PLoS ONE: Tidlig Growth Hæmning efterfølges af Øget metastatisk sygdom med D-vitamin (Calcitriol) Behandling i TRAMP Model af prostatakræft

Abstrakt

Den aktive metabolit af vitamin D

3, 1,25-dihydroxyvitamin D

3 (calcitriol) har antiproliferative virkninger i ikke-aggressiv prostatakræft, men dens virkninger i mere aggressive modelsystemer er stadig uklart. I disse undersøgelser, effekter af calcitriol og en mindre calcæmisk vitamin D-analog, QW-1624F

2-2 (QW), blev testet

in vivo

, ved hjælp af den aggressive autoktone transgene adenocarcinom af mus prostata ( TRAMP) model. For at undersøge forebyggelse af androgen-stimuleret prostatacancer, køretøj, calcitriol (20 ug /kg), eller QW (50 ug /kg) blev indgivet til 4 uger gamle TRAMP-mus intraperitoneale (ip) 3 × /uge på en MWF tidsplan for 14 uger. Calcitriol og QW nedsat progression af prostatacancer som indikeret ved reduceret urogenitale kanal (p = 0,0022, calcitriol; p = 0,0009, QW) og prostata vægte (p = 0,0178, calcitriol; p = 0,0086, QW). Dog kun calcitriol forøget ekspression af pro-differentiering markering, cadherin 1 (p = 0,0086), og reduceret tumor proliferation (p = 0,0467). Derimod hverken vitamin D analog havde nogen effekt på kastrationsresistent prostatacancer i mus behandlet før eller efter kastration. Interessant, selvom vitamin D udviste inhibitorisk aktivitet mod primære tumorer i hormon-intakte mus, syntes fjernt orgel metastaser skal forøges efter behandling (p = 0,0823). Derfor blev TRAMP mus behandlet langsigtet med calcitriol yderligere at undersøge virkningerne på metastaser. Calcitriol steg signifikant antallet af fjerne orgel metastaser når mus blev behandlet fra 4 uger-of-alder før udviklingen af ​​tydelige tumorer (20-25 uger-of-age) (p = 0,0003). Samlet set data tyder på, at tidlig indgriben med D-vitamin i TRAMP bremset androgen-stimuleret tumor progression, men langvarig behandling resulterede i udviklingen af ​​en resistent og mere aggressiv sygdom forbundet med øget fjernt orgel metastaser

Henvisning:. Ajibade AA, Kirk JS, Karasik E, Gillard B, Moser MT, Johnson CS, et al. (2014) Tidlig Growth Inhibition efterfølges af Øget metastatisk sygdom med D-vitamin (Calcitriol) Behandling i TRAMP Model af prostatakræft. PLoS ONE 9 (2): e89555. doi: 10,1371 /journal.pone.0089555

Redaktør: Karl X. Chai, University of Central Florida, USA

Modtaget: September 6, 2013; Accepteret: 21 januar 2014; Publiceret: 26 feb 2014

Copyright: © 2014 Ajibade et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Roswell Park Cancer Institute og National Cancer Institute (NCI) tilskud # P30 CA016056 ved NIH /NCI tilskud # 5R01 CA95367 (til BAF), og ved Department of Defense (DOD) Pre-ph.d. Fellowship bevilling # W81XWH-05 -1-0571 (AAA). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Prostatakræft (PCA) er en af ​​de førende årsager til kræft og kræft-relaterede dødsfald i amerikanske mænd [1]. Tidligt stadium, orgel-begrænset, kan PCa forvaltes af kirurgi, strålebehandling eller vågent venter, mens mænd med lokalt fremskreden eller metastatisk PCa primært behandles af androgen deprivation terapi [2]. Men mange patienter i sidste ende udvikle kastrationsresistent PCa, hvor de nuværende behandlingsmuligheder er kun palliativ. Forekomsten, lange ventetid, sygelighed og dødelighed i forbindelse med PCa har stor interesse i at udvikle midler til kemoforebyggelse af sygdommen [3].

