PLoS ONE: Differential ekspression af HPV 16 L2 Gene i livmoderhalskræft huser episomal HPV16 genomer: Indflydelse af synonyme og ikke-kodende region Variationer

Abstrakt

Vi testede den hypotese, at (i) synonyme variationer inden de kodende regioner, og (ii) variationer inden for de ikke-kodende regioner af HPV, indflydelse livmoderhalskræft (CaCx) patogenese under påvirkning af intakte HPV16 genomer. Hele genomet sekvensanalyse af HPV16 isolater inden for 70 CaCx tilfælde og 25 ikke-maligne prøver afslørede, at synonyme variationer var væsentligt højere i E6 (p = 0,014), E5 (p = 0,001) og L2 (p = 0,0002) gener af HPV16 isolater inden tilfælde, sammenlignet med isolater inden for ikke-maligne prøver. Alle af de 25 (100%) humaniseret codon identificeret inden L2 ORF af de analyserede prøver, blev næret af CaCx tilfælde, mens 8 ud af 25 (32%), blev næret af HPV16 positive ikke-maligne prøver (p = 3.87105E-07 ). L2 (mRNA og protein) ekspression var tydelig kun blandt tilfælde med episomale virusgenomer og L2-mRNA-ekspression korrelerede signifikant med E2-genet kopital tyder ekspression fra alle episomale genomer. Blandt sådanne tilfælde isolater Asian American (AA) portrætteret alle de humaniserede codon (100%; 4-6 /prøve) registreres i L2, hvilket var signifikant højere (p = 2.02E-7) i forhold til den europæiske (E) isolerer (22,8%, ingen eller 1-2 /prøve). Derudover flertal af E variant isolater inden tilfælde (54/57; 94,7%) fremstillet en variation (T4228C) inden for korte ikke-kodende region (NCR2) mellem E5 og L2-generne, som forestiller en svag promotoraktivitet specifik for L2-mRNA-ekspression . Dette resulterede i tab af 9 ud af 14 miRNA bindingssteder (HSA-miR-548 familie), på trods af den betydelige overekspression af miR548a-5p og miR548d-5p blandt sådanne tilfælde (28,64 og 36,25 folder henholdsvis), i sammenligning med HPV negative kontrolprøver. Resultaterne eksemplificere den biologiske relevans af sekvensvariationer i HPV16 genomer og fremhæve, at episomal HPV16 i CaCx tilfælde ansætte flere mekanismer til at opretholde L2 udtryk, og dermed potentielle rolle L2 i sådanne kræftformer begrunde, i modsætning til dem husly viral integration.

Henvisning: Mandal P, Bhattacharjee B, Das Ghosh D, Mondal NR, Roy Chowdhury R, ​​Roy S, et al. (2013) Differential Ekspression af HPV 16 L2 Gene i livmoderhalskræft huser episomal HPV16 genomprogramledere: Indflydelse af synonyme og ikke-kodende region Variationer. PLoS ONE 8 (6): e65647. doi: 10,1371 /journal.pone.0065647

Redaktør: Rui Medeiros, IPO, Inst Port Oncology, Portugal

Modtaget: April 2, 2013; Accepteret: April 26, 2013; Udgivet: 6 Juni 2013

Copyright: © 2013 Mandal et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev delvist støttet af Institut for Bioteknologi (Grant nr BT /PR8014 /med /14/1220/2006), Indiens regering, og delvist af indiske statistiske institut (Intramural), og National Institute of Biomedical Genomics (Core Grant). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

foreningen af ​​genitale humane papillomavirus (HPV) med livmoderhalskræft (CaCx) er stærk og uafhængig af andre risikofaktorer, som fremgår af de konsistente resultater optaget fra epidemiologiske undersøgelser i flere lande [1]. Ca. 50% af CaCx tilfælde er forårsaget af HPV16 [2], [3]. I Indien også, HPV16 infektion er den mest dominerende form i forbindelse med CaCx [4] – [6], og er også den mest udbredte form identificeret i de generelle populationer baseret på data fra nogle regioner i Indien [5] – [9].

Under fasen med forbigående infektion, episomal form for HPV replikerer sammen med de differentierende epitelceller fra basal membran til den overfladiske zone, og virale partikler deri kaste ud sammen med de sloughed-off epitelceller [10] . synes imidlertid høj kvalitet cervikal neoplasi, at være karakteriseret ved dereguleret viral genekspression og mislykkede livscyklus virus [11]. Derfor transformerende potentiale HPV’er sandsynligvis vil blive korreleret med potentialet i deregulering af ekspressionen af ​​vigtige virale proteiner [12] – [14], samt, med evnen til at undgå immunangreb af værten med henblik på at vare ved i værten livmoderhalskræft epitel [15].

