PLoS ONE: den betingede Place Preference Test for Vurdering velfærdsmæssige konsekvenser og mulige Forbedringer i en mus blærekræft Model

Abstrakt

De fleste prækliniske smertestillende effekt analyser stadig involvere nociceptive test i gnavere. Dette til trods bekymring med hensyn til relevansen af ​​disse tests for evaluering af smerte-forebyggende egenskaber af lægemidler. Mere egnede metoder vil målrette smerte snarere end nociception, men disse er i øjeblikket ikke tilgængelig, så det forbliver uvist, om dyr smerte svarer til den negativt affektive og subjektive /følelsesmæssige tilstand det forårsager hos mennesker. Mus kræftmodeller er almindelige på trods af sandsynligheden for væsentlig smerte. Vi brugte konditioneret Place Preference (CPP) afprøvning, vurderinger af termisk hyperalgesi og adfærd til at bestemme sandsynligheden for, at MBT-2 blærekræft negativ indvirkning på mus velfærd, såsom ved at forårsage smerte. Der var ingen CPP til saltvand, men morfin præference i tumorbærende mus oversteg set i tumor-fri kontrol. Dette skete op til 10 dage før undersøgelsen endepunkt sammen nedsat kropsvægt, udvikling af hyperalgesi og adfærdsændringer. Disse virkninger angivne mus oplevet en negativ velfærdsstat forårsaget af

utilpashed

(hvis ikke smerte) før dødshjælp. På grund af kompleksiteten af ​​vurderingerne er nødvendige for at demonstrere dette, er det usandsynligt, at denne tilgang kunne anvendes til rutinemæssig vurdering velfærd på en undersøgelse-for-undersøgelse basis. Men vores resultater viser, mus i tilstrækkeligt lignende undersøgelser forventes at drage fordel af mere intensiv sværhedsgrad vurdering og revurdering af end-points med henblik på at gennemføre passende justeringer. I dette særlige tilfælde, ville en forfinelse have været at have aflivet mus mindst 7 dage tidligere eller eventuelt ved tilvejebringelse af slutstadiet smertelindring. CPP test viste sig at være en nyttig metode til at undersøge svarene fra mus til analgetika, eventuelt på en subjektiv niveau. Disse resultater og de andre nylige undersøgelser viser, det kunne være en værdifuld metode til screening af kandidat smertestillende for effekt mod cancersmerter og muligvis andre smerte eller sygdomsmodeller

Henvisning:. Roughan JV, Coulter CA, Flecknell PA, Thomas HD, Sufka KJ (2014) den betingede Place Preference Test for Vurdering velfærdsmæssige konsekvenser og mulige Forbedringer i en mus blærekræft Model. PLoS ONE 9 (8): e103362. doi: 10,1371 /journal.pone.0103362

Redaktør: Bradley Taylor, University of Kentucky Medical Center, USA

Modtaget: 10. september 2013; Accepteret: 30 Juni 2014; Udgivet: 6 August, 2014

Copyright: © 2014 Roughan et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Undersøgelsen blev finansieret af den britiske Nationalt Center for 3R (NC3Rs): https://www.nc3rs.org.uk/, Grant Number G0900763, PI: JV Roughan. Den bidragyder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

En vifte af nociceptive test bruges til at bestemme den potentielle effekt af nye analgetika, og laboratorie rotter og mus er overvældende de mest udbredte testpersoner. Disse tests er typisk klassificeret efter varigheden og intensiteten af ​​skadelig stimulus og arten af ​​responset. Akutte eller fasiske nociceptive analyser, der gælder varme eller mekanisk stimulation (f.eks halen-flick og Hargreaves tester; von Frey, henholdsvis), på grund af den stort set refleksive karakter af svarene opnået, betragtes som mindre egnede end toniske eller sub-kroniske tests ( f.eks formalin eller carrageenan), der fremkalder signifikant og vedvarende inflammation [1]. Imidlertid er utilstrækkelige både velkendte [2]. Trods udviklingen af ​​animalske simuleringer af vedvarende smerter syndromer (fx arthritis eller neuropatisk smerte), bekymringer forrang for så vidt deres kliniske relevans. Disse sidste ende skyldes en fortsat mangel på forståelse af, hvordan dyr smerte svarer til den menneskelige erfaring; være en flerdimensional fænomen herunder både sensoriske og affektive følelsesmæssige tilstandsændringer (samlet betegnet “liv kvalitet” ændringer). Teoretisk mindst, bør dyr smerte og smertestillende analyser der informerer om ændringer i disse stater har råd større translationel gyldighed. Dette behov er drevet seneste opkald for udvikling af mere klinisk relevant

in vivo

modeller [3], [4] giver en flere systemer tilgang [5]. Dette rationale forklarer, hvorfor affektive (subjektive) state vurdering i stigende grad betragtes som et mere relevant tilgang til oprettelse velfærdsmæssige konsekvenser af modeller, hvor dyr kunne blive eksponeret for smerte [6] – [8]. Kræft modeller er et forskningsområde, hvor betydeligt mere viden om, hvordan udstrakt smerte virkninger på velfærd kan være længe siden.

En stor og støt stigende antal dyr (hovedsageligt mus) anvendes i test kræft (471 tusind i Storbritannien i 2012; en stigning på 16% i forhold til året [9]) med kun minimal viden om potentielt negative virkninger på velfærd. Men for at de retningslinjer, der er beregnet minimere lidelse i disse undersøgelser [10], [11] er ikke indregnet nogen vurdering af ændringer i underliggende subjektive tilstand, og opnåelse af bevis for kræft smerter hos gnavere har lid vurdering underliggende nociceptive ændringer [12 ] – [15], og det synes dette er stadig tilfældet i dag [16] – [19]. Vores gruppe har udstrakt vurderet ændringer i naturalistiske adfærd som et middel til at vurdere postoperative smerter hos gnavere og andre arter ved hjælp af både manuelle [20] – [26] og automatiserede metoder [27] – [30], eller en kombination af begge typer af analyse [31]. Imidlertid har en sådan adfærd analyse sjældent blevet brugt til at vurdere virkningerne af kræft, og de få undersøgelser, der citerer “smerte adfærd” egentlig nociceptive eller nocifensive adfærd (dvs. tilbagetrækning eller bevogtning) snarere end ægte spontan (f.eks hjemme-bur) adfærd ( se for eksempel [14], [32]). Uanset hvilken metode til indsamling af data bliver brugt, etablere forbindelser mellem resultatet og årsagssammenhæng i adfærdsmæssige undersøgelser er vanskeligt, fordi mange faktorer kan bidrage til de observerede ændringer. Ændringer kan forekomme som en indirekte følge af proceduremæssige påvirkninger (fx anæstesi, hypotermi, dehydrering) eller faktorer knyttet til disse, såsom frygt og tilhørende angst. Ikke desto mindre fastslå, om og hvornår smerter opstår i kræft undersøgelser ville have betydelige konsekvenser. For det første ville det tilskynde til en mere stringent tilgang til etisk beslutningstagning, fordi forskere til at anvende mere effektive cost-benefit-analyser, når det bestemmes, om end-points er berettiget. Forbedring velfærdsstandarder på denne måde vil også være til gavn for undersøgelser, fordi unalleviated smerte også kan bringe model gyldighed. Forebyggelse af smerte har vist sig at være gavnlig for gyldighed i mindst en cancer trial [33] og eventuelt andre

in vivo

forskningsansøgninger [34]. Kræft smerte er også et område, hvor der er et presserende behov for fremskridt i menneskelige behandlinger. Smerte er den mest almindelige og frygtede konsekvens af kræft og mellem 30-60% af onkologiske patienter fortsat rapportere smerte før, hele og efter behandling [35]. Det ser faktisk udsigterne fortsat dystre trods 40 års forsøg på at løse problemet [36]. Det er klart, behov cancer smertebehandling skal raffineres, og dyrs kræftmodeller giver en ideel platform for parallelle fremskridt på velfærd avancement og lægemiddelforskning. På trods af dette, er kræftmodeller ikke generelt bruges til at screene potentielle analgetika, med kun få undtagelser [13], [37]. Dette kan være fordi de fleste cancer studier har alternative mål, men kunne også skyldes en mangel på egnede vurderingsmetoder; dvs. dem, der rumme subjektive aspekter.

Betinget Place præference (CPP) afprøvning er almindeligt anvendt til at vurdere de psykoaktive (affektive) egenskaber af lægemidler i dyr [38], men som regel at identificere misbrug ansvar af mennesker. Dyr er betinget af at blive indespærret i et “sted” og parring, at med medicinsk behandling, mens der i et andet sted, de får kun et placebo. Som »pladser« har tydeligt forskellige signaler (som regel i farve eller konsistens) dyr progressivt associere narkotika ‘indflydelse med det sted, hvor de oplevede det. Hvis dette er en berigende oplevelse, enten på grund af narkotika ‘positivt eller negativt forstærkende (smertestillende) effekter, dyr tilbringer typisk længere i, eller besøge lægemiddel-parrede sted oftere. Tilvejebringelse af analgesi er en positiv oplevelse i smertefulde mennesker, så hvis det samme gælder for dyr derefter CPP undersøgelser har potentiale til evaluering både uvilje egenskaber af smerte og analgetiske virkninger af lægemidler. Den fremgangsmåde er i stigende grad blevet anvendt til forskning i smerter efter den første demonstration af, at arthritis årsager forbedrede CPP at morfin og N-methyl-D-aspartat-antagonist MK-801 [39]. Det blev efterfølgende vist, at en bradykinin B

1-receptorantagonist har terapeutisk potentiale mod kronisk inflammatorisk smerte [40]. En betydelig tid senere, King et al. viste CPP er også en effektiv metode til at vurdere analgetika mod neuropatisk smerte [41]. Qu et al. illustreret relevansen af ​​CPP til at vurdere subjektive aspekter af neuropatisk smerte hos rotter ved at vise, at den rostrale anterior cingulate cortex er afgørende for mediering af smerte påvirke [42]. Rutten et al. var også i stand til at bruge CPP at dissociere mellem positivt og negativt givende konsekvenser af analgetika med opioid-lignende påvirker i forhold til andre mekanismer i en rotte inflammatorisk (carrageenan) model [43]. Davoody et al. derefter viste forøget CPP til clonidin (en α-2 agonist) i rotter under anvendelse rygmarvsskade som en centraliseret smerte model [44]. Okun et al. udnyttet en lignende tilgang til vise CPP til flere forskellige lægemidler i en osteoartrotiske model [45], og senest, Park et al. viste mangel på positiv forstærkning (belønning) til gabapentin i normale mus, men CPP i en polyneuropathic smerte model forårsaget af antineoplastisk (cisplatin) behandling [46]. Kollektivt, disse resultater viser klart, at CPP paradigme er i stand til at give dyr med et middel til at rapportere om deres bevidsthed om smerte, og så kunne tilbyde en mere hensigtsmæssig metode til at evaluere sin centraliserede (affektiv /subjektive) i modsætning til nociceptive (effektiv) egenskaber.

forestillingen om, at smerte kan være så kompleks i dyr (i det mindste i pattedyr), da det er hos mennesker understreges af det faktum, at ingen enkelt kriterium måling kan (indtil videre) effektivt evaluere den. Bateson et al. oprindeligt anvendt en flere foranstaltninger tilgang til videnskabelig problemløsning (senere kaldt “triangulering”) [47], citerer, at selv om “beviser opnået ved forskellige tilgange var tvetydig”, “når hele kroppen af ​​beviser blev anset, kunne langt større tillid placeres på en særlig betydning “. Ved at løse problemet med dyrs lidelser, og acceptere, at “vi ikke direkte kan observere en dyrenes følelser”, Bateson anbefales, at “vi skal bruge en bred vifte af opgaver at få tillid til konklusioner” [48]. Følgelig er undersøgelser nu i stigende grad anvender flere forskellige foranstaltninger i et forsøg på at karakterisere smerte mere pålideligt [49], [50]. I denne undersøgelse vedtog vi en sammenlignelig tilgang ved at vurdere en standard velfærd parameter (legemsvægt) sammen perifer overfølsomhed test, overvågning spontan udforskende adfærd og gennemførelse CPP test. Trods flere begrænsninger, hyperalgesi (overfølsomhed) test giver stadig en værdifuld sekundær indikator for smerter af forskellige modaliteter herunder kræft [12], [16], [19]. Adfærd ændringer er også en fælles reaktion på smerte, men indsamling og analyser af data er ofte tidskrævende, især hvis de anvendes i undersøgelser, der typisk sidste mange uger; som det normalt er tilfældet i kræft studier. Fortolkning af disse data kan også være problematisk, fordi, som allerede beskrevet, er der altid alternative forklaringer på eventuelle adfærdsændringer, der registreres. Et ofte citeret mulighed er, at tegn på uarbejdsdygtighed i gnavere kan være skjult som en adaptiv reaktion for at reducere sandsynligheden for prædation; selvom vores viden dette aldrig er blevet vist utvetydigt. Til i det mindste delvis overvinde tidsbegrænsningen vi bruges automatiseret registrering adfærd software (HomeCageScan; Clever Systems Inc., VA, USA (HCS)). Dette anerkender en række ( 20) mus adfærd med tilsvarende nøjagtighed til manuel analyse af en uddannet observatør [27], [28]. I denne undersøgelse kontrast vi resultater om hyperalgesi og adfærdsændringer med resultaterne af CPP test for at vurdere konsekvenserne af blærekræft på velfærd mus; anvendelse af begrebet triangulering. Så vidt vi ved, er der ikke gjort tidligere forsøg på at evaluere CPP tilgang, som beskrevet her under tumor udvikling; med fortløbende condition og afprøvning cyklusser. Vi søgte også at måle (mindst hypotetisk), om dette kunne være en nyttig metode til screening af lægemiddelkandidater til behandling af smerte kræft hos mennesker. Vi fandt tumor mus fik mindre vægt, udviklede hyperalgesi og viste adfærd ændringer, der blev tid knyttet til forbedret morfin søger i tumor-bærende mus i de 7 dage forud eutanasi. Vi konkluderede, at den mest sandsynlige forklaring på disse ændringer var smerte. Hvis ikke på grund af smerter, i det mindste de resultater viste negative indvirkninger på velfærd, herunder eventuelt

utilpashed

. Normalt mus ville kun fjernes fra undersøgelser efter dette tidspunkt, hvilket indikerer en sandsynlig behov for end-point raffinement i denne musemodel for blærecancer. Vores fremgangsmåde til påføring CPP testning kunne også være et potentielt nyttig metode til at teste effektiviteten af ​​analgetika bestemt til cancer og andre betingelser, især dem, hvor smerte kan eskalere over tid.

Metoder Salg

etiske retningslinjer

Alt arbejde blev udført i overensstemmelse med de Dyr (videnskabelige procedurer) Act 1986 og var genstand for lokal etisk vurdering. Eksperimenterne også levet op til retningslinjerne af Udvalget for Forskning og etiske spørgsmål i IASP (IASP). Alle procedurer blev godkendt af det britiske indenrigsministerium (Project Licence PPL 60/4431).

Emner og husdyrhold

Alle mus blev C3H /høne, vejede 25 til 30 g ved levering (Charles River Laboratories Inc., UK) og havde fri adgang til en kommerciel pelleteret kost (R . M nr.3 SDS LTD, Whitham, UK) og postevand i grupper på 10 i en uge af akklimatisering. De blev derefter anbringes alene (Macrolon 2 bure, North Kent Plast, UK) for en anden uge inden tilmelding. Savsmuld og spåner blev brugt som strøelse og bure blev suppleret med “Sizzle Nest”, en asp tygge-blok og et paprør (B K Universal). Stuetemperatur blev opretholdt ved 21 ± 1 ° C med 15-20 luftskifter i timen under en 12-timers lys cyklus (lys slukket kl 19:00 h). Alle test blev udført fra 10:00 til 15:00

Dataindsamling

Resultaterne af 3 undersøgelser med anvendelse af separate grupper af mus er beskrevet.; (1) Hargreaves (nociceptive test) undersøgelse (2) Adfærd studie og (3) konditioneret Place Preference (CPP) afprøvning bestående af en pilot dosis omfattende undersøgelse og derefter en hovedundersøgelsen. De opnåede på undersøgelser 1 og 2 data var fra sonderende undersøgelser foretaget af kolleger i den nordlige Institute for Cancer Research (NiCr) ved hjælp af syngene MBT-2 (Mouse Blære Tumor) celler afledt af C3H /høne /J-mus (celler doneret af Prof. Michael O’Donnell (University of Iowa, Iowa City, IA, USA) og Dr. William A. Larchian (EMH /Cleveland Clinic Prostata Center, Cleveland, OH, USA)). CPP data blev opnået fra mus specifikt opnået for testning. Vores kollegas mål var; i første omgang at karakterisere væksten profil orthotopisk implanterede blæretumorer (Undersøgelse 1) og derefter at forfine implantatet metodologi (Studie 2). Men begge studier var en mulighed for at indsamle supplerende data om patologiske virkninger (herunder eventuelt smerte), der ville hjælpe i udformningen af ​​de vigtigste (CPP) undersøgelse; derved reducere anvendelsen af ​​dyr til et så lavt niveau som muligt.

Hargreaves Study

Det var en pilotundersøgelse forpligtet sig til at skabe vækst karakteristika orthotopisk implanteret MBT-2-celler, der ville informere om den endelige design af CPP undersøgelsen. Gruppe størrelser blev bestemt ved NiCr kolleger baseret på deres krav studie. Mus blev tilfældigt inddelt i tre grupper på 5 der undergik laparotomi for ortotopisk implantation af 100 pi Dulbeccos phosphatbufrede saltvand (DPBS) eller det samme volumen af ​​DPBS indeholdende 2 × 10

4 eller 2 × 10

5 MBT -2 celler. En fjerde gruppe af 5 mus var anæstesi kun kontroller. Otte mus, der undergik kirurgi blev tilfældigt valgt til at modtage 5 mg /kg meloxicam (subkutant; s /c) at lindre smerter efter operation [27], mens resten fik saltvand (0,3 MLS s /c, n = 7). Anæstesi blev induceret med 5% isofluran i oxygen (5 l /min.) I et Perspex kammer. Mus derefter lægge liggende på ryggen på et varmetæppe til at opretholde kropstemperatur mellem 34,5 og 37,5 ° C og anæstesi blev opretholdt med 1,5-2% isofluran i oxygen (500 ml /min.). Dybde blev overvåget ved at observere respiratoriske satser og løbende vurderer tå-knivspids reflekser. Simple øjensalve (Pliva Pharma Ltd., UK) blev anvendt til at forebygge corneal tørring. Kirurgi var en 0,5 cm midtlinjeincision i huden og muskler overliggende blæren. Når udsat for, blev 0,1 ml saltvand eller en passende tumor cellesuspension injiceret intramuskulært i blærevæggen ved anvendelse af en insulinsprøjte. De abdominale muskler og hud blev lukket hver for hjælp 5/0 polyglactin 910 ( ‘Vicryl “, Ethicon Ltd., Edinburgh, UK) og væv lim (‘ Nexaband”, Abbott Laboratories, Chicago). Anæstesi varede cirka 10 minutter

Termiske tilbagetrækning ventetid ved baseline, og på 1 time og 1 dag (24 timer) efter operationen, og derefter på dage.; 3, 7, 10, 14, 17, 21 og 24 under anvendelse af plantar Test (Model 37370, Ugo Basile, Italien) i overensstemmelse med fremgangsmåden ifølge Hargreaves [51]. Dyrene blev anbragt i klare akryl kamre på et glas gulv og habituated i 10 minutter. En infrarød varmekilde blev skiftevis anvendt på midten af ​​plantar område af hver bagpote (70% af den maksimale opvarmning kapacitet svarende til 253 ± 7 mW /cm

2; 30 sekunder cut-off). Dette gav en passende vifte af respons ventetid i normale mus (~between 3 og 8 sekunder). Tre respons blev opnået fra hver bagpote med et minimum interval på 1 minut mellem ipsilaterale optagelser. Data blev udelukkende fremstillet af de anæstesi kontrol mus indtil dag 3, når de var forpligtet andetsteds. Kropsvægt blev registreret dagligt indtil dag 4, og derefter på nociceptive testdage. Som tumorer var interne, blev vækststadium estimeret ved daglig palpering af en erfaren tekniker, der sorteres tumorer på en 3 point skala; fra 1 (knap til stede) til 3 (indlysende uden håndtering). Disse inspektioner omfattede også en registrering af aktiviteter i forbindelse med mavesmerter hos gnavere [21], [31] og andre tegn på dårligt helbred som hæmaturi, sløvhed, dehydrering og dårlig pels og huld.

Adfærd Undersøgelse

De adfærd data blev indsamlet som led i en opfølgende undersøgelse (igen uden yderligere brug dyr) til at vurdere et potentielt mere raffineret (ikke-kirurgisk) metode til celle implantation [52]. Vores kolleger forsøgt at fastslå, om tumor transplantation kunne forbedres med denne metode, mens vi ønskede at evaluere de langsigtede virkninger af vækst kræft på adfærd. Som før, gruppestørrelser var forudbestemt; 20 mus blev tildelt DPBS gruppen og 20 til tumoren gruppen. Anæstesi blev induceret som beskrevet tidligere, men i partier af 5 mus ved hjælp af en specialfremstillet åben-maske gas delivery system. Proceduren implantatet er allerede blevet beskrevet, men kortvarigt, blev blæren på hver mus tilgås via en 27 gauge kanyle pædiatrisk placeret i urinrøret. Urin blev annulleret ved forsigtig supra-pubic tryk og aspiration, og blæren mucosa condition med en mild sur skylning (50 pi 0,1 M HCI) i 20 sekunder. Dette blev også opsuget, og derefter neutraliseret med 50 gl 0,1 M KOH, og tre DPBS vaske. Blæren blev tømt før inddrypning 50 pi af 5 x 10

6 MBT-2 celler eller det samme volumen af ​​DPBS via en sprøjte bundet til halen. Den større koncentration celle var i forventning om en ukendt cellefraktion bliver annulleret i urinen efter opsving. Celler blev efterladt

in situ

i 30 minutter, hvorefter musene blev anbragt i en inkubator ved 37 ° C i 20 minutter. Daglig tumor udvikling blev overvåget som før, og kropsvægten blev også registreret dagligt. Mus blev filmet individuelt i 10 minutter ved hjælp af et videokamera (Sony DCR-HC96, Sony, Japan) placeret på et stativ 30 cm fra forsiden af ​​klare ‘1284’cages (35 × 20 × 14 cm, Techniplast, UK Ltd), der indeholder kun strøelse (Aspen savsmuld). Proceduren til indsamling adfærd dataene er som tidligere beskrevet [28], bortset fra at det var på skiftende dage før tumorpåvisning og derefter dagligt. Optagelserne var altid under den lette fase, men det tidspunkt på dagen hver mus blev filmet blev randomiseret inden for tumor og kontrolgrupper.

