PLoS ONE: intraperitoneal Hypertermi kombinere α-galactosylceramid i Behandling af kræft i æggestokkene

Abstrakt

Formålet med denne undersøgelse var at undersøge anti-tumor effekt og potentielle mekanismer i.p. hypertermi i kombination med α-galactosylceramid (α-GalCer) til behandling af ovariecancer. I denne undersøgelse blev immunkompetente tumormodeller etableret under anvendelse af murine ovarian cancer cellelinjer og behandlet med i.p. hypertermi kombinerer α-GalCer. Th1 /Th2 cytokin ekspression i serummet, NK-celle cytotoksicitet og fagocytiske aktiviteter af dendritiske celler (DC’er) blev analyseret. Vi analyserede også antallet af CD8

+ /IFN-γ

+ tumor specifikke cytotoksiske T-celler, samt tumor vækst baseret på udtømning af lymfocyt delpopulation. Terapeutisk virkning på disse ovarietumorer blev overvåget ved en ikke-invasiv luminescerende imaging system. Intra-peritoneal hypertermi inducerede markant pro-inflammatoriske cytokiner udtryk, og vedvarende respons NK og DCS induceret af α-GalCer behandling. Kombinationsbehandlingen forøgede immunrespons cytotoksiske T-lymfocyt (CTL) i to mus ovariecancer modeller. Denne hidtil ukendte behandlingsmodalitet ved kombination af hyperthermi og glycolipid giver en udtalt anti-tumor immunrespons og bedre overlevelse. Konklusionen er, intraperitoneal hypertermi forstærkede den pro-inflammatoriske cytokin-sekretion og fagocytisk aktivitet af DC’er stimuleret med α-GalCer. Den efterfølgende CTL immunrespons fremkaldt af α-GalCer blev yderligere styrket ved at kombinere med i.p. hypertermi. Både medfødte og adaptive immunitet var involveret, og resulterede i en overlegen terapeutisk virkning ved behandling af ovariecancer

Henvisning:. Wu C-C, Chuang Y-T, Hsu Y-T, Huang J-T, Wu T-C, Hung C-F, et al. (2013) intraperitoneal Hypertermi kombinere α-galactosylceramid i Behandling af kræft i æggestokkene. PLoS ONE 8 (7): e69336. doi: 10,1371 /journal.pone.0069336

Redaktør: Moriya Tsuji, Aaron Diamond AIDS Research Center med Rockefeller University, USA

Modtaget: Februar 15, 2013; Accepteret: 7 juni 2013; Udgivet: 23 Jul 2013

Copyright: © 2013 Wu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne forskning blev støttet af en bevilling fra Taiwan National Science Council (NSC 98-2314-B-195-008-MY3). Den bidragyder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Selvom kræft i æggestokkene udgør kun 3% af alle maligne sygdomme hos kvinder, er det den mest dødbringende gynækologisk malignitet verdensplan [1]. På grund af mangel af specifikke symptomer eller tegn og manglen på pålidelige screening modaliteter i tidlig sygdom, er kræft i æggestokkene meste diagnosticeret på et fremskredent stadium [2] – [4]. I øjeblikket er den standard upfront behandling for epitelial ovariekræft består af maksimal cytoreduktive kirurgi efterfulgt af adjuverende kemoterapi med platin-taxan kombinationsbehandling. Selvom svarprocenter er omkring 70-80%, vil de fleste af disse patienter med tiden tilbagefald. Trods det stigende antal kemoterapeutiske lægemidler til rådighed for tilbagevendende sygdom, er forløbet af ovariecancer sædvanligvis karakteriseret ved gentagne perioder med remission og tilbagefald, og i de fleste tilfælde vil sygdommen tiden udvikle resistens over for alle kemoterapeutiske midler og blive uhelbredelig [5]. Baseret på den biologiske adfærd og spredningsmønster af ovariecancerceller, flere i.p. behandlingsmetoder er blevet slået til lyd for at opnå bedre sygdomsbekæmpelse [6]. Blandt dem, i.p. hypertermi, især når de kombineres med kemoterapi, har vist sig at forbedre den terapeutiske virkning for enten optimalt eller sub-optimalt debulked æggestokkræft [7], [8]. Det er blevet rapporteret, at høj temperatur kunne fremkalde direkte termisk cytotoksicitet og også bringe “termisk kemo-sensibilisering” [9]. Det er den generelle opfattelse, at overfølsomhedsreaktioner resultater fra øget vævsperfusion og væv gennemtrængning af cytotoksiske midler. Selvom de grundlæggende mekanismer i hypertermi er generelt godt accepterede, anvendelse af terapeutiske hypertermi i forbindelse med kemoterapi til patienterne er langt mere kompleks [10]. Hypertermisk kemoterapi (42-43 ° C) har været kendt for at være forbundet med større cytotoksicitet for cancerceller. Men der er nogle ulemper, der begrænser dens anvendelse til behandling af kræft i æggestokkene, såsom potentiel dårlig heling af tarm anastomose, risiko for kemoterapeutiske metabolitter forurening til de kirurgiske personale gennem kropsvæsker eller indånding af fordampende kemoterapeutiske stoffer [11]. Desuden kan det ikke anvendes gentagne gange, uden udforskning af bughulen.