Integration af virale genomer i værtsgenomet, især på skrøbelige steder [16], [17], påvirker forskellige cellulære veje i værtscellen-cyklus maskiner. Dette fører til afbrydelse af det virale E2-genet, mest almindeligt i området, der koder for hængselregionen af ​​HPV16 E2-protein. I fravær af E2-drevne undertrykkelse, er E6 og E7 overudtrykt, for derved at drive inficerede celler mod transformation. Tværtimod har vores undersøgelse [18], samt et par andre [19], identificeret, at en betydelig andel af personer med CaCx havnen intakt E2-gen [20]. Dette kunne være enten rent intakt (episomale) eller samtidig, dvs. en blanding af intakt (episomal) og afbrudt (integrerede) former. Sådanne observationer, punkt mod biologiske plausibilitet af cervikal carcinogenese under påvirkning af HPV 16 intakt E2 gen eller intakte virale genomer, i modsætning til E2 afbrydelse eller integration.

I yderligere udforskning af nye paradigmer for HPV16 relateret CaCx patogenese under virkningen af ​​episomale virusgenomer med intakte E2-gener, vi foretog genom sekventering af sådanne virale genomer inden CaCx tilfælde og ikke-maligne prøver, der oprindeligt eksklusive E1-genet [21] og efterfølgende inkorporering E1 i denne undersøgelse. Genereret Således vi sekvensdata på hele HPV 16 genomet. Den europæiske variant (E, 86,32%) var den mest udbredte inden for vores befolkning både blandt kontroller samt tilfælde, efterfulgt af asiatiske-amerikanske varianter (AA, 13,68%), som vi indspillede kun blandt sager.

ikke-synonyme enkeltnukleotid-polymorfier (SNP) betragtes funktionelle fordi de resulterer i ændringer på aminosyreniveauet, der kunne funktionelt påvirke proteinerne. Vores tidligere analyse [21] blev fokuseret på sådanne variationer inden for de mest almindelige E variant haplotype E-12, baseret på SIFT database. Denne undersøgelse viste, at sjældne skadelige variationer inden gener impliceret i produktiv infektion (L1, L2, E2 og E5), over E-12 haplotype baggrund af intakt HPV16 isolater kunne være af kausal relevans for CaCx udvikling. Synonyme variationer på den anden side kunne også påvirke virale genekspressioner ved at modulere codon brugsmønstre [22].

Tidligere undersøgelser fra vores gruppe har også givet et indblik i den biologiske relevans af de ikke-kodende regioner af HPV16, såsom inddragelse af nukleotid variation inden E2BSIV i LCR [18], methylering af CpG’er inden E2BSI /II i LCR [23] og gentagne udvidelser inden NCR-2 [21] i patogenesen af ​​livmoderhalskræft huser intakt HPV16 genomer. Vores mål heri var at re-undersøge de enkelte nukleotid polymorfier (SNP) inden for hele genomet af HPV 16, som omfatter E1-genet, blandt episomal HPV16 isolater inden for ikke-maligne prøver og CaCx sager. Især vi fremhæves bestemme sammenslutning af synonyme variationer inden intakte HPV16 genomer eventuelle, med CaCx patogenese og identifikation af de gener, der nærede sådanne variationer, i betragtning af deres biologiske relevans. Vi udforskes yderligere den mulighed, at nucleotid variationer inden for ikke-kodende områder, specielt de utranslaterede regioner af HPV16 genomer er biologisk relevant så godt, bortset fra dem, der i kodende områder.

Materialer og metoder

Etik Statement

Alle prøver, maligne og non-maligne, blev indsamlet fra de individer med skriftligt informeret samtykke godkendt af den institutionelle etisk komité for den menneskelige eksperimenter af den indiske statistiske kontor, Kolkata, Indien.

prøver og emner

nærmere oplysninger om emner, prøver, DNA isolation, HPV screening og bestemmelse af HPV 16, er E2 kopi nummer og forstyrrelser status er beskrevet i detaljer i vores tidligere undersøgelser [8], [18], [20] , [21], [23], [24]. Vi analyserede DNA-prøver bestående af et panel af HPV16-positive maligne tilfælde (n = 94) og HPV16 positive cytologisk normale kontroller (n = 29), som vi betegnes her som HPV16 positive non-maligne prøver. Af disse har 70 maligne prøver og 25 ikke-maligne prøver medtaget fra vores tidligere rapport om HPV 16 sekvens data uden data på E1-genet [21]. De maligne prøver blev karakteriseret ved median alder på 50 år (spændvidde = 27-60 år) og ikke-maligne prøver ved median alder på 34 år (interval = 27-80 år).