Epidemiologiske sammenhænge mellem D-vitamin og PCa tyder på, at D-vitamin kan være en vigtig regulator PCA vækst og differentiering [4]. Men undersøgelser forbinder serumniveauer af D-vitamin og PCa forekomst og dødelighed ikke stærkt korreleret (revideret i [5]). I modsætning hertil prækliniske undersøgelser viser, at D-vitamin har potente anticancer effekter i PCA celler

in vitro

, herunder hæmning af celledeling [6] og invasionsevne [7], induktion af cellecyklusstop [8], stimulering af apoptose [9], og fremme af differentiering [10]. Desuden talrige

in vivo

forsøg med mus xenograft systemer viser, at D-vitamin-forbindelser undertrykke tumorvækst og metastase [6], [11], [12]. Derudover brug af gensplejsede musemodeller, der spontant udvikler kræft, viser, at D-vitamin kan forebygge progression af forstadier til kræft PCA læsioner [13], og undertrykke tumorvækst i kastrationsresistent PCa [14].

Kliniske forsøg udført i PCA patienter har været det meste skuffende [15], [16], [17], [18], selv om der har været nogle positive resultater [19], [20], og gevinster er blevet gjort i forståelsen af ​​vitamin D-farmakokinetik og farmakodynamik. En årsag til dårlig klinisk præstation af vitamin D er dens vigtigste dosisbegrænsende toksicitet, hypercalcæmi. Selvom hypercalcæmi let styres, kan det være at forhindre den optimale udnyttelse af calcitriol. Derfor har mindre kalcemiske vitamin D-analoger blevet udviklet med henblik på at bevare de potente anticancer effekter af calcitriol. QW-1624F

2-2 (QW) er en fluorholdig hybrid analog af calcitriol, der er 100 gange mindre calcæmisk, stærkt antiproliferative, og fremkalder lignende downstream effekter til calcitriol [21], [22]. Desuden administration af høje doser af QW (3 ug) hæmme 7,12-dimethylbenz [a] anthracen-initieret og TPA-forfremmet hudkræft hos mus uden hypercalcæmiske bivirkninger [23].

transgene adenocarcinom af muse prostata (TRAMP) model er en aggressiv, autokton model af PCa [24]. Ved 10 uger-of-age, TRAMP mus udvikler lav kvalitet, ikke-invasiv prostatacancer [25]. Som mus fortsat alder, tumoren skrider fra ikke-invasiv for høj kvalitet, invasiv adenokarcinom, og efterfølgende dårligt differentierede neuroendokrine tumorer ved 20-25 ugers-of-age. Den gradvise karakter af modellen giver mulighed for at undersøge virkningerne af kemoforebyggende midler på både tidlige og sene stadier af PCa udvikling, i modsætning til kun den ene eller den anden. Hidtil frontalt sammenligninger af kemoforebyggende virkninger af forskellige D-vitamin forbindelser på androgen-stimuleret og kastrationsresistent PCa progression er endnu ikke gennemført. Da prostatacancer dødelighed hos mænd med fremskreden, senfase cancer, søgte vi at undersøge anti-cancer virkning af vitamin D-forbindelser ved hjælp af mere aggressive TRAMP model. I disse undersøgelser blev TRAMP model, der anvendes til at undersøge, om calcitriol eller QW kan forhindre eller bremse androgen-stimuleret og kastrationsresistent PCa initiering, progression og metastase.

Materialer og metoder

Etik Statement

Eksperimentelle anvendelser af forsøgsdyr blev udført i nøje overensstemmelse med National Institutes of Health guide til Pleje og anvendelse af forsøgsdyr og protokollen blev godkendt af Roswell Park Cancer Institute (RPCI) Animal Care og brug Udvalg (Assurance # A3143-01). RPCI er en AALAC International akkrediteret dyr forskning facilitet. Alle operation blev udført ved hjælp af isofluran for inhalationsanæstesi og blev gjort alt for at minimere dyrenes lidelser.

Dyr

ynglekolonier blev opretholdt på Institut for Laboratorie og Animal Resource (DLAR) core facilitet på Roswell Park Cancer Institute (Buffalo, NY). Homozygote mandlige TRAMP-mus blev avlet med vildtype FVB-hunmus (Taconic, Germantown, NY) for at opnå C57BL /6 × FVB 50:50 mandlige TRAMP-mus. Mus blev genotypebestemt for at bekræfte bakterielinietransmission af transgenet [24]. Alle forsøgsdyr var heterozygote for transgenet, og vedligeholdes på Harlan Teklan Diet S2335, der indeholder 2.980 IE /kg af vitamin D3.

D-vitamin chemoprevention undersøgelser

1α-hydroxymethyl-16-en -24,24-difluor-25-hydroxy-26,27-bis-homovitamin D

3 (QW-1624F

2-2, QW) blev opnået fra Dr. Gary Posner (Johns Hopkins University, Baltimore, MD). Calcitriol og QW lagrene blev opløst i 100% ethanol, og blev frisk resuspenderet i saltvand før hver injektion. Dyrene blev vejet, monitoreret for toksicitet, og palperes at vurdere tumorbelastning på en ugentlig basis. Undersøgelser blev generelt afsluttes 72 timer efter den sidste lægemiddelbehandling blev administreret. På tidspunktet for eutanasi blev de endelige legemsvægt målt, og urogenitale (UG) kanal (blære, sædblære og prostata) blev udskåret og vejet. Den dorsale blev laterale og ventrale prostata lapper mikrodissekeres fra UG-tarmkanalen og vejes for at opnå prostata vægte. Metastatisk forekomst blev bestemt på grundlag af grov undersøgelse af bækken lymfeknuder, lever, nyrer og lunger, og ved immunhistokemisk farvning af væv med SV40 T-antigen-specifikt antistof. Følgende væv blev indsamlet i 9-kammer kassetter til histologi: dorsal, laterale, ventrale og forreste prostata, sædblære, peri-aorta lymfeknuder, nyrer, tarm og lever. Indsamling af væv til histologi blev prioriteret således kun tilovers væv fra store prostatatumorer var lynfrosset i flydende nitrogen og opbevaret ved -80 ° C i Western blot analyse.

For at undersøge virkningen af ​​calcitriol eller QW på progression af androgen-stimuleret PCa blev tre kohorter af 4 uger gamle TRAMP mus behandlet med vehikel (n = 40), calcitriol (n = 41) eller QW (n = 42) ip 3 × /uge mandag, onsdag og fredag ​​(MWF) i 14 uger (figur 1A). Undersøgelsen blev afsluttet, når musene var 18 uger gamle og væv blev høstet som beskrevet ovenfor. Nogle prøver var ude af stand til at blive analyseret, eller ikke evalueret på grundlag af angivne udelukkelseskriterier. En anden undersøgelse blev udført for at undersøge virkningen af ​​

langsigtet

administration af calcitriol på androgen-stimuleret PCa progression. To kohorter af 4 uger gamle TRAMP mus blev behandlet

langsigtet

med køretøj (n = 47) eller calcitriol (n = 49) intraperitonealt 3 × /uge MWF, indtil tydelige tumorer udviklet (figur 1A). Tumorer blev høstet, når der kan påvises ved abdominal palpation.

(A) Skematisk af tidsforløbet af kemoforebyggelse undersøgelser. Alle mus blev kastreret efter 12 uger i hormon ildfaste undersøgelser. (B-C) Fire uger gamle TRAMP mus blev behandlet med vehikel (kontrol), calcitriol (20 ug /kg) eller QW (50 ug /kg) i.p. 3 × /uge i 14 uger. (B) Endelige kropsvægt (g) af kontrol (n = 40), calcitriol (n = 41) og QW (n = 42) mus målt 72 timer efter sidste behandling. (C) Serum calcium (mg /dl) niveauer for kontrol (n = 39), calcitriol (n = 40) og QW (n = 42) -mus målt 72 timer efter sidste behandling. Alle data er repræsenteret som box plots med medianer, og whiskers repræsenterer 5

th og 95

th percentiler. • (prikker), repræsenterer punkter uden for 5

th og 95

percentil. Alle p-værdier blev dannet ved anvendelse af Mann-Whitney-test.

To undersøgelser blev udformet for at vurdere virkningen af ​​calcitriol eller QW om forebyggende kastrationsresistent PCa i kirurgisk kastrerede TRAMP-mus. I

post-kastration

studere, blev behandling iværksat umiddelbart efter kastration af TRAMP mus ved 12 ugers-of-age. Tre kohorter af 12 uger gamle kastrerede mus blev behandlet med vehikel (n = 33), calcitriol (n = 31) eller QW (n = 30) i.p. 3 × /uge MWF i 12 uger (figur 1A). Mus blev aflivet efter 24 uger-of-alder og vævsprøver blev indkøbt som beskrevet ovenfor.

før kastration

studie, 4 uger gamle TRAMP mus blev behandlet med vehikel (n = 29) eller calcitriol (n = 34) intraperitonealt 3 × /week MWF i 8 uger. Ved 12 ugers-of-gamle, blev alle mus kastreret og behandlingen blev fortsat i yderligere 12 uger (figur 1A). Mus blev aflivet på 24 uger-of-alder og vævsprøver blev indkøbt som beskrevet ovenfor.

Histopatologisk analyse

Væv blev høstet, faste, forarbejdede, paraffinindlejrede og vævssnit (5 um ) blev skåret til histologisk analyse. Hematoxylin og eosin (H Tag) er nødvendigt for tumor progression i TRAMP [24], var det vigtigt at afgøre, om terapeutiske midler ændrer transgen ekspression. Svarende til kontrolgruppen (figur 2A, D, G), tag blev udtrykt i de dorsale (figur 2B-C), laterale (figur 2E-F) og ventrale (figur 2H-I) prostata kamre efter behandling med calcitriol eller QW henholdsvis. Western blot-analyse bekræftede yderligere, at vitamin D-forbindelser ikke har ændret på Tag ekspression (figur 2L). Salg

TRAMP-mus blev behandlet med vehikel (kontrol), calcitriol (20 ug /kg) eller QW (50 ug /kg ) ip 3 × /uge i 14 uger. Immunohistokemisk analyse af Tag ekspression i den dorsale (A-C), lateral (D-F), og ventrale (G-I) lapper af 18 uger gamle mus. (J) SV40 Tag farvning af ventrallap af aldersmatchede ikke-transgene mus. (K) nr antistoffarvning negativ kontrol. Mikrofotografier blev taget ved 20 × forstørrelse. (L) Western blot-analyse af Tag-ekspression i ringe differentierede prostata tumorprøver til kontrol, calcitriol- og QW-behandlede mus. Actin blev anvendt som indlæsning kontrol. WT, vildtype og aldersmatchede ikke-transgene prostatavæv. Prøven, der bruges til immunblotting varierer (kontrol = 5, calcitriol = 2, QW = 5), fordi prioritet blev givet til at indsamle væv til histologi. Kun sidesten væv fra store prostata tumorer var tilgængelige for immunblotting.

Effekt af D-vitamin-forbindelser på tumorincidensen og progression

evne calcitriol eller QW at hæmme eller forsinke tumor dannelse i TRAMP blev analyseret efter behandling af androgen-stimuleret og kastrationsresistent PCa (figur 1A). I androgen-stimuleret mus behandlet med køretøj, calcitriol, eller QW, fra 4 uger-of-age indtil 18 uger-of-age, tumorincidensen var tydelig i 35,0% af køretøjets kontrol mus (n = 14/40), 26,8% calcitriol behandlede mus (n = 11/41) og 35,6% af QW behandlede mus (n = 15/42) (figur S1). Selv om der var en 8,2% fald i tumorincidensen med calcitriol behandling, dette fald var ikke signifikant (p = 0,6337, Chi-Square test).

Efter kastration ved 12 ugers-of-age, TRAMP mus udvikler kastration resistente tumorer ved 24 ugers-of-age [25], [26]. At afgøre, om D-vitaminforbindelser kan forsinke eller forhindre PCa tilbagefald, blev tre grupper af kastrationsniveauer TRAMP mus behandlet med bærer, calcitriol (20 ug /kg), eller QW (50 ug /kg) i 12 uger

post-kastration

(figur 1A). Ca. 64% (21/33) af køretøjer kontrol mus udviklede kastrationsresistent tumorer, sammenlignet med 68% (21/31) og 57% (17/30) af mus i calcitriol og QW grupper (figur S1). Men disse ændringer var ikke signifikant, (p = 0,6648, Chi-Square test). Vi undersøgte også, om indgreb med D-vitamin behandling

før kastration

kan ændre kastration gentagelse. To kohorter af 4 uger gamle TRAMP-mus blev behandlet med enten vehikel eller calcitriol (20 ug /kg) begyndende ved 4 ugers-of-alderen. Ved 12 ugers-of-age mus blev kastreret og terapi blev fortsat, indtil mus var 24 uger-of-alder (figur 1A). Ca. 62% (18/29) af vehikelbehandlede mus og 74% (25/34) af calcitriol-behandlede mus udviklede kastrationsresistent sygdom (Figur S1), men ingen signifikant forskel blev observeret (p = 0,4184, Fishers eksakte test). Samlet set indikerer disse resultater, at D-vitamin-forbindelser var ude af stand til at reducere gentagelse af kastrationsresistent PCa i TRAMP.

Effekt af D-vitamin forbindelser på tumor kvalitet og sygdomsbyrde

For yderligere at vurdere effekterne af D-vitamin-forbindelser på androgen-stimuleret PCa progression i mus efter 14 ugers behandling, var prostata sygdom scoret af standard histologisk evaluering (se

Materialer og metoder

). Samlet tumor kvaliteter blev tildelt efter blindede undersøgelse af H E-farvede objektglas. Tidligere rapporter viser, at den ventrallap er mest følsom over for terapeutisk intervention [27], [28], altså den samlede tumor kvaliteter af den ventrale prostata blev sammenlignet mellem behandlingsgrupper (figur 3). Lav kvalitet (LG) læsioner var ikke-invasive og var kendetegnet ved øget epitel stratificering med intakt glandulær arkitektur (figur 3A). Intermediate kvalitet (IG) læsioner var også ikke-invasiv, men vises fremtrædende nucleoli, epitelial tufting, mikropapillær strukturer, cribriform arkitektur, og en intakt glandulær arkitektur (figur 3B). Endelig sene stadier kræft fremtrædende bestod af plader af anaplastisk celler med tab af kirtel arkitektur (figur 3C). Forekomsten af ​​LG læsioner var 40% i vehikelbehandlede, 54% i calcitriol behandlet, og 39% i QW behandlede mus (figur 3D). I modsætning hertil IG læsioner og sene kræft udviklet oftere i kontrolgruppen (60%) og QW (61%) grupper i forhold til calcitriol-behandlede mus (46%) (Figur 3D). Desuden var forekomsten af ​​kræft var 25% i kontrolgruppen, 34% i QW gruppen, og 20% ​​i calcitriol gruppen (figur 3D), men disse ændringer ikke var signifikant (p = 0,4699, Chi-Square test). Intervention også havde ingen effekt på tumor klasse i ryg og laterale kamre af prostata (data ikke vist)

H E-farvning blev udført på vævssnit fra TRAMP mus behandlet med vehikel (kontrol), calcitriol (20 ug /kg) eller QW (50 ug /kg) i.p. 3 × /uge i 14 uger. Prostata væv blev gradueret på grundlag af en histopatologisk karaktersystem drøftet i

Materialer og metoder

sektion. Repræsentative mikrofotografier (20 × forstørrelse) af H E farvning af ventrale lapper skildrer (A) Lav grad (LG) prostata læsion fra calcitriol gruppen, (B) mellemliggende bedømmelse (IG) læsion, og (C) sene kræft i kontrolgruppen. (D) Forekomst (%) af LG læsioner, IG læsioner, og kræft i de ventrale kamre af kontrol (n = 40), calcitriol (n = 41) og QW (n = 41) grupper. En Chi-Square test blev udført for at bestemme, om der var nogen sammenhæng mellem behandling og sygdom scenen.

sygdomsbyrde i TRAMP kan være direkte forbundet med prostata og urinvejene (UG) vægt [25]. Effekten af ​​D-vitamin forbindelser på sygdomsbyrden blev oprindeligt undersøgt i alle prøver, herunder LG, IG, og sen-fase kræftformer. Der blev ikke observeret signifikante forskelle, sandsynligvis som følge af udviklingen af ​​voluminøse tumorer i sene kræftformer. Når voluminøse tumorer har udviklet, kan vægtene fra disse tumorer maskere nogen D effekt vitamin har på LG og IG læsioner. Derfor er alle efterfølgende analyser udføres for androgen-stimuleret PCa blev udført på de ikke-invasive LG og IG prostata læsioner. Calcitriol (p = 0,0022) og QW (p = 0,0009) signifikant nedsat UG vægt, når sammenlignet med bærer i androgen-stimuleret sygdom (figur 4A). Derudover calcitriol (p = 0,0178) og QW (0,0086) både reduceret prostata vægt (figur 4B). Men i kastrationsresistent TRAMP tