kliniske forsøg i solide tumorer er blevet tilskrevet upassende dosisregime, hvilket fører til toksicitet bivirkninger. I del, det skyldes en dårlig forståelse af de mekanistiske handlinger af 5-aza-CdR i solide tumorer. I denne undersøgelse viser vi, at 5-aza-CdR, i en dosis på 0,5 pM gives dagligt, inhiberede fuldstændigt celleproliferation og celledød i prostatacancerceller, og var forbundet med demethylering af

GSTP1

promotor og re-ekspressionen af ​​GSTP1 protein. Disse resultater antyder, at en daglig lavdosis 5-aza-CdR behandlingsregime kan være mere effektiv end en mindre hyppig eller enkelt høj-dosis program til bekæmpelse af prostatacancer cellevækst. Vi har også påvist, at en daglig lavdosis 5-aza-CdR behandlingsregime er mere effektiv end en anvendelse af den mere stabile DNMTi, zebularin. Vigtigst er det, vi giver bevis for, at den øgede styrken af ​​5-aza-CdR forhold til zebularin i prostatacancerceller er tæt knyttet til sin demethylere aktivitet og identificeret

GSTP1

som et potentielt nyttigt biomarkør til vurdering DNMTi effekt i prostata cancer.

Flere undersøgelser har vist, at 5-aza-CdR reducerer celleproliferation og inducerer re-ekspression af specifikke gener i forskellige cancere (tabel S1). Forskellige cancertyper svare 5-aza-CdR forskelligt, men en lang række 5-aza-CdR doser og behandlingsregimer er blevet anvendt i tidligere undersøgelser, og end-points og analyser var forskellige i de forskellige undersøgelser. Ni publicerede studier har undersøgt effekten af ​​5-aza-CdR om levedygtigheden af ​​prostatakræft-cellelinier (Tabel S1A) [10], [11], [31], [32], [33], [34], [ ,,,0],35], [36], [37]. Sammenligninger mellem disse undersøgelser er vanskelig på grund af de årsager, der er anført ovenfor. For eksempel, Walton et al [11] rapporterede ca. 30% inhibering af celleproliferation sammenlignet med vehikelkontrol i LNCaP prostatacancerceller efter behandling med 8,8 pM 5-aza-CdR, mens Pulukuri et al [10] rapporterede 70% inhibering af celleproliferation sammenlignet med vehikelkontrol i den samme cellelinje med en høj dosis på 10 uM 5-aza-CdR behandling.