Alle maligne prøver (histopatologisk bekræftet invasive pladecellecarcinomer og klinisk diagnosticeret som tumor fase III og ovenfor som pr FIGO klassificering og flertallet blev diagnosticeret som moderat differentieret planocellulært karcinom patologisk) blev afledt af gifte emner. De ikke-maligne prøver var normale cervikale skrammer bekræftet af celleprøve test og afledt af gifte og ikke-gravide (eller 6 måneder efter fødslen) kvinder uden tidligere historie af cervikal dysplasi /malignitet. Et par af prøverne fra denne gruppe blev histopatologisk bekræftet normale cervikale biopsier afledt af kvinder, der gennemgår hysterektomi for andre end kræftformer såsom livmoder prolaps, fibroid, cyste etc. og uden nogen forudgående historie af cervikal dysplasi /malignitet forskellige årsager.

Re-sekventering af HPV 16 genom

den fornyede sekventering af HPV16 genomer blev begrænset til de prøver (ikke-maligne og sager) huser intakte virale genomer baseret på (i) intakt E2-gen, som bestemt på DNA niveau ved PCR af hele E2-genet [18] og (ii) Taqman assay til estimering af E2 og E6 genet kopiantal (episomalt, når E2 /E6 ratio≥1 og blandet eller samtidig, når 0 E2 /E6-forholdet 1 ) [20].

Femten sæt overlappende primere blev anvendt til re-sekventering af HPV 16 genom. Af disse var primersekvenserne og PCR-betingelser for elleve sæt beskrevet tidligere i vores laboratorium [21]. Ud over disse blev fire sæt af overlappende primere spænder over hele området af E1-genet. Detaljerne i primersekvenser og PCR-betingelser for E1-genet, er beskrevet i tabel S1. Re-sekventering af HPV16 intakte genomer blev udført som beskrevet tidligere [21] i en ABI Prism ™ 3100 automatiseret sequencer under anvendelse farvestof terminator kemi. DNA-sekvenserne blev analyseret under anvendelse af PolyPhred pakken (https://droog.mbt.washington.edu/PolyPhred.html) og HPV16R sekvens blev anvendt som reference i opstillingerne [25]. Identifikation af sjældne varianter og eliminering af chancer for sekventering fejl blev gjort som pr den forrige rapport fra vores gruppe [21].

Identifikation af biologisk relevante synonyme variationer inden kodende regioner af HPV 16 genom

synonyme variationer inden for ORF’erne af HPV 16 blev bestemt ud fra sekvens dataanalyse. Hyppigheden af ​​brugen af ​​codon og aminosyrer pga synonyme variationer blev identificeret baseret på programmet “Grafisk kodonanvendelse Analyzer (gCua) findes på https://gcua.schoedl.de/sequential_v2.html og endelig humaniseret codon i HPV16 ORF’er blev identificeret.

Identifikation af biologisk relevante variationer inden ikke-kodende regioner af HPV16-genomet (kort non-kodende region NCR2 mellem E5 og L2)

nucleotidvariationer i de store ikke-kodende region af HPV16, dvs. LCR blev analyseret og rapporteret tidligere [18]. I denne meddelelse, vores fokus var på den korte ikke kodende region, NCR2 mellem E5 og L2 regioner i HPV16 i betragtning af den mulige involvering i denne region i reguleringen af ​​L2 udtryk [26]. Det er blevet identificeret for nylig, at værten miRNA er i stand til at kollidere med virale livscyklus, viral tropisme og patogenesen af ​​virussygdomme [27]. Derfor bruger RegRNA (www.regrna.mbc.nctu.edu.tw/) software, identificerede vi miRNA bindingssteder i NCR2 af HPV 16 isolater og tab af sådanne bindingssteder eventuelle under indflydelse af enkelt nukleotid variationer. Vi yderligere bekræftede tabet af en sådan binding, beskæftiger miRBase [28].

