PLoS ONE: Chrysin Hæmmer Tumor Promotor-induceret MMP-9 Expression ved Blokering AP-1 via Undertrykkelse af ERK og JNK veje i Gastric Cancer Cells

Abstrakt

Cell invasion er en afgørende mekanisme for kræft metastaser og malignitet . Matrixmetalloproteinase-9 (MMP-9) er en vigtig proteolytisk enzym involveret i cancercelleinvasion proces. Høje ekspressionsniveauer af MMP-9 i mavekræft positivt korrelere med tumor aggressivitet og har en betydelig negativ korrelation med patienternes overlevelsestid. For nylig, mekanismer undertrykke MMP-9 ved fytokemikalier er blevet stadig undersøgt. Chrysin, et naturligt forekommende kemisk i planter, er blevet rapporteret at undertrykke tumormetastase. Virkningerne af chrysin på MMP-9-ekspression i gastrisk cancer er ikke blevet godt undersøgt. I den foreliggende undersøgelse testede vi virkningerne af chrysin på MMP-9-ekspression i gastriske cancerceller, og bestemmes dets underliggende mekanisme. Vi undersøgte virkningerne af chrysin på MMP-9-ekspression og aktivitet via RT PCR-, zymografi, promotor undersøgelse, og western blotting i humane gastrisk cancer AGS celler. Chrysin inhiberede phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA) -inducerede MMP-9 ekspression i en dosis-afhængig måde. Brug af AP-1 lokkefugle oligodeoxynukleotider, bekræftede vi, at AP-1 var afgørende transkriptionel faktor for MMP-9-ekspression. Chrysin blokeret AP-1 via suppression af phosphorylering af c-Jun og c-Fos gennem blokering af JNK1 /2 og ERK1 /2 veje. Endvidere viste AGS-celler forbehandlet med PMA markant forbedret invasivitet, som blev delvist ophævet ved chrysin og MMP-9 antistof. Vores resultater antyder, at chrysin kan udøve i det mindste en del af sin anticancervirkning ved at styre MMP-9-ekspression gennem suppression af AP-1-aktivitet via en blok af JNK1 /2 og ERK1 /2 signalveje i mavekræft AGS celler.

Henvisning: Xia Y, Lian S, Khoi PN, Yoon HJ, Joo YE, Chay KO, et al. (2015) Chrysin inhiberer Tumor Promotor-induceret MMP-9 Expression ved Blokering AP-1 via Undertrykkelse af ERK og JNK Pathways i Gastric Cancer Cells. PLoS ONE 10 (4): e0124007. doi: 10,1371 /journal.pone.0124007

Academic Redaktør: Pankaj K. Singh, University of Nebraska Medical Center, UNITED STATES

Modtaget: Oktober 5, 2014 Accepteret: 9 mar 2015; Udgivet 15. april, 2015

Copyright: © 2015 Xia et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af en forskningsbevilling (0720570) fra National Cancer center (www.ncc.re.kr), Basic Science Research Program tilskud gennem National Research Foundation of Korea (NRF) finansieret af Ministeriet for Uddannelse, Videnskab og Teknologi (2010 til 0.009.910, www.moe.go.kr), og en Medical Research center (2012-000-9442) bevilling fra koreanske Science and Engineering Foundation ( www.nrf.re.kr). Alle ovenstående finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

mavekræft rangerer i øjeblikket andenpladsen i den globale dødelighed af kræft, med en anslået 990.000 nye tilfælde og 738.000 kræftdødsfald som følge verdensplan årligt, selv om forekomsten af ​​mave karcinom er faldet i de seneste årtier [1,2]. Distant organ eller væv metastase er et tegn på dårlig prognose hos patienter med gastrisk cancer. Metastase er den mest dødelige karakteristisk for maligne tumorer, der tegner sig for mere end 90% af tumor-relaterede dødelighed [2]. Det er blevet vist, at kemoterapi og strålebehandling ikke signifikant kan forlænge og forbedre livskvaliteten for patienter i de tilfælde [3,4]. Tumorceller metastase er en meget kompleks proces bestående af proliferation, migration, invasion, og den efterfølgende adhæsion og angiogenese i andre organer eller væv [3].