hypertermi selv er blevet vist at udøve en række cellulære og molekylære effekter, især i fremkomst af de komplekse immunologiske ændringer i værten [12], [ ,,,0],13]. Navnlig hypertermi er i stand til at opregulere ekspressionen af ​​varmechokprotein i tumorcellerne, og som er forbundet med antigenpræsentation, cross præsentation og anti-tumor immunitet [14]. Alle disse data giver rationalet ved styrke antitumorvirkninger af hypertermi ved kombination med immun-modulerende midler.

glycolipid såsom α-galactosylceramid (KRN7000, α-GalCer, et glycosphingolipid) har vist sig at hæmme tumorvækst og forlænge overlevelsen i et par musetumormodeller gennem aktivering af medfødte og adaptive immunrespons [15], [16]. Adskillige kliniske forsøg har også dokumenteret dets sikkerhed og biologiske effekter hos patienter med solide tumorer gennem parenteral levering [17], [18]. Denne forbindelse sig selv er ikke et cytotoksisk middel, men kan præsenteres for NKT-celler ved CD1d [19], [20]. α-GalCer -aktiverede NKT-celler blev rapporteret at secernere store mængder af cytokiner, herunder IFN-γ og IL-4, og derved aktivere andre effektorer celler, såsom NK-celler, T-celler, B-celler, DC’er og makrofager [16]. Administrationen af ​​α-GalCer i dyr kunne også inducere produktion af andre cytokiner, såsom IL-2, IL-6, IL-12, og GM-CSF, som også kan styrke immunsystemet [21].

Vi hypotese, at hypertermi er ikke kun cytotoksisk men også i stand til at afsløre immunogeniciteten af ​​tumorceller, dirigere immunresponset over mikromiljø til begge Th1 /Th2 pathways. Vi foreslog, at tilsætning af α-GalCer kan inducere aktiveringen af ​​NKT-celler samt modning af DC’er. Efter behandling med α-GalCer, er en stærk cytokin kaskade efterfølgende fremkaldt derved øge krydstale mellem medfødte og adaptive anti-tumor immunrespons.

I denne undersøgelse har vi udnyttet forskellige murine ovariecancerceller som modeller til at teste vores hypoteser og at undersøge anti-tumor effekt og underliggende mekanismer af ip hypertermi kombineret med α-GalCer i behandlingen af ​​ovariecancer.

Materialer og metoder

Mus og cellelinie

C57BL /6-mus og BC3F1 (C57BL /6 × C3H F1) mus blev fremskaffet fra BioLASCO, Taiwan. Dyrene blev passet under specifikke patogenfrie betingelser. Musen æggestokkræft cellelinie MOSEC-luc (C57BL /6 oprindelse og manipuleret udtryk for ildflue luciferase), ID8-luc (afledt af MOSEC-luc med VEGF overekspression), og HM-1 (BC3F1 oprindelse) blev dyrket i RPMI1640 medium (Gibco) suppleret med 10% FBS (Biological Industrial, Israel), 100 U /ml penicillin (Gibco) og 100 pg /ml streptomycin (Gibco) i en fugtig atmosfære af 5% CO

2/95,% luft ved 37 ° C.

Etik Statement

Alle forsøgene fulgte retningslinjerne med hensyn til eksperimentel dyrevelfærd og blev tilladt af IUAUC af Mackay Memorial Hospital (MMH-AS-97030).