RNA isolering og cDNA forberedelse

Total RNA, fra livmoderhalsen vævsprøver blev isoleret, renset og behandlet med DNase I bruger Qiagen RNeasy kittet ifølge producentens protokol. Et mikrogram totalt RNA fra hver prøve blev revers transkriberet under anvendelse af primeren (dT) 17-P3, dvs. en oligo (dT) 17-primer koblet til en linkersekvens (5’GACTCGAGTCGACATCGA TTTTTTTTTTTTTTTTT 3 ‘) [29] i et 20 pi reaktionsblanding. I korte træk blev hver RNA-prøve blandet med 400 ng af oligo- (dT) -P3 primer og inkuberet ved 70 ° C i 10 minutter. Mix (10 pi) blev hurtigt afkølet på is og derefter blandet med tilsvarende volumen af ​​en blanding af 2X revers transkriptase-buffer, 8 mM dNTP’er (med DTT), 20 U RNase-inhibitor og 50 U MultiScribe ™ omvendt transkriptase (Høj kapacitet cDNA bagside transskription kit, Applied Biosystems) og revers transkriberet ved 42 ° C i 60 minutter efterfulgt af inaktivering ved 70 ° C i 10 minutter. Revers transkription reaktion, med mRNA og alle reagenser, men ingen revers transkriptase, blev udført for prøverne som negative kontroller.

Kvantitativ PCR analyse af L2-mRNA-ekspression

L2-mRNA-ekspression blev bestemt ved kvantitativ PCR (QRT-PCR) på ABI 7900 HT PCR platform, efter relativ kvantificering med ACTB ekspression. Til dette assay blev 100 ng cDNA anvendes i en 10 pi reaktionsblanding med

Strøm

SYBR® Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) og 25 ng af både fremadrettet (F L2 (3): 5 ‘TAT GGA AGT ATG GGT GTATTT T 3 ‘) og reverse primere (L2 (1) R: 5’ ATC TGG GGG AAT GGA AGG T 3 ‘). ACTB ekspression blev også kvantificeret ved real time PCR i et reaktionsvolumen på 10 pi herunder 100 ng cDNA og 25 ng fremad (ACTB RTF: 5’ATCCGCCGCCCGTCCACAC 3 ‘) og reverse primere (ACTB RTR: 5’TGCCGTGCTCGATGGGGTACT 3’). ACTB ekspression tjente som intern kontrol for at sikre integriteten af ​​det samlede RNA-prøve. Dissociationskurve analyse blev udført, for at udelukke forekomsten af ​​ikke-specifik amplificering og primer dimer formation. PCR-kontroller var NTC (ikke-skabelon kontrol) samt separat portioner fra revers transkription reaktioner med (i) alle reagenser undtagen mRNA, (ii) mRNA og alle reagenser, men ingen revers transkriptase, og (iii) HPV-negative cellulære mRNA

Immunoblotanalyse af L2-ekspression

Vævsprøver (10 mg ca.) blev homogeniseret i 100 pi iskold protein lysis buffer (30 mM Tris-HCI;. pH = 7,5, 1 mM MgC

2, 1 mM EGTA, 0,67% β-mercaptoethanol, 0,5% CHAPS, 10% glycerol og 0,5% Triton X100) indeholdende proteasehæmmer cocktail (Roche). Efter inkubation natten over ved 4 ° C under omrystning, og efterfølgende centrifugering ved 12.000 rpm ved 4 ° C i 20 minutter blev supernatanten opsamles og bestemmes ved Bradford-assay (Biorad Hercules, CA) ifølge producentens protokol. Tredive mikrogram af alle protein prøver blev kørt på 12,5% SDS PAGE in duplo, og derefter overført til PVDF-membraner. Efter uspecifik blokering blev membranen behandlet med 3:5000 fortynding af muse L2 primært antistof (Santa Cruz Biotechnology, sc-65.709; rejst mod aminosyrerne 40-150 af HPV16 L2) natten over ved 4 ° C. Efter vask blev membranen igen behandlet med anti-muse-sekundært antistof (1:5000 fortynding, gede-anti-muse-IgG-HRP, Santa Cruz Biotechnology, sc-2005) ved 37 ° C i 2 timer og 30 minutter. L2-proteinet ekspression blev detekteret ved kemiluminiscens baseret assay, efter vask membranen. Ekspression af ACTB protein blev bestemt som intern kontrol. Muse monoklonalt ACTB primært antistof (2:5000 fortynding Abcam, ab6276) og anti-muse-sekundært antistof (1:5000 fortynding, gede-anti-muse-IgG-HRP, Santa Cruz Biotechnology, sc-2005) blev anvendt til ACTB proteinekspression analyser . Densitometrisk analyse af hvert bånd af L2 og ACTB blev udført ved hjælp IMAGE J software (https://rsb.info.nih.gov/ij/docs/index.html). L2-protein-ekspression var repræsenteret i form af relativ massefylde på hvert bånd af L2 normaliseret med den tilsvarende ACTB protein bånd (område L2-protein band /område ACTB protein band).

Relativ kvantificering af modne miRNA ved TaqMan miRNA real-time PCR

TaqMan mirna Analyser for miR-548a-5p og miR-548d-5p blev foretaget, beskæftiger cDNA fremstillet ud fra det samlede RNA-prøver, der anvender specifikke miRNA primere fra TaqMan miRNA assays og reagenser fra TaqMan® miRNA Reverse Transcription Kit (ABI, Cat # 4.366.596). De 15 pi reverse transskriptionsreaktioner bestod af 10 ng total RNA, 5 U MultiScribe revers transkriptase, 0,5 mM af hver dNTP, 1 × revers transkription puffer, 4 U RNase inhibitor og nuclease-frit vand. Dette blev udført ved 16 ° C i 30 minutter og ved 42 ° C i 30 minutter, termineret ved 85 ° C i 5 min. For real-time PCR af TaqMan Mirna Analyser, vi brugte 0,5 pi 20 × TaqMan miRNA-analyse Primer, 1,33 pi ufortyndet cDNA, 5 pi 2 × TaqMan Universal PCR Master Mix og 3,17 pi nuklease-frit vand. Den real time PCR program omfattede indledende denaturering ved 95 ° C i 10 minutter, efterfulgt af 40 cykler af denaturering ved 95 ° C i 15 sekunder og annealing ved 60 ° C i 1 minut. PCR-kontroller var NTC (ikke-template-kontrol). Hvert assay blev udført mindst to gange, med tre gentagelser per prøve i hvert assay på MicroAmp optiske plader med 96 brønde under anvendelse af en 7900 HT PCR System (ABI). Relativ udtryk for miRNA blev beregnet ved hjælp RNU6b (TaqMan miRNA kontrol assay) som den endogene kontrol, og kalibreret til kontrolprøverne.

statistiske analyser

Foreningen af ​​de forskellige nukleotid ændringer i virale genom, med CaCx patogenese, blev bestemt ved anvendelse chi-square test efter behov. Til dette forhold vi mellem de tilfælde og ikke-maligne gruppe efter justering for størrelse af de respektive ORF. Falske opdagelse satser på 0,05 blev opnået for at korrigere for multiple test ved hjælp af Benjamini og Hochberg metode [30] .Den forskel i andelen af ​​humaniseret codon og SNPs i NCR2 mellem CaCx sager og ikke-maligne prøver, og mellem AA og E varianter var også bestemmes ved chi-square test. L2-mRNA-ekspression og densitometri baseret analyse af L2-protein ekspression data blev udtrykt som middelværdi ± standardafvigelse. Kolmogorov-Smirnov test blev udført for at identificere, om test variabler som udtryk for L2-mRNA og protein, fulgt normalfordeling. To prøve t-test blev anvendt til at identificere sammenslutning af sygdom fænotype med variabler, der fulgte normalfordeling. En p-værdi mindre end 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. Lineær regressionsanalyse blev udført for at bestemme associeringen af ​​E2 kopiantal med L2-mRNA-ekspression. Box parceller blev konstrueret til at observere forskellen i fordelingen af ​​miRNA udtryk blandt forskellige kategorier af cervikale prøver. Kolmogorov-Smirnov test identificeret miRNA udtryk som en variabel ikke følger normal fordeling. Derfor blev ikke-parametrisk test (Mann-Whitney U test) udføres for at studere sammenslutning af miRNA ekspression med sygdommen fænotype. Alle statistiske analyser blev udført ved hjælp af software-pakker SPSS (version 16,0 til Windows) og R (www.r-project.org)

Resultater

Nukleotid variationer inden E1 ORF:. Type og frekvens

nukleotid- variationer inden ORF’erne af HPV16-genomet, med undtagelse af E1, er blevet rapporteret tidligere fra vores laboratorium [21]. Single nucleotidvariationer blev registreret ved 20 stillinger i E1 ORF (tabel 1). Af de enkelte nukleotid variationer, 19 var bi-allel ændringer spærring én, som var tri-allel. Hyppigheden af ​​variationer varierede mellem 0,01 og 0,45, og på grundlag af mindre allelfrekvenserne (MAFs) blev klassificeret som polymorfier (MAF≥0.05) og frekvens variationer lav (MAF 0,05). Af de 20 variationer inden for ORF, var der 9 (45%) ikke-synonyme variationer og 11 (55%) synonyme variationer fordelt over E1-genet.