Da invasion er en af ​​de grundlæggende egenskaber ved maligne cancerceller, kontrollerende invasion, er et vigtigt terapeutisk mål. Cell-ekstracellulære matrix (ECM) interaktioner, afbrydelse af intercellulære friktion, nedbrydning af ECM, og invasionen af ​​lymfeknuder og blodkar er vigtige skridt i kræft invasion og metastase [5]. Tumorinvasion kræver en forøget ekspression af matrixmetalloproteinaser (MMP’er) [6]. MMP’er, en familie af zink-afhængige endopeptidaser, som inducerer cancercelleinvasion og spredning, spiller afgørende roller i metastase gennem nedbrydningen af ​​ECM og basalmembranen [7]. Matrixmetalloproteinase-9 (MMP-9), kendt som 92 kDa type-IV collagenasen eller gelatinase B, er en af ​​de vigtigste MMP’er, og kodes af MMP-9-genet hos mennesker [8]. Det er blevet rapporteret, at overekspression af MMP’er kan øge tumorcelle løsrivelse og metastase, der er associeret med malignitet og fattige kliniske resultater i forskellige cancerformer, herunder gastrisk cancer [9,10].

På grund af funktionen af ​​MMP- 9 i løbet af malignitet, undertrykkelse af MMP-9-niveauer er en vigtig strategi til styring af kræft. I de seneste år har mere og mere opmærksomhed været fokuseret på at finde en MMP-9-inhibitor, især fra naturligt forekommende materialer. Kim et al. opdagede, at silibinin inhiberer PMA-induceret MMP-9-ekspression gennem suppression af ERK-phosphorylering i MCF-7 humane brystcancerceller [11]. For nylig Khoi et al. rapporterede, at (-) – Epigallocatechin-3-gallate blokerer nicotin-induceret MMP-9-ekspression og invasivitet gennem undertrykkelse af NF-KB og AP-1 i endotelceller ECV304-celler [12]. Chrysin, 5,7-dihydroxyflavone, en type af naturligt forekommende flavonoid, har været kendt for at inhibere angiogenese og metastase [13,14]. Lin et al. viste, at chrysin undertrykker IL-6-induceret angiogenese gennem nedregulering af den opløselige IL-6-receptor /gp130 /JAK1 /STAT3 /VEGF-signalvejen [13]. det er for nylig rapporteret, at chrysin kan øge caspase-afhængig apoptose reguleret af TRAIL i HCT 116-cellelinien og CNE1 celler [15]. Yang et al. opdagede, at chrysin undertrykt celleinvasion på en dosis-afhængig måde i TNBC celler. Endvidere chrysin nedsætter metastase-relaterede molekyler vimentin, snegle og slug, og blokerer Akt signalvejen [16]. Men de inhiberende virkninger af chrysin på MMP-9, samt mekanismen ikke er blevet godt undersøgt, især i gastriske cancerceller. I den foreliggende undersøgelse, undersøgte vi Chrysin virkninger på PMA-induceret MMP-9-ekspression i mavekræft, og afsløret sin underliggende mekanisme.

Materialer og metoder

Cell kultur og dyrkningsbetingelser

AGS human gastrisk cancer cellelinje blev opnået fra American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Cellerne blev dyrket i RPMI-1640 suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 0,6% penicillin-streptomycin ved 37 ° C i en atmosfære indeholdende 5% CO

2. At bestemme virkningerne af chrysin på PMA-induceret MMP-9-ekspression blev cellerne forbehandlet med forskellige koncentrationer af chrysin og derefter behandlet med PMA. Niveauet af MMP-9 messenger-RNA (mRNA) blev bestemt ved revers transkription-polymerasekædereaktion (RT-PCR) analyse. Rolle de specifikke signalveje i PMA-induceret MMP-9-ekspression blev undersøgt ved forbehandling af AGS-celler med ERK 1/2 inhibitor PD98059 (New England Biolabs, Beverly, MA), JNK inhibitor SP600125 (Calbiochem, La Jolla , CA), p38 MAPK inhibitor SB203580 (Calbiochem, La Jolla, CA), og chrysin (Sigma-Aldrich, USA) i 1 time før stimulering med PMA. Salg

Cellelevedygtighed Salg

Celler ( 5 × 10

3) blev inkuberet i en 96-brønds plade i RPMI med 10% FBS indeholdende 0-100 uM chrysin i 24 timer, og celle respiration blev bestemt ved en etableret 3- [4,5-dimethylthiazol-2 yl] -2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT; Sigma-Aldrich) assay. Efter inkubationen 10 pi af 5 mg /ml MTT blev tilsat til hver brønd i 96-brønds plader og inkuberet ved 37 ° C i 2 timer. Formazan opnåede granula blev opløst i 100% dimethylsulfoxid, og absorbansen ved 570 nm blev detekteret med en 96-brønds ELISA-læser (Biotek Inc., Winooski, VT, USA).

gelatinezymografi

Celler forbehandlet med eller uden chrysin i 1 time, blev behandlet med 100 nM PMA i 20 timer. Efter inkubation vi samlet medierne supernatanten og udførte gelatinezymografi at kontrollere MMP-9-aktivitet. Efterfølgende blev mediet blandet med et tilsvarende volumen af ​​2P-9 activityrazolium B [62,5 mM Tris-HCI (pH 6,8), 25% glycerol, 4% SDS og 0,01% bromphenolblåt] og fyldt i en 7,5% acrylamid: bisacrylamid (29: 1; Bio-Rad, USA) gel indeholdende 625 ug /ml gelatine (Sigma). Efter elektroforese blev gelen vasket med 2,5% Triton X-100 tre gange (20 minutter pr gang), derefter inkuberet i 24 timer ved 37 ° C, i inkubationspuffer [50 mM Tris (pH 7,5), 100 mM NaCl, 5 mM CaCl

2, og 1 uM ZnC

2]. Geler blev farvet med Coomassie Brilliant Blue R250 (Bio-Rad, USA) i 3 timer, og derefter skylles. Proteolytisk aktivitet blev afspejlet som klare bånd mod den blå baggrund af den farvede gelatine. Kontrol af belastningen gelatinezymografi: Coomassie Brilliant Blue R-250 farvning i 10% natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgel uden gelatine, til at vise samme mængde supernatant blev påsat hver bane

revers transkription-PCR

Totalt RNA blev ekstraheret fra AGS celler under anvendelse af TRIzol-reagens (Invitrogen). Et ug totalt RNA blev anvendt til første-streng komplementær DNA-syntese under anvendelse af tilfældige primere og M-MLV-transkriptase (Promega). Den komplementære DNA blev underkastet PCR-amplifikation med primersæt for GAPDH og MMP-9 med en PCR Master Mix-opløsning (intron, Korea). De specifikke primere sekvenser var som følger: GAPDH sense, 5′-TTG TTG CCA TCA ATG ACC CC-3 ‘og GAPDH antisense, 5′-TGA CAA AGT GGT CGT TGA GG-3’ (836 bp); og MMP-9 forstand, 5’AAG TGG CAC CAC CAC AAC AT-3 ‘og MMP-9 antisense, 5′-TTT CCC ATC AGC ATT GCC GT-3′ (497 bp); c-Jun sense, 5’-GGA AAC GAC CTT CTA TGA CGA TGC CCTCAA-3 ‘, og c-Jun-antisense, 5′-GAA CCC CTC CTG CTC ATC TGT CAC GTT CTT-3′ (287bp); c-Fos sense, 5’-CAG TCA GAT CAA GGG AAG CCA CAG ACA TCT-3 ‘og C-Fos antisense, 5′-GAA TAA GAT GGC TGC AGC CAA ATG CCG CA-3’ (246 bp). PCR-betingelserne var som følger:. Denaturering ved 94 ° C i 30 sekunder, annealing ved 52 ° C i 20 sekunder og ekstension ved 72 ° C i 30 sekunder

Måling af MMP-9 promotoraktivitet

transkriptionel regulering af MMP-9 blev undersøgt ved transient transfektion af en MMP-9-promotor-luciferase-reporterkonstruktion (pGL4-MMP-9). Plasmidet pGL4-MMP-9 promotor (spænder nukleotider fra -925 til 13) blev venligst stillet til rådighed af Dr. Young-Han Lee (Konkuk University, Korea). AGS celler blev podet og dyrket, indtil de nåede 70% konfluens. Derefter blev pGL4-MMP-9 promotor- plasmider transficeret i cellerne under anvendelse FuGENE 6 (Promega, USA) ifølge producentens protokol. PRL-TK blev transficeret som en intern kontrol. Celler blev inkuberet i transfektion medium i 12 timer og derefter behandlet med PMA i 4 timer. Virkningerne af chrysin på MMP-9 promotor-aktivitet blev bestemt ved forbehandling af celler med chrysin i 1 time før tilsætning af PMA. De co-transfektion blev udført i nærvær eller fravær af ekspressionsvektoren, der koder for dominante negative mutant MEK-1 (PMCL-K97M), dominant negativ mutant JNK (PMCL-TAM67), eller dominant negativ mutant p38 MAPK (PMCL-MP38 ), som venligt blev leveret af Dr. NG Ahn (University of Colorado-Boulder, CO), af Dr. M. J. Birrer (NCI, Rockville, MD), og af Dr. J. Han (Scripps Research Institute, CA), hhv. Cellerne blev høstet med en cellekultur-lysereagens (Promega, USA), og de luciferaseaktiviteterne blev bestemt ved anvendelse af et luminometer (Centro XS lb960 mikroplade luminometer, Berthold Technologies, USA) ifølge producentens protokol.

Forbigående transfektion af AP-1 reporter

AP-1 luciferase reporter plasmid blev indkøbt fra Clontech (Palo Alto, CA, USA). Når AGS cellerne nåede 60-70% konfluens, blev de vasket med Opti-MEM-medium og transficeret med en PGL-3 vektor indeholdende AP-1 reporter under anvendelse FuGENE 6 (Promega) ifølge fabrikantens protokol. Reporter-transficerede celler blev forbehandlet med chrysin i 1 time og derefter behandlet med 100 nM PMA i 4 timer, og de luciferaseaktiviteter blev målt ved anvendelse af et luminometer.

Transfektion af AP-1 lokkefugle oligodeoxynukleotider

baseret på AP-1-bindingssted ATGAGTCAT, vi designet AP-1 lokkefugle phosphorothioated dobbeltstrenget oligo deoxynukleotid (ODN’er) som følger, 5′-CGsT CTT CTG AGT CAT GAA TTC ATG ACT CAG AAG ACsG-3 ‘, og 3 ‘-GsCA GAA GAC TCA GTA CTT AAG TAC TGA GTC TTC TsGC-5’. Når AGS-celler voksede til 60-70% konfluens, AP-1 ODN’er og pGL4-MMP-9 promotor- plasmider blev co-transficeret ind i celler under anvendelse af Lipofectamine 2000 (Invitrogen, USA) ifølge producentens protokol. Efter inkubation i 20 timer blev de transficerede celler behandlet med PMA i 4 timer og de luciferaseaktiviteter blev målt ved anvendelse af et luminometer.

Western blot-analyse

AGS celler behandlet med PMA blev vasket i phosphat saltvand (PBS), fritliggende anvendelse af trypsin-EDTA-buffer og opbevaret ved -70 ° C indtil brug. Det cellulære protein blev ekstraheret med en RIPA-buffer [1% NP-40, 0,5% natriumdeoxycholat, 0,1% natriumdodecylsulfat (SDS)] og proteasehæmmere (aprotinin, leupeptin, phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF), benzamidin, trypsininhibitor, natriumorthovanadat ). Halvtreds mikrogram af proteinerne blev derefter adskilt ved 10% SDS-polyacrylamidgelelektroforese og overført til Hybond-P-membraner (Amersham Pharmacia Biotech). Membranerne blev blokeret i en TBST-opløsning indeholdende 5% skummetmælk, inkuberet med et primært antistof i en blokeringsopløsning natten over ved 4 ° C, og vasket tre gange med 0,1% Tween-20 i Tris-pufret saltvand (TBST) 10 minutters intervaller . Peberrodsperoxidase-konjugeret sekundært antistof (Amersham, Arlington Heights, IL, USA) blev anvendt til at detektere de immunreaktive proteiner ved kemiluminescens. Følgende antistoffer blev anvendt: anti-phospho-p44 /42 MAPK (ERK-1/2) (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA), anti-phospho-JNK /SAPK (Cell Signaling Technology), anti-MMP- 9 (Cell Signaling Technology), anti-phospho-c-Fos (Cell Signaling Technology), og anti-phospho-c-Jun (Cell Signaling Technology). De totale proteinniveauer blev analyseret ved vask af blottede membran med en stripning opløsning sammensat af 100 mM 2-mercaptoethanol, 2% SDS og 62,5 mM Tris-HCI (pH 6,7) i 30 minutter ved 50 ° C, og membranen blev derefter re-probet med enten anti-β-actin (Cell Signaling Technology), anti-total ERK1 /2 (Cell Signaling Technology), anti-total JNK /SAPK (Cell Signaling Technology), anti-c-Fos (Santa Cruz Biotechnology , Inc., CA, USA) eller anti-c-Jun (Santa Cruz).

Matrigel invasion assay

celleinvasion assay blev udført under anvendelse af 10-brønds chemotasis kammer (Neuro probe, Gaithersburg, Maryland, USA) med 8 uM pore membran (Neuro probe) med 10% FBS indeholdende RPMI som kemoattraktanten i det nedre kammer. AGS celler (10

5 i 280 pi) blev tilsat til øvre kammer med PMA i nærvær af chrysin, MMP-9 antistof eller ikke-specifikt IgG og inkuberet at invadere Matrigel i 24 timer. For at bestemme virkningen af ​​chrysin og signaler inhibitorer på PMA-induceret celleinvasion, AGS celler blev præ-inkuberet med chrysin, curcumin, PD98059, eller SP600125 i 1 time og inkuberet med PMA i 24 timers invasion periode. De ikke-invaderende celler på den øvre overflade af hver membran blev fjernet fra kammeret, og de invaderende celler på den nedre overflade af hver membran blev farvet med Quick-Diff plet kit (Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA) . Efter to vand vaske blev kamrene lov at lufttørre. Antallet af indtrængende celler blev talt under anvendelse af et fasekontrastmikroskop.

Statistik

Data er vist som middelværdi ± SD, og ​​repræsenterer middelværdien af ​​mindst tre separate forsøg udført tredobbelt. Forskelle mellem hver to datasæt blev bestemt ved t-tests. Forskelle, der er beskrevet som væsentlige i teksten svarer til

P

. 0,05

Resultater

hæmmende virkning af chrysin på PMA stimulerede MMP-9 udtryk

for at undersøge den undertrykkende effekt af chrysin mod opregulering af MMP-9 blev AGS celler forbehandlet med chrysin inkuberet med PMA, og gelatinezymografi og RT-PCR-analyse blev udført. Som vist i fig 1A, PMA-stimulerede MMP-9 blev inhiberet af chrysin på en dosis-afhængig måde som illustreret via gelatinezymografi assay. Forud for vores eksperiment, også chrysin direkte inhiberede aktiviteten af ​​MMP-9 eller inhiberes ekspressionen af ​​MMP-9 var stadig ukendt. For at besvare dette spørgsmål, vi co-inkuberes AGS-udskilte MMP-9 med chrysin i 3 timer, og gelatinezymografi blev udført for at kontrollere det endelige niveau for MMP-9-aktivitet. Som figur 1B viser, kunne chrysin ikke påvirke udskilles MMP-9 aktiviteter. Så vi den hypotese, at inhiberingen af ​​chrysin mod MMP-9 kan være via suppression af MMP-9-ekspression. For at verificere denne hypotese, revers transkriptionel PCR og MMP-9 promotor- assays blev udført for at kontrollere de MMP-9 transskriptionsniveauer. Som vist i fig 1C, efter at være blevet behandlet med chrysin, PMA-induceret MMP-9 mRNA faldt på en dosis-afhængig måde. Endvidere blev MMP-9 promotor luciferaseaktivitet inhiberes af chrysin på en dosis-afhængig måde (figur 1D). Og western blotting viste også den inhiberende virkning af chrysin på MMP-9-ekspression (Fig 1E). Koncentrationerne af chrysin anvendt i den foreliggende undersøgelse påvirkede ikke cellernes levedygtighed (Fig 1F). Disse resultater indikerer, at chrysin inhiberer MMP-9-aktivitet i AGS celler via en reduktion af den transkriptionelle effektivitet.

I alt 2 × 10

6 celler forbehandlet med de angivne koncentrationer af chrysin i 1 time blev behandlet med 100 nM PMA i 20 timer. Efter inkubation blev celledyrkningsmedier supernatant opsamlet og gelatinezymografi blev udført for at analysere MMP-9-aktivitet (A). Cellekulturmediet indeholdende AGS celler secernerede MMP-9 blev inkuberet med forskellige koncentrationer af chrysin i 37 ° C i 3 timer, derefter gelatinezymografi blev udført for at analysere de endelige MMP-9-aktivitet (den første bane, indlæsning af en kontrol, indeholdt den cellekulturmedier supernatant uden inkubation med chrysin) (B). Celler forbehandlet med de angivne koncentrationer af chrysin for 1 time blev behandlet med 100 nM PMA i 4 timer. Efter inkubering blev RT-PCR udført for at analysere MMP-9 mRNA. #

P

0,05 versus kontrol; *

P

0,05 mod kun PMA (C). Celler blev transient transficeret med en pGL4-MMP-9-promotor reporter konstrukt. De transficerede celler blev forbehandlet med de angivne koncentrationer af chrysin i 1 time og derefter inkuberet med 100 nM i 4 timer, på hvilket tidspunkt luciferaseaktivitet blev bestemt ved anvendelse af et luminometer. #

P

0,05 versus kontrol; *

P

0,05 mod kun PMA (D). Celler forbehandlet med de angivne koncentrationer af chrysin for 1 time blev behandlet med 100 nM PMA i 8 timer. Efter inkubering blev western bolt udført for at analysere MMP-9-protein-niveau. #

P

0,05 versus kontrol; *

P

0,05 mod kun PMA (E). Cellerne blev co-inkuberet med 0-80 uM chrysin i 24 timer, og derefter deres levedygtighed blev testet ved MTT metoden. *

P

0,05 versus kontrol (uden chrysin) (F). Dataene repræsenterer middelværdien ± SD fra tredobbelte målinger.

rolle AP-1 i PMA-induceret MMP-9-ekspression

Som rapporteret af tidligere litteratur, AP-1 er den vigtigste transkriptionsfaktor i MMP-9-ekspression [17]. I denne undersøgelse at bekræfte, at AP-1 er kritisk kræves i dette kursus, vi ansat en AP-1 lokkefugle phosphorothioated dobbelt oligodeoxynukleotid (ODN’er) og pGL3-AP-1 luciferase plasmid at co-transficere i AGS celler. De co-transficerede celler blev behandlet med PMA, og de luciferaseaktiviteterne blev bestemt ved anvendelse af et luminometer. Som vist i figur 2A, blev PMA-inducerede MMP-9 promotor- luciferaseaktiviteter inhiberet af AP-1-attrap. Konsekvent, AP-1-attrap inhiberede også PMA-induceret MMP-9 mRNA-ekspression (Fig 2B). Det blev vist, at vælte AP-1 komponent c-Fos og c-Jun faldt også PMA-induceret MMP-9-ekspression (fig 2C). Endvidere curcumin, en AP-1-inhibitor, også blev anvendt til at kontrollere den rolle, AP-1 i PMA-induceret MMP-9-ekspression. Som RT-PCR-data illustrerer, curcumin hæmmede PMA-induceret MMP-9 ekspression i en dosisafhængig måde (Fig 2D). De ovennævnte data viste, at AP-1 er den afgørende faktor i MMP-9-ekspression. Efter at demonstrere den afgørende rolle, AP-1 i de høje niveauer af MMP-9 udtryk, vi hypotese, at mekanismen for chrysin hæmning af MMP-9-ekspression var gennem undertrykkelse af AP-1-aktivitet. Efterfølgende blev AGS celler transficeret med AP-1 luciferase reporter plasmider forbehandlet med chrysin, og derefter stimuleret med PMA. Som vist i fig 2E, chrysin undertrykt PMA-induceret AP-1lucifease aktivitet på en dosis-afhængig måde, hvilket indikerede, at chrysin har en evne til at reducere AP-1-aktivitet.

AP-1-attrap oligonukleotid blev co transficerede med en pGL4-MMP-9-promotor i AGS celler. Efter inkubation med 100 nM PMA i 4 timer blev MMP-9 promotor luciferaseaktivitet undersøgt ved anvendelse af et luminometer (A), og MMP-9 mRNA blev undersøgt ved RT-PCR (B). #

P

0,05 versus kontrol; *

P

0,05 mod kun PMA. C-Jun og c-Fos siRNA transficerede AGS celler blev inkuberet med 100 nM PMA i 4 timer, og efter cellehøst MMP-9 mRNA blev undersøgt ved RT-PCR. #

P

0,05 versus kontrol; *

P

0,05 mod kun PMA (C). AGS celler forbehandlet med den angivne koncentration af curcumin i 1 time blev inkuberet med 100 nM PMA i 4 timer. Efter inkubering blev MMP-9 mRNA i cellelysaterne bestemt ved RT-PCR. #

P

0,05 versus kontrol; *

P

0,05 mod kun PMA (D). De pGL3-AP-1 transficerede celler blev forbehandlet med de angivne koncentrationer af chrysin i 1 time og derefter inkuberet med 100 nM PMA i 4 timer, og AP-1 luciferaseaktivitet blev bestemt ved anvendelse af et luminometer. #

P

0,05 versus kontrol; *

P

0,05 mod kun PMA (E). AGS celler forbehandlet med de angivne koncentrationer af chrysin for 1 time blev inkuberet med 100 nM PMA i 4 timer. Efter inkubation blev c-Jun og c-Fos mRNA i cellelysaterne bestemt ved RT-PCR (F). Celler forbehandlet med de angivne koncentrationer af chrysin blev inkuberet med 100 nM PMA, og cellelysater blev analyseret for den phosphorylerede c-Jun (G), phosphorylerede c-Fos (H), total c-Jun og total c-Fos ved western-blot analyse. #

P

0,05 versus kontrol; *

P

0,05 mod kun PMA. Ovenstående data repræsenterer middelværdien ± SD fra tredobbelte målinger.

Chrysin inhiberer PMA-induceret MMP-9-ekspression ved at inhibere transkriptionsfaktor AP-1 via undertrykkelse af c-Jun og c-Fos phosphorylering

det er velkendt, at c-Jun og c-Fos er komponenter af AP-1-vejen [18]. Vi ønskede at bestemme mekanismen bag chrysin hæmmende virkning på AP-1, og undersøgt, om chrysin faktisk udøvet sin virkning på c-Jun og c-Fos. Vi målte mængden af ​​total mRNA fra både c-Jun og c-Fos ved RT-PCR. Som vist i fig 2F, havde chrysin ikke inhiberer ekspressionsniveauerne af c-Jun og c-Fos mRNA. Dernæst at teste om chrysin inhiberer aktiveringen af ​​c-Jun og c-Fos, blev western blotting udført for at overvåge den phosphorylerede c-Jun og c-Fos. Fig 2G og 2F viser, at chrysin gjorde undertrykke PMA-induceret c-Jun og c-Fos phosphorylering på en dosis-afhængig måde.

Chrysin inhiberer c-Jun og c-Fos phosphorylering ved at blokere JNK og ERK-signalering pathway

Vi næste undersøgt, hvordan chrysin undertrykt c-Jun og c-Fos fosforylering. På grund af den vigtige rolle MAPK spiller i aktiveringen af ​​AP-1, undersøgte vi den rolle, som MAPK-vejen i MMP-9-ekspression. Som vist i fig 3A, blandt MAPK’er inhibitorer, PD98059 (ERK1 /2-inhibitor), SP600125 (JNK1 /2-inhibitor), og SB203580 (p38 MAPK inhibitor), kun PD98059 og SP600125 kunne inhibere PMA-induceret MMP-9-ekspression , hvilket viste, at ERK1 /2-og JNK1 /2 veje kan være afgørende for PMA-induceret MMP-9 udtryk. Endvidere med MEK-dominant negative plasmid PMCL-K97M, JNK-dominant negative plasmid PMCL-TAM67 og p38 MAPK-dominant negative plasmid PMCL-MP38, bekræftede vi de kritiske roller ERK og JNK i MMP-9 udtryk i gastrisk kræft AGS celler (fig 3b). Som vist i fig 3C, ERK1 /2 og JNK1 /2 er kritisk påkrævet for AP-1-aktivering med PMA, påvises gennem vort eksperiment med MEK og JNK dominant negative plasmider. Vi næste kontrolleret roller JNK1 /2 og ERK1 /2 i c-Jun og c-Fos aktivering. Som vist i fig 3D, SP600125 og PD98059 undertrykte PMA-induceret c-Jun og c-Fos-phosphorylering, hvilket viser, at JNK1 /2 er kritisk opstrøms for c-Jun, mens ERK1 /2 er kritisk opstrøms for c-Fos. Da vi opdagede, at JNK1 /2 og ERK1 /2 spillede væsentlige roller i MMP-9-ekspression via AP-1, vi hypotese, at chrysin kan arbejde gennem en inhibering af JNK1 /2 eller ERK1 /2 til at undertrykke MMP-9-ekspression. For at verificere vores hypotese, blev western blotting udført for at bestemme virkningen af ​​chrysin på JNK1 /2 eller ERK1 /2 phosphorylering. Som fig 3E og 3F viser, at PMA-behandling førte til en bemærkelsesværdig stigning i JNK1 /2 og ERK p42 /44 phosphorylering; men i nærvær af chrysin, PMA-induceret JNK1 /2 og ERK1 /2-phosphorylering blev inhiberet på en dosis-afhængig måde. Salg

Celler forbehandlet med en koncentration på 50 uM PD98059 (PD), 50 uM SP600125 (SP ) eller 20 uM SB203580 (SB) i 1 time blev inkuberet med 100 nM PMA i 4 timer. Efter inkubering blev MMP-9 mRNA i cellelysaterne bestemt ved RT-PCR. #

P

0,05 versus kontrol; *

P

0,05 mod kun PMA (A). Ekspressionsvektorer, der koder en dominant negativ mutant MEK (K97M), mutant JNK (TAM67), eller mutant p38 MAPK (MP38) blev co-transficeret med pGL4-MMP-9-promotor-konstruktioner ind AGS celler. Efter inkubation med 100 nM PMA i 4 timer blev luciferaseaktivitet bestemmes ved anvendelse af et luminometer. Dataene repræsenterer middelværdien ± SD fra tredobbelte målinger. #

P

0,05 versus kontrol; *

P

0,05 mod kun PMA (B). Expression PMCL tom vektor, der koder for en dominant negativ mutant MEK (K97M) eller mutant JNK (TAM67) blev co-transficeret med pGL3-AP-1 luciferase-konstruktion i AGS celler. Efter inkubation med 100 nM PMA i 4 timer blev luciferaseaktivitet bestemmes ved anvendelse af et luminometer. Dataene repræsenterer middelværdien ± SD fra tredobbelte målinger. #