Intra-peritoneal Hypertermi og α-GalCer Behandling

For at udføre ip hypertermi, blev sonderende laparotomi udføres efter musene blev bedøvet med Zoletil (VIRBAC, Frankrig) og Rompun (Bayer Vital GmbH, Leverkusen) først. Bughulen af ​​hver mus blev konstant fyldt med 45 ° C 1 × PBS. Opvarmet PBS var genpåfyldes at erstatte afkølet PBS ved frekvensen af ​​20~30 sek /cyklus for i alt 10 minutter. I den kombinerede gruppe behandling blev 2 ug α-GalCer (Enzo Life science, USA) tilsat ind i bughulen umiddelbart efter afslutningen af ​​hypertermi. Peritonealhulen blev også åbnet i 10 minutter i kontrolgruppen af ​​mus. Mus blev holdt varm under varmelegeme lys indtil de udvundet fra anæstesi.

Multiplex Serum Cytokine Detection

veneblod høstet fra halen af ​​hver mus blev inkuberet ved 37 ° C i 30 minutter og derefter centrifugeret ved 1500 x g i 10 min. Supernatanten serum blev overført til et andet rent rør og opbevaret ved -20 ° C før analyse. Koncentrationen af ​​IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-13, INF-α og TNF-α i serum hos hver mus blev påvist ved BD cytometrisk Bead Array kit (BD Bioscience) som beskrevet af fabrikanten.

Primært Cell Isolation og NK /NKT Cell Detection

i isolering af de hvide blodlegemer (WBC), det perifere blod blev opsamlet fra halevenen af ​​mus. RBC’erne i blod blev fjernet ved ACK lysis buffer (Invitrogen), og de hvide blodlegemer blev derefter resuspenderet i RPMI 1640 inden analyse. Til isolering af cellerne i bughulen, blev musene aflivet ved CO

2 eutanasi. Celler i peritonealhulen blev opsamlet ved peritoneal udskylning med 3% BSA i koldt 1 × PBS. Celler udvundet fra udskylning blev vasket og resuspenderet i RPMI 1640-medium. Celler blev derefter farvet ved FITC-anti-CD3 og PE-anti-NK1.1 antistof som fremstilling beskrevet (eBioscience). De populationer af NK og NKT-celler blev påvist ved flowcytometri. (Calibur, BD Bioscience). Resultaterne blev analyseret ved FACS udtrykkelig software.

påvisning af kræft Cell Apoptose

En million af ID8-Luc celler blev injiceret intraperitonealt i hver C57BL /6 mus i forsøgsgruppen. Tre dage senere, i.p. hypertermi blev givet i tumorbærende mus som beskrevet tidligere. Ingen intervention blev udført i kontrolgruppen af ​​mus undtagen åbning /lukning af bughulen. En dag senere blev musene aflivet af CO

2 eutanasi. Celler inde bughulen blev udskylles og farvet med Annexin V-APC og propidiumiodid (PI, BD Bioscience), og derefter underkastet analyse ved flowcytometri.

cytotoksicitet Peritoneale Effekt celler

tyve tusinde ID8-Luc celler blev podet i hver brønd på rundbundede plader med 96 brønde som målceller. Disse plader blev forseglet med paraffin og sat på væskeoverfladen på 42 ° C vandbad og inkuberet i 20 min. De udskyllet celler (fra kontrolgruppen eller α-GalCer-behandlede gruppe af mus) som effektorer celler blev derefter tilsat til ID8-luc celle indeholdende godt med effektorer /target (E /T) forhold på 05:01 og 10:01 og dyrket ved 37 ° C natten over. Efter tilsætning luciferin (Caliper), blev mængden af ​​overlevede ID8-Luc celler præsenteret som intensiteten af ​​chemoluminescens detekteret af IVIS imaging system. (Xenogen).

dendritceller Fagocytose Assay

in vitro

To mikrogram α-GalCer var i.p. injiceret i C57BL /6-mus og efterladt natten over. Musene med og uden α-GalCer behandling blev aflivet, og miltene blev overført til RPMI 1640-medium. De splenocytter blev isoleret ved smashing miltene på 100 um cellefilter i 6 cm skål indeholder 5 ml RPMI1640 medium. De suspenderede celler blev vasket og RBC’erne blev fjernet ved ACK lysis buffer (Invitrogen). De DC’er i disse splenocytter blev renset ved anti-CD11c magnetiske perler (MACS, Tyskland). For fagocytose assay blev ID8-Luc celler farvet med 25 pM CFSE (Sigma) og derefter fik varmebehandling som tidligere beskrevet. Oprensede DC’er fra kontrolgruppen eller α-GalCer-behandlede gruppe af mus blev derefter co-dyrket med 1 × 10

5 af enten opvarmede eller ikke-opvarmede CFSE-farvede ID8-Luc celler i 6 timer. DC’er var mærkning ved farvning med APC-anti-CD11 c-antistof (eBioscience). Procentdelen af ​​CFSE-positive DC’er blev analyseret ved flowcytometri med gating af CD11c-positive celler.

dendritisk celle Fagocytose Assay

in vivo

En million af CFSE-farvet (25 uM) ID8-luc celler blev ip injiceret i C57BL /6-mus. På de næste dage blev alle mus opdelt i 4 grupper og givet i.p. hypertermi og /eller 2 pg af a-GalCer. Mus fik laparotomi kun (uden lægemiddelbehandling) blev oprettet som kontrolgruppe. Efter 24 timer blev de intra-peritoneale celler udskylles og farvet med PE-anti-muse CD11 og APC-anti-muse CD11c antistoffer (eBioscience). Procentdelen af ​​CFSE-positive DC’er blev analyseret ved flowcytometri ved gating af CD11b

+ /CD11 c

+ positive celler.

tumorspecifikke CD8

+ T-celle Immunoassay

En million af HM-1 celler var ip injiceret i B6C3F1 mus og 3 × 10

5 i ID8-Luc celler blev injiceret intraperitonealt i C57BL /6-mus. Tre dage senere blev musene bedøvet og behandlet i.p. med eller uden α-GalCer. Efter en eller tre uger blev musene aflivet til isolering splenocytterne. Splenocytter (1 × 10

7) blev dyrket med eller uden 1 × 10

5 i syngenetic cancerceller (dem var blevet injiceret i det peritoneale hulrum i mus) med 1 ug Golgi-stik (BD Pharmingen ) i 24-brønds plader. Den næste dag blev cellerne farvet med APC-konjugeret monoklonalt rotte-anti-muse CD8a (eBioscience) i 20 minutter, og fikseret med Cytofix /Cytoperm Kit (BD Pharmingen), efterfulgt af farvning med FITC-konjugeret rotte-anti-muse-interferon -γ (eBioscience) som fremstilling beskrevet. Antallet af CD8 /interferon-y-positive celler blev analyseret ved flowcytometri.

Ikke-invasiv tumorvækst Måling

En million af MOSEC-Luc celler blev i.p. injiceret i C57BL /6-mus. Efter en uge, i.p. hypertermi blev udført med eller uden α-GalCer behandling. Tumor vækst i MOSEC-Luc celler i mus blev opdaget af non-invasiv kemoluminescens imaging system (IVIS, Xenogen).

Udtømning lymfocyt Sub-populationer

En million MOSEC-Luc celler i.p. injiceret i C57BL /6-mus. Fem dage senere blev musene opdelt i 4 grupper og modtog i.p. injektion af enten 100 ug anti-muse CD4 (klon GK1.5), anti-muse CD8 (klon TIB210) eller rotte-IgG-kontrol (Millipore) antistoffer ved en 2-dages interval. Alle musene fik i.p. hypertermi kombineret med 2 ug α-GalCer en uge efter podning med tumoren. Tumorvækst blev målt ved ikke-invasiv IVIS imaging system som tidligere beskrevet.

Statistik Salg

Alle resultater var repræsenteret ved gennemsnit ± SE (standardfejl) fra mindst to uafhængige forsøg. Er sammenligninger mellem forskellige datapunkter blev udført ved anvendelse af ANOVA-test eller en Students t-test. Overlevelsen var repræsenteret af Kaplan-Meier-kurve og sammenlignes ved hjælp af lange rank analyse.

Resultater

Intra-peritoneal Hypertermi Forbedret Sekretion af Pro-inflammatoriske cytokiner induceret af α-GalCer

de vigtigste antitumorvirkninger af α-GalCer menes at være gennem modulering downstream immune kaskader ved at stimulere Th1 /Th2 cytokinproduktion af NKT-celler. Undtagen IL-5, i.p. hypertermi yderligere forbedret sekretion af disse seks cytokiner oprindelig fremkaldt ved i.p. a-GalCer behandling. Vi først undersøgt, om tilsætning af i.p. hypertermi er i stand til at påvirke ekspressionen af ​​disse cytokiner stimuleret af α-GalCer installation. Figur 1 viser, at i.p. hypertermi alene ændrede ikke niveauerne af Th1 /Th2 cytokiner, hvorimod i.p. a-GalCer administration udløste sekretion af adskillige cytokiner, som nåede det højeste niveau på forskellige tidspunkter. Niveauer af IL-2 (p = 0,0003, α-GalCer

versus

kontrol), IL-4 (p = 0,0012, α-GalCer

versus

kontrol), IL-6 (p 0,0001, α-GalCer

versus

kontrol), og væv nekrotisk faktor alfa (TNF-α) (p = 0,0007, α-GalCer

versus

kontrol) toppede i 6 timer, mens IL 5 og IL-13 toppede i 12 timer (p = 0,0013, α-GalCer

versus

kontrol for IL-5; p 0,0001, α-GalCer

versus

kontrol for IL-13) . Det tog op til 24 timer for IFN-γto nå sit højeste niveau (p 0,0001, α-GalCer

versus

kontrol). Undtagen IL-5, i.p. hypertermi yderligere forbedret sekretion af disse fem cytokiner oprindelig fremkaldt ved i.p. α-GalCer behandling (p = 0,0056, for IL-2, p = 0,0041, for IL-4; p 0,0001 for IL-6; p = 0,0058, for IFN-γ og p = 0,018 for TNF-α). Denne form for behandling forbedrede også sekretionen af ​​IL-13 (p 0,0001, hypertermi plus α-GalCer versus α-GalCer alene) som toppede tidligere ved 6 timer efter behandling. Disse resultater viste, at α-GalCer kunne fremkalde stærkere immunrespons anti-tumor primært gennem styrkelse af Th1 /Th2-cytokiner udtryk ved at kombinere med i.p. hypertermi.

C57BL /6-mus blev inddelt i 4 grupper med 5 mus i hver gruppe og behandlet med i.p. hypertermi kun ved 43 ° C i 10 min, i.p. tilsat 2 ug α-GalCer, og kombinerer både. Kontrolgruppen mus blev kun udført sonderende laparotomi i 10 min. Museserum blev opsamlet ved 6, 12, og 24 timer efter behandling. IL-2, IL-4, IL-5, interferon-γ, TNF-α, blev IL-6 og IL-13 koncentrationer af serum påvises ved multiplex CBA kit. Nogle cytokin niveauer blev øget med α-GalCer og toppede på 6 timer efter behandling (IL-2, p = 0,0003, α-GalCer alene

versus

kontrol), (IL-4, p = 0,0012, α -GalCer alene

versus

kontrol), (IL-6, s 0,0001, α-GalCer

versus

kontrol), (TNF-α, p = 0,0007, α-GalCer

versus

kontrol); Nogle toppede ved 12 timer efter behandling (IL-5, p = 0,0013, α-GalCer

versus

kontrol) (IL-13, s 0,0001, α-GalCer

versus

kontrol); én toppede ved 24 timer efter behandling (INF-γ, s 0,0001, α-GalCer

versus

kontrol). Undtagen IL-5, Th1 /Th2 cytokinniveauer var højere i kombinerede gruppe behandling end a-GalCer alene gruppen (IL-2, p = 0,0056; IL-4, p = 0,0041; TNF-α, p = 0,018; INF -γ, p = 0,0058). Den maksimale niveau af IL-13 blev nået tidligere i den kombinerede gruppe behandling og dens niveau var meget højere end for α-GalCer alene (p 0,0001). Disse resultater antydede, at α-GalCer behandling kunne udløse immunrespons mod Th1 /Th2 rute og hypertermi kan yderligere forstærke denne effekt. (# P 0,05; * p 0,01; ** p 0,001; *** p 0,0001).

α-GalCer Behandling Udstillede Synergistiske cytotoksiske virkninger Against Opvarmet ovariecancerceller

det har vist sig, at de vigtigste anti-tumor effekt induceret af α-GalCer er gennem frigivelse af visse cytokiner, som forøge aktiviteterne i NK eller T-celler. For at undersøge om α-GalCer behandling har en indvirkning på aktiviteten af ​​NK-celler, overvåges vi NK-celle population på forskellige tidspunkter efter i.p. a-GalCer behandling. I perifert blod, har NK-celle populationen ikke ændre sig væsentligt inden for første 24 timer. Men andelen af ​​NK-celler dramatisk forøget 72 timer efter behandlingen (figur 2A; p 0,001, 72 hr

versus Salg andre tidspunkter). Inde i bughulen, NK-celle population steg i 3 timer efter α-GalCer administration, og tilsætning af i.p. hypertermi påvirkede ikke stigninger (figur 2B).

(A) 2 pg af α-GalCer blev ip injiceret i 5 C57BL /6-mus og halevenen blod blev opsamlet ved 0,5, 1, 3, 6 , 24, og 72 timer efter behandling. Andelen variation af NK-celler i perifert blod blev analyseret ved flowcytometri med fluorescerende CD3 og NK1.1 antistoffarvning. Resultaterne viste, at α-GalCer signifikant rekrutterede NK-celle-populationen i perifert blod 72 timer efter behandling. (P 0,001, 72 timer

versus Salg andre tidspunkter) (B) C57BL /6-mus blev inddelt i 4 grupper og behandlet ved intraperitoneal hypertermi ved 43 ° C, 2 ug α-GalCer eller kombination. Kontrolgruppen mus blev kun åbnet deres underliv i 10 minutter. Intra-peritoneale celler blev høstet ved peritoneal lavage 3 timer efter behandlingen. Variation af forholdet mellem intra-peritoneale NK-celler blev analyseret ved flowcytometri med fluorescerende CD3 og NK1.1 antistoffarvning. Resultaterne underforstået i.p. a-GalCer administration øget lokal NK-celle andel inden for få timer. Kombination af hypertermi ikke på kompromis denne effekt. (P = 0,0007, α-GalCer

versus

kontrol p = 0,0009, α-GalCer

versus

hypertermi, ingen signifikant forskel mellem α-GalCer alene og kombineret behandling) (C) ID8 tumor -fyldt C57BL /6 mus blev behandlet med intra-peritoneal hypertermi ved 43 ° C i 10 minutter. En dag efter behandling blev intra-peritoneale celler udskylles og farvet med Annexin V og PI. De cancerceller blev gated og den apoptotiske indeks blev analyseret ved flowcytometri. Andelen af ​​apoptotiske cancerceller blev forøget efter intraperitoneal hypertermi. (P = 0,0084, hypertermi

versus

kontrol) (D) 2 × 10

4 i ID8-Luc celler blev podet i 96-brønds runde knap plader og opvarmet på 42 ° C vandbad i 20 minutter . Forskellige forhold af intra-peritoneale udskyllet celler fra mus i.p. injiceret med eller uden α-GalCer blev derefter tilsat til brønden som effektorer celler og co-dyrket natten med opvarmede eller ikke-opvarmede ID8-Luc celler som målceller. Ikke-opvarmede ID8-Luc celler co-dyrket med udskyllet celler uden behandling α-GalCer blev anvendt som kontrol. Cytotoksiciteten repræsenteret af intensiteten af ​​chemoluminence blev detekteret ved IVIS imaging system. Resultaterne viste, at co-kultur af opvarmet cancercelle med intra-peritoneale lavageceller fra α-GalCer-behandlede mus induceret højeste cytotoksicitet af cancer celle in vitro. (Hos E /T-forhold = 5:01, s 0,0001, varme plus α-GalCer

versus

kontrol p = 0,0162, varme plus α-GalCer

versus

varme; p = 0,0004 , varme plus α-GalCer

versus

en-GalCer). (# P 0,05; ** p 0,001; *** p 0,0001).

Hypertermi er blevet rapporteret at forårsage død af kræftceller. I ID8 tumor-bærende mus blev mere apoptotiske ID8 celler (ip) fundet i mus behandlet med hypertermi end i kontrol- mus (Figur 2C; p = 0,0084, hypertermi

versus

kontrol)

ex vivo

co-kultur, blev det også konstateret, at opvarmede ID8 celler var mere modtagelige for peritoneale udskyllet celler opnået fra α-GalCer-behandlede mus (figur 2D; p = 0,0004, opvarmet

versus

ikke-opvarmede ID8 celler ved E /T-forhold 5:01). Disse resultater antydede, at i.p. administration af α-GalCer kunne rekruttere flere NK-celler, hvilket fører til større cancercelledrab, og hypertermi inducerer en ekstra cytotoksisk virkning for cancerceller.

Behandling kombinere i.p. Hypertermi med α-GalCer genereret en synergistisk effekt på DCS ‘Fagocytiske Aktiviteter

in vitro og in vivo

En af de anti-tumor aktiviteter NKT-celler involverer aktivering af DC’er. Den vigtigste funktion af DC’er i anti-tumor immunitet er at opsluge tumorceller og nuværende tumorantigener til de relevante effektorer celler, såsom cytotoksiske T-celler. Vi yderligere undersøgt de resulterende virkninger af α-GalCer behandling med hypertermi på fagocytiske aktiviteter DC’er. Baseret på co-dyrkning af cancerceller med DC’er isoleret fra milt, er det konstateret, at opvarmede cancerceller var mere modtagelige for DC’er ‘fagocytose (figur 3A; p = 0,005, hypertermi

versus

kontrol). Desuden DC’er isoleret fra α-GalCer-behandlede mus udviste signifikant højere aktiviteter fagocytose (p = 0,0037, α-GalCer

versus

kontrol). Sætte sammen, co-kultur af de opvarmede kræftceller med DC’er opnået fra α-GalCer-behandlede mus demonstrerede meget mere fagocytose (p = 0,0002, kombineret behandling

versus

kontrol p = 0,0008, kombineret behandling

versus

hypertermi; p = 0,005, kombineret behandling

versus

α-GalCer). Disse resultater viste, at α-GalCer behandling plus hypertermi fører til en synergistisk virkning på DC’er ‘fagocytose

in vitro.

Da den kombinerede behandling blev administreret for at målrette intraperitoneal cancerceller, analyserede vi de fagocytiske aktiviteter af intra -peritoneal DC’er opnået gennem peritoneal lavage. Ved at tælle antallet af CFSE-farvet CD11b

+ /CD11 c

+ DC’er, bemærkes det, at α-GalCer forbedret de fagocytiske aktiviteter i.p. DCs (p = 0,0289, α-GalCer

versus

Control) og hypertermi plus α-GalCer yderligere styrket denne effekt (p = .0.038 kombineret

versus

α-GalCer alene). Disse resultater viste klart, at α-GalCer behandling plus hypertermi også fører til en synergistisk virkning på DC’er ‘fagocytose inde i bughulen.

(A) C57BL /6-mus blev første i.p. injiceret med 2 ug α-GalCer. Efter 18 h blev musene aflivet, og DC’erne blev oprenset fra milte af anti-CD11c magnetiske perler. For dendritiske celle fagocytose assay blev ID8 celler først farvet med CFSE og opvarmet på 42 ° C vandbad i 20 minutter. De DC’er fra α-GalCer stimuleret (eller ikke-stimuleret) mus blev co-dyrket med opvarmede eller ikke-opvarmede ID8 celler i 6 timer i forholdet 05:01. Andelen af ​​DC’er med fagocytisk aktivitet blev repræsenteret CFSE positive i gated CD11c udtrykkende celler analyseret ved flowcytometri. Resultaterne viste, at både

in vitro

varmebehandling på cancerceller og

in vivo

stimulering af DC ved α-GalCer kunne forbedre den fagocytiske aktivitet af DC’er (p = 0,005, varme

versus

kontrol p = 0,0037, α-GalCer

versus

kontrol). Den synergistiske effekt opstod i den kombinerede behandling (p = 0,0002, kombineret behandling

versus

kontrol p = 0,0008 kombineret behandling

versus

varme; p = 0,005, kombineret behandling

versus

α-GalCer). (B) C57BL /6-mus var i.p. injiceret med 1 × 10

6 CFSE-farvede ID8 celler. Den næste dag blev musene inddelt i fire grupper med behandling ved i.p. hypertermi og /eller α-GalCer som tidligere beskrevet. En dag senere blev intra-peritoneale celler høstet gennem i.p. lavage og andelen af ​​CFSE-positive CD11

+ /CD11 c

+ celler indikerer fagocytiske aktiviteter af DC’er blev analyseret ved flowcytometri. Det vises, at α-GalCer behandling kan øge fagocytose af DC

in vivo

(p = 0,0289, α-GalCer

versus

kontrol). Denne effekt blev yderligere forstærket af yderligere hypertermi (p = 0,038, kombineret behandling

versus

α-GalCer). (# P 0,05; * p 0,01; ** p 0,001).

Kombination af intraperitoneal hypertermi og α-GalCer fremkaldte en tumorspecifik cytotoksisk CD8

+ T-celle immunrespons

Da α-GalCer behandling kan forbedre fagocytiske aktiviteter DC’er og hypertermi kan yderligere styrke denne effekt, vil det næste spørgsmål være, om kombinationen af ​​ip hypertermi og α-GalCer behandling kunne inducere tumorspecifik cytotoksisk T-cellerespons. At vurdere tilstedeværelsen af ​​cellulært immunrespons mod cancerceller, to forskellige muse ovariecancerceller, HM-1 og ID8-luc, blev anvendt som immunkompetente tumormodeller. Syv dage efter behandling, behandling af HM-1-bærende mus med α-GalCer alene blot øge et lille antal tumor-specifikke CD8

+ T celler inden splenocytterne (p = 0,0033, α-GalCer alene

versus

kontrol). Vi fandt imidlertid en betydelig stigning i antallet af tumor-specifikke CD8

+ T-celler i HM-1-bærende mus behandlet med i.p. hypertermi plus α-GalCer (p 0,0001, kombineret behandling

versus

kontrol; p 0,0001, kombineret behandling

versus

hypertermi; p = 0,0026, kombineret behandling

versus

α -GalCer alene, figur 4A). I ID8-luc model, kunne tumor- specifikke CD8

+ T-celle-immunreaktion påvises i gruppen behandlet med α-GalCer alene (p 0,0001, α-GalCer alene

versus

kontrol). Imidlertid blev denne effekt sig at være mere markant i gruppen behandlet med kombinatoriske terapi (p 0,0001, kombineret behandling

versus

andre grupper). Styrkelsen af ​​tumor specifikke CTL-respons blev formindsket med 21 dage efter behandling (data ikke vist). Dette kan skyldes overvækst af tumorceller, som beherskede immunresponset anti-tumor induceret ved kun én-gang behandling. Teoretisk ville det være meget effektiv, hvis hypertermi kan udføres gentagne gange, eller tumorvækst tiden vil kunne overvinde immunresponset anti-tumor i denne hurtige voksende tumor model. Disse resultater viste, at i.p. hypertermi kan yderligere forbedre cytotoksiske CD8 celle immunrespons fremkaldt af α-GalCer behandling tumor-specifikke

+ T.

(A) 1 x 10

6 i HM-1-celler ip injiceret i B6C3F1 mus og (B) 3 × 10

5 i ID8-Luc celler blev ip injiceret i C57BL /6-mus. Mus blev inddelt i fire grupper (ubehandlet kontrol, kun hypertermi, α-GalCer alene og kombineret behandling med hypertermi plus α-GalCer) med fem mus per gruppe og behandles som beskrevet ovenfor. Efter 7 dage blev splenocytter isoleret og stimuleret natten over med ID8 celler eller HM-1-celler. Splenocytterne fra hver gruppe uden re-stimuleret med ID8 celler eller HM-1-celler blev også dyrket natten over som kontrol. Procentdelen af ​​kræft specifik CTL repræsenteret CD8

+ /IFN-γ

+ blev påvist ved flowcytometri ved gating af 2 × 10

5 lymfocytter. Det vises, at, 7 dage efter behandling, i.p. α-GalCer behandling let øget antallet af tumor specifikke CTL (p = 0,0033, kontrol

versus

α-GalCer for HM-1; p 0,0001, α-GalCer

versus

kontrol for ID8 ). Hypertermi plus α-GalCer udstillet stærkeste effekt i aktivering specifikke CTL (p = 0,0026, kombineret behandling

versus

α-GalCer for HM-1; p 0,0001, kombineret behandling

versus

α-GalCer for ID8). (* P 0,01; *** p 0,001).

Intra-peritoneal Hypertermi Enhanced de terapeutiske virkninger af α-GalCer

in vivo

Det er klart, at ip hypertermi forbedret både medfødte og adaptive anti-tumor immunrespons induceret af α-GalCer behandling. Vi valideret, om dette multikombinerbare behandling kan resultere i bedre terapeutisk effekt

in vivo

. I MOSEC-luc tumorbærende C57BL /6-mus, i.p. hypertermi plus α-GalCer udviste stærkere hæmning af tumorvækst (figur 5A; p 0,05, kombineret behandling

versus

α-GalCer alene). Og denne behandling også forlængede overlevelsestiden af ​​tumorbærende mus (figur 5B; p = 0,0018, kombineret behandling

versus

kontrol).