Non-synonyme aminosyreændringer tværs af alle ORF af HPV 16 genom

Tidligere registrerede vi 110 ikke-synonyme variationer fordelt på de ORF’erne af HPV 16, undtagen E1 [21]. Sådanne variationer forblev uændret, selv efter at øge stikprøvestørrelsen til 70 sager og 25 ikke-maligne prøver. Således er vores samlede genom-sekvensanalyse af HPV16 intakte virale genomer afslørede i alt 119 ikke-synonyme variationer. Procentdelen af ​​sådanne variationer inden E1 var ikke signifikant forskellig mellem tilfælde (0,08%) og ikke-maligne prøver (0,11%). Flere test korrektioner blev foretaget, efter at herunder ikke-synonyme variationer inden E1 ORF sammen med de øvrige ORF. Sådan analyse re-bekræftede, at andelen af ​​ikke-synonyme variationer i L2 ORF var signifikant højere i tilfælde, sammenlignet med HPV 16 positive non-malign gruppe (tabel 2).

synonyme aminosyregrupper ændringer og humaniserede codon tværs af de forskellige ORF’er af HPV 16 genom

i alt 124 synonyme variationer blev registreret fordelt på de kodende regioner af HPV16 genomer af intakte isolater. Procentdelen af ​​synonyme variationer var signifikant højere i tilfælde sammenlignet med ikke-maligne prøver til E6 (tilfælde = 0,104%, ikke-maligne prøver = 0,026%, p = 0,014), E5 (sager = 0,296%, ikke-maligne prøver = 0,064 %, p = 0,001) og L2 (tilfælde = 0,22%, ikke-maligne prøver = 0,121%, p = 0,0002) ORF’er (tabel 3). Yderligere analyse blev udført ved hjælp af gCua værktøjet (https://gcua.schoedl.de/sequential_v2.html), for at identificere de humaniserede codon inden E5, E6 og L2 ORF’erne under indflydelse af synonyme variationer.

Der var 25 humaniseret codon i L2 og 2 sådanne codon i både E5 og E6 (tabel S2). Det blev observeret, at alle de 25 (100%) humaniserede kodoner identificeret inden L2 ORF af de analyserede prøver blev næret af CaCx tilfælde, mens 8 ud af 25 (32%) blev næret af HPV16-positive ikke-maligne prøver. hyppigheden af ​​humaniserede kodoner i L2 ORF var således signifikant højere (p = 3.87105E-07) i CaCx tilfælde, sammenlignet med HPV16-positive non-maligne prøver. Ingen signifikante forskelle blev fundet i frekvenserne af humaniseret codon i E5 og E6 ORF’erne, mellem CaCx sager og HPV16 positive ikke-maligne prøver (tabel 4).

Vi klassificeret yderligere HPV16 intakte isolater i E og AA varianter efter en klassificering ordningen som rapporteret tidligere fra vores laboratorium [21]. Efter medtagelse af yderligere prøver i denne undersøgelse har vi undladt at registrere AA varianter blandt de ikke-maligne prøver, mens blandt E2 intakt CaCx tilfælde er andelen af ​​AA og E varianter var 18,6% (13/70) og 81,4% (57 /70), hhv. Vi lavede derfor et forsøg på at sammenligne AA og E varianter i form af humaniseret codon i L2 ORF blandt kun CaCx sager. Vores analyse viste, at alle AA varianter (13 /13.100%) nærede humaniserede kodoner i L2-regionen hvorimod kun få E varianter (13/57, 22,8%), indeholdt sådanne kodoner, og denne forskel var statistisk signifikant (p = 2.02E-7) . Antallet af humaniserede kodoner var også tydeligt forskellig mellem de to varianter. Det er karakteristisk, hver AA variant nærede 4-6 humaniseret codon i modsætning til hver e-variant, der husede ingen eller højst 2 humaniseret codoner.

Differentiel udtryk for L2 mRNA blandt CaCx sager huser episomal (ren eller samtidig), og integrerede HPV16 genomer

i vores tidligere undersøgelse har vi bekræftet den intakte E2-genet ved analyse af tilstedeværelsen af ​​det virale transkript (E7-E1∧E4), som producerer repressoren E2, ved APOT (opformering af papillomavirus oncogene afskrift) -coupled-kvantitativ-RT-PCR af E7 og E4 (indlejret til E2-genet) gener [31]. Baseret på en sådan analyse blev prøverne klassificeret som ren episomale eller samtidig (episomale og integreret) med intakte E2 gener, og integreret med forstyrret E2 gener. Undersøgelsen [31], viste også, at disse to typer af kræft afveg i ekspressionen af ​​E7 og E2 mRNA’er. Vi bestemt derfor L2 mRNA-ekspression ved kvantitativ real time PCR på 23 episomale /samtidige HPV16 positive CaCx sager, og sammenlignet data med den af ​​11 integrerede CaCx sager. Nr L2-ekspression blev registreret blandt de integrerede tilfælde, i modsætning til distinkt L2-mRNA-ekspression i episomalt /samtidige CaCx tilfælde (figur 1), som var helt svarer til udviklingen i tilfælde af E2-ekspression i vores tidligere undersøgelse [31]. Alle de analyserede prøver, portrætteret udtryk for ACTB mRNA-transkripter som intern kontrol. Yderligere analyse undlod at afsløre signifikant (p = 0,224, t-test) forskelle i L2-mRNA-ekspression mellem AA [middelværdi (L2 C

T /ACTB C

T) ± sd = 0,834 ± 0,127] og E [betyde (L2 C

T /ACTB C

T) ± sd = 0,904 ± 0,128] varianter (figur 2). Forholdet, L2 C

T /ACTB C

T, viste sig også at være signifikant korreleret med E2 kopiantal (p = 0,004; R

2 = 0,336) inden for de episomale CaCx sager (Figur 3 ), der begrunder udtryk for L2 fra episomale virale genomer.

(A) Amplification plot baseret på kvantitativ real time PCR af HPV 16 L2 udtryk. L2 transskriberes i E2 intakt /episomal (episomale eller samtidig), men i E2 forstyrret /integrerede sager. (B) dissociationskurve afbilder den første-afledede smeltekurve til reaktionen karakterisering af ekspressionen af ​​L2 (Tm på 80,5 ° C). (C) Amplification plot baseret på kvantitativ realtids-PCR af ACTB ekspression. ACTB udtrykkes af både episomale og integreret HPV16 positive tilfælde. (D) dissociationskurve afbilder den første-afledede smeltekurve til reaktionen karakterisering af ekspressionen af ​​ACTB (Tm på 81,0 ° C).

Relativ L2-mRNA-ekspression er repræsenteret ved gennemsnitlig L2 C

T /ACTB C

T.

Differentiel udtryk for L2-protein blandt CaCx sager huser episomal (ren eller samtidig) og integreret HPV16 genomer

Vi bestemte L2-protein ekspression ved immunoblotanalyse, på en delmængde af 12 CaCx tilfælde (integreret eller E2 forstyrret CaCx sager = 4, Asian American episomale eller E2 intakt CaCx sager = 3 og europæisk episomale eller E2 intakt CaCx sager = 5) fra det sæt, blev anvendt til L2-mRNA-ekspression analyse. L2-ekspression blev registreret blandt episomal CaCx tilfælde, AA og E variant isolater, mens sådan ekspression ikke kunne identificeres blandt de integrerede CaCx tilfælde (figur 4). Alle CaCx prøver, uanset episomal eller integreret, portrætteret ekspressionen af ​​ACTB protein (endogent kontrol). Status for humaniserede kodoner inden for AA og E variant isolater af prøver afslører L2-protein-ekspression er afbildet i tabel 5. L2-protein-ekspression blev kvantificeret ved densitometrisk analyse af immunblotresultaterne af Image J software (http: //rsb.info.nih. gov /ij /docs /index.html) og ingen signifikant forskel (p = 0,562, t-test) blev registreret mellem AA [middel (område L2 proteinbånd /område i ACTB proteinbånd) ± sd = 2,66 ± 1,85] og E-varianter [middelværdi (område af L2-protein band /område ACTB protein band) ± sd = 1,95 ± 0,61] som portrætteret i figur 5.

Overpanel skildrer L2 udtryk. Bane 1 og 2: HPV16 positive E2 forstyrret /integreret CaCx case prøver (D1 og D2); Bane 3, 5 og 7: HPV 16 positive E2 intakt /episomal (episomale eller samtidig) Europæiske varianter (EV1, EV2, EV3 henholdsvis); Bane 4, 6 og 8: HPV 16 positive E2 intakt /episomal (episomale eller samtidig) Asiatiske amerikanske varianter (AAV3, AAV2, AAV1 henholdsvis). Lavere panel afbilder ACTB udtryk blandt alle de analyserede prøver. Prøve detaljer er illustreret i tabel 5. Vejviser

miRNA bindingssteder på kort non kodningsregionen (NCR2) og tab af sådanne bindingssteder på grund af tilstedeværelsen af ​​SNPs i NCR2 af CaCx tilfælde

Der eksisterer et kort ikke-kodende region (NCR2) almindeligvis mellem E5 og L2-åbne læserammer HPV’er. NCR2 er karakteriseret ved en svag promotor aktivitet, der er stramt reguleret af keratinocytdifferentiering og udelukkende anvendes til transkripter koder for det mindre capsidprotein L2 fra HPV16 [26]. En anden undersøgelse rapporterede 13 udskrifter af HPV 16 i cervikale epitelial cellelinje W12 (huser episomale HPV16 genomer), hvoraf blev 6 udskrifter fundet at omfatte NCR2 og L2 [32]. I betragtning af, at de CaCx sager huser episomal HPV16 genomer også udtrykte L2-genet, vi fokuseret på at dechifrere de faktorer, der kunne være forbundet med L2-ekspression i sådanne CaCx tilfælde. Ved at bruge RegRNA (www.regrna.mbc.nctu.edu.tw/) software, vi identificeret bindingssteder i NCR2 (nt 4139-4234) af HPV16 intakte isolater, svarende til 14 menneskelige miRNA (HSA-miR-3148, HSA -miR-3174, HSA-mIR-3613-3p, HSA-mIR-3916, HSA-mIR-495, HSA-mIR-548a-5p, HSA-mIR-548b-5p, HSA-mIR-548c-5p, HSA -miR-548d-5p, HSA-miR-548h-5p, HSA-miR-548i-5p, HSA-miR-548j-5p, HSA-miR-548w-5p, HSA-miR-548y-5p) (Figur 6 ). Sådanne miRNA bindingssteder blev udvalgt på baggrund af minimum fri energi (MFE≤7) og hybridisering score (≥140) (tabel S3) som pr standarder normalt anvendes til dannelse af miRNA: mRNA hybrid. Vores resequenced data viste forekomst af en SNP (T4228C) (figur S1) i NCR2 E-varianten kun intakt isolater, hvilket kan føre til tab af 9 miRNA bindingssteder i de tilsvarende udskrifter (HSA-miR-548a-5p, HSA -miR-548b-5p, HSA-miR-548c-5p, HSA-miR-548d-5p, HSA-miR-548h-5p, HSA-miR-548i-5p, HSA-miR-548j-5p, HSA-miR -548w-5p, HSA-mIR-548y-5p) (figur 6), som alle tilhørte den HSA-mIR-548-familien af ​​miRNA. Interessant andel af E2 intakt CaCx tilfælde (54/70, 77%), der huser SNP’er i miRNA bindingssites inden for NCR2 var signifikant højere (p = 0,007) sammenlignet med den for ikke-maligne prøver (12/25, 48%) . Inden E2 intakt CaCx tilfælde blev det også observeret, at ingen af ​​AA varianterne (0/13, 0%) nærede en SNP i miRNA bindingssteder i NCR2. Således blev intet tab af miRNA bindingssteder i NCR2 observeret i AA-varianter.

(A) viser de NCR2 (nucleotidpositionerne 4139-4236) placeret inden for 5 ‘UTR af L2-genet, med en enkelt-nukleotid polymorfisme (SNP) i position 4228 (T til C). (B) RegRNA software baseret identifikation af fjorten miRNA bindingssteder inden NCR2 med tab af bindingssteder, der svarer til ni miRNA (

*) af HSA-miR-548family grund af SNP (T4228C).

Forrige undersøgelse fra vores laboratorium [21] afslørede forekomsten af ​​gentagne variationer inden for NCR2.