P

0,05 versus kontrol; *

P

0,05 mod kun PMA (C). AGS-celler forbehandlet med 50 pM PD98059, 50 uM SP600125, og 20 uM SB203580 blev inkuberet med 100 nM PMA, og cellelysater blev analyseret for den phosphorylerede c-Jun og phosphoryleret c-Fos ved western blot-analyse. #

P

0,05 versus kontrol; *

P

0,05 mod kun PMA (D). AGS-celler forbehandlet med angivne koncentration af chrysin blev inkuberet med 100 nM PMA, og cellelysater blev analyseret for den phosphorylerede JNK1 /2 og phosphoryleret p42 /44 ved Western blot analyse. #

P

0,05 versus kontrol; *

P

. 0,05 mod kun PMA (E og F)

Effekt af chrysin på celle invasiv

Det har været kendt, at høje niveauer af MMP -9 udtryk er vigtige for invasiv fænotype af cancerceller. For at undersøge effekten af ​​chrysin på PMA-induceret celleinvasion, undersøgte vi celleinvasion gennem et modificeret Boyden invasion kammer. AGS-celler inkuberet i PMA resulterede i et øget antal invaderede celler, som passerede gennem den kunstige matrigel. Men i nærværelse af chrysin eller MMP-9 antistof, antallet af besatte celler faldt, hvilket indikerer chrysin kan undertrykke PMA-induceret celle invasionsevne ved at inhibere MMP-9-ekspression (fig 4A og 4B). Desuden viste Fig 4C chrysin faldt PMA-induceret AGS invasion på en dosis-afhængig måde. Dernæst undersøgte vi effekten af ​​signal- inhibitoren på PMA-induceret AGS celleinvasion. Som vist i fig 4D, chrysin, curcumin, PD98059 og SP600125 inhiberede celleinvasion induceret af PMA, hvilket indikerer, at chrysin sandsynligvis hæmmer PMA-induceret MMP-9 via AP-1 suppression, hvilket resulterer i at blokere JNK1 /2 og ERK1 /2 veje .

Celler blev inkuberet med 50 nM PMA i nærvær eller fravær af 30 uM chrysin eller 200 ng /ml MMP-9 antistof i BIOCOAT Matrigel apparat i 24 timer (A og B). Celler blev inkuberet med 50 nM PMA i nærvær af 0-50 uM chrysin (C). Celler blev inkuberet med 50 nM PMA i nærvær af 30 uM chrysin, 20 pM curcumin, og enten 30 uM PD98059 (PD) eller 30 pM SP600125 (SP) (D). Efter inkubering af cellerne invaderede undersiden af ​​kamrene og blev talt under anvendelse af et fasekontrast lysmikroskop efter farvning med et Diff-Quick Stain Kit. Dataene repræsenterer middelværdien ± SD fra tredobbelte målinger. #

P

0,05 versus kontrol; *

P

. 0,05 mod kun PMA

Diskussion

Naturligt forekommende forbindelser med anti-cancer aktiviteter forstyrrer tumor udvikling og progression af kræft ved at hæmme forskellige mekanismer, herunder cellemigration, invasion og metastase. Chrysin, en naturlig flavonoid bredt findes i mange vegetabilske ekstrakter, honning og propolis, har kemoforebyggende egenskaber, såsom antiproliferative og pro-apoptose-aktiviteter mod forskellige kræftformer [19,20]. Imidlertid er de anti-invasion egenskaber chrysin er ikke blevet godt undersøgt i gastriske cancerceller. Det er velkendt, at MMP’er er den kraft bag ødelæggelsen af ​​den ekstracellulære matrix, samt de vigtigste inducere af celle invasionsevne. Vi undersøgte de inhiberende virkninger af chrysin på MMP’er ekspression i gastriske cancerceller. Chrysin inhiberede MMP-9-ekspression (figur 1) og andre MMP’er, såsom MMP-2 og MMP-7 (data ikke vist). Reguleringen mekanisme, chrysin kan afhang hver MMP, og i denne undersøgelse vi fokusere på MMP-9 regualtion.

PMA, phorbol-12-myristat-13-acetat, en proteinkinase aktivator, er almindeligt anvendt som et biomedicinsk forskning værktøj i modeller for carcinogenese. I denne undersøgelse opdagede vi PMA øget MMP-9-aktivitet ved opregulering af dets ekspressionsniveau. I nærvær af chrysin, PMA-induceret MMP-9 faldt i en chrysin-dosis-afhængig måde (figur 1A).