Betinget Place Preference Studies

CPP arbejde blev gennemført i 2 etaper. Den første var en pilotundersøgelse for at udforske udviklingen af ​​CPP til morfin under gentagne condition og test cykler, og identificere en morfin dosis for de vigtigste CPP undersøgelsen. Den valgte dosis ville være en, understøttes kun beskedne sted præference, men bibeholdt tilstrækkelige analgetiske egenskaber til fremkaldelse negativ forstærkning i tumorbærende mus. Tal blev bestemt ved hjælp af en retrospektiv magt analyse på tidligere morfin CPP resultater på tværs af en vifte af dosishastigheder i normale mus (1 og 5 mg /kg s /c) [53], der bør også fremkalder væsentlige smertestillende effekter [54], [55] . Prøvestørrelser på 8 eller 10 blev efterfølgende fundet at opnå 79% eller 91% effekt i detektere væsentlige CPP til et lægemiddel (3 eller 5 mg /kg morfin) versus placebo-parrede rum. CPP apparat bestod af sort (stålstang floored) og hvide (stål gitter floored) rum adskilt af et gråt (fast gulv) begynder kammer. Vi brugte 4 ens test enheder (Med Associates, St Albans, VT, USA; Model CPP-3013AT) udstyret med automatisk styrede guillotine døre og lys. Rum opstaldet infrarøde arrays til automatisk at optage rum opholdstider og bevægelser inden for og mellem de 3 rum. En indledende forsøg blev anvendt til at bestemme basislinie kammer præference for hvert dyr. Til dette de blev placeret i den centrale (grå) starter kammer i 1 minut før tænde lysene og åbne guillotinen dørene. Preference test blev altid udført fra 10:00 til 14:00. Den relative tidsforbrug udforske de sorte og hvide rum over en efterfølgende 15 minutter forsøg blev beregnet som en andel af den samlede test (se CPP dataanalyse afsnit). Musene blev tildelt for S + (saltvand eller morfin) condition i rummet, hvor de tilbragte forholdsmæssigt den mindste mængde af tid (dvs. deres ikke-foretrukne kammer), men ingen mus viste forholdsmæssige indledende rum præferencer overstiger 0,6 (analyse- afsnit detaljer CPP præference beregningsmetode). Designet blev derefter opvejes således at den oprindelige præference relative gruppe ligger så tæt som muligt på 0,5 (dvs. lige mange blev tildelt hver gruppe til den sorte (B) eller hvid (W) S + kamre). På dette grundlag blev tildelt otte mus til hver af 2 morfin grupper spænder over sandsynlige område for effektive analgetiske dosismængder (1 eller 5 mg /kg s /c) og en repræsentativ gruppe af 4 mus var saltvandskontroller. Når vi nået den fase af test kræft vidste vi den traditionelle CPP tilgang af gentagne conditioning forsøg efterfulgt af en enkelt præference test ville ikke være passende. Det var fordi hvis smerte fandt sted; vi ønskede også at fange sin debut. Informeret af dette, alle CPP test (herunder i pilotundersøgelsen) bestod af gentagne 3 dages blokke, med hver blok bestående af 2 dage konditionering før en stoffri præference test hver efterfølgende dag (vist i figur 1). For pilotundersøgelsen de 4 knapper modtog kun saltvand (0,03 ml s /c) under både S- og S + betingelser. På grund af mulig morfin ‘fremførsel’ til eftermiddag S + forsøg var det nødvendigt, at køretøjer (S-) injektioner altid fik om morgenen og S + (morfin eller saltvand) i eftermiddag. Morfin blev opnået som morfin sulfat-opløsning (30 mg /ml; NHS Supplies, UK) og blev passende fortyndet med vand til injektion (WFI), der skal indgives subkutant i et volumen på 0,03 ml. Alle injektioner blev givet umiddelbart før placering i den tildelte B eller W rum til en 45 minutters konditionering periode med guillotinen døre lukket. Musene blev returneret til deres hjem-bure umiddelbart efter hver condition session. Fire på hinanden følgende præference tests blev foretaget for pilotundersøgelsen (4 test blokke; figur 1). Præcist efter den metode, der anvendes til at bestemme den indledende præference rum

Successive blokke var hver af to conditioning dag, hvor mus undergik morgen S- (saltvand) og derefter eftermiddag S + (morfin eller saltvand) behandlinger og var begrænset til 45 minutter i sort eller hvid kammer. Den tredje dag i hver blok var en stoffri præference test, og 3 dage cyklus blev gentaget, indtil eutanasi.

Den vigtigste CPP undersøgelse begyndte med en gentagelse af første præference test. Hver mus fik en B eller W rum til efterfølgende S- /S + konditionering på den tidligere beskrevne måde (balancering numre oprindeligt foretrækker B eller W rum tværs kontrol- og tumor- grupper). Som før blev mus tildelt til deres oprindeligt ikke foretrukket rum i videst muligt omfang. Tumor-mus blev igen implanteret via urinrøret med 50 pi DPBS indeholdende 5 × 10

6 MBT-2-celler. Tredive mus blev orthotopisk implanteret med tumorceller og ti var saltvandskontroller. Disse tal blev informeret af vores tidligere fund på antallet af graft svigt efter urethral implantation. Vi planlagde at afbalancere design (og yderligere spare dyr forbrug) ved at tildele sådanne fejl til at styre grupper, men kun hvis der ikke var nogen håndgribelig eller andre tegn på tumor udvikling efter 21 dage. Tumor fravær blev også bekræftet

efter slagtning.

Når kliniske inspektioner bekræftede tumorvækst, hver mus begyndte CPP condition og en behandling matchet ikke-tumor kontrol ind i studiet samtidigt. Den tre dage serie condition og test sessioner derefter fortsatte indtil mus blev aflivet (se afsnittet om endepunkt bestemmelse). Eksperimentelle grupper derfor dannede en 2 (Drug) × 2 (behandling) faktordesign at kombineret condition til morfin eller 0,9% saltvand i tumor eller ikke-tumor-mus. Vi valgte en mellemliggende dosis morfin (2 mg /kg s /c) for de vigtigste undersøgelse baseret på resultaterne af pilotundersøgelsen. I hovedsagen CPP præference undersøgelse tests var også 45 i stedet for 15 minut, men metoden var ellers identisk med den anvendt i pilotundersøgelsen. På grund af tidspres og den potentielle forvirre af placering i andre ukendte miljøer (effektivt andre “steder”), blev adfærd og hyperalgesi vurderinger ikke gennemføres som CPP undersøgelsen skred frem. Imidlertid var virkningen af ​​senfase analgetisk behandling på adfærd vurderes som en potentiel raffinement mulighed. Dette betød, at om eutanasi dage blev musene filmet i 20 minutter før og efter injektion af konditionering dosis af morfin (2 mg /kg s /c) og identiske registreringer blev foretaget fra et lige antal kontroller på den sidste dag af undersøgelsen.

End-point bestemmelse

Kliniske inspektioner blev gennemført i alle undersøgelser at afgøre, om tumor-bærende mus er nødvendige for at blive trukket tilbage. Disse var i overensstemmelse med offentliggjorte retningslinjer [10], [11] og med rådgivning af meget erfarne dyr plejepersonalet. Eutanasi var uundgåelig, når dyrene havde en stor håndgribelig tumor eller mere end 15% krop vægttab, og hvis en af ​​disse faldt sammen med en betydelig hæmaturi (angivet med blod farves pels og /eller strøelse). Alle mus inklusive kontrolgruppen gennemgik palpering. De blev fastholdt på den måde, er sædvanlig for en intraperitoneal injektion. Blæren region blev derefter forsigtigt palperes mellem tommel- og pegefinger, men med tilstrækkeligt tryk til at bestemme det tidligste tidspunkt for indtræden af ​​tumor udvikling som pålideligt som muligt.

Dataanalyse

Hargreaves undersøgelse.

Som respons ventetid var oprindeligt ens mellem venstre og højre hind-poter, alle værdier blev midlet til at beregne det samlede gennemsnit respons latenstid på hver optagetid. Dataene opfyldt kravene til parametrisk analyse så blev undersøgt ved hjælp af gentagne målinger ANOVA med ‘Time’ (10 niveauer) og »gruppe« (4 niveauer, 2 × tumor, 1 × placebo og kun anæstesi) som inden for og mellem-fagets faktorer henholdsvis .

Post-hoc

individuelle tid og gruppe sammenligninger blev foretaget og sandsynlighed niveauer justeres i overensstemmelse hermed (

Bonferroni

). Ændringerne kropsvægt blev også beregnet som ændring fra baseline og de samme statistiske metoder, der anvendes. For større klarhed, er vægten ændringer afbildet som absolutte værdier på hvert tidspunkt. På grund af mangel på nociceptive data i ikke-kirurgi kontrol mus efter dag 3 og kropsvægt data efter dag 4 alle analyser følge disse tider omfattede kirurgi grupper kun. Endelig blev virkningerne af præ-kirurgi meloxicam undersøgt ved at sammenligne bundlinjeresponset latenstider til 1 timers tidspunktet i ANOVA; men med ‘forbehandling «(meloxicam eller saltvand) som en mellem motivets faktor (n = 7 (Saline) versus n = 8 (meloxicam)).

Adfærd undersøgelse.

adfærd data blev bearbejdet under anvendelse HCS automatiserede analyse software. De foranstaltninger, der blev anvendt, var samlede distance og fem adfærd klasser omfatter forskellige elementer af de 20 individuelle adfærd systemet anerkendte. Disse var: 1) Opdræt (omfattende “Rear Up ‘(både delvis og fuld tobenet extension) gensidig aktivitet” Come Down’); 2) Aktiv adfærd (herunder gang, løb, spring og klatring); 3) Abdominal Grooming, og 5) Resting (inaktive perioder). Vi opsummerede forekomsterne af adfærd inden for hver klasse som den relative størrelse af elementer i klassen var tilstrækkelig ensartet. f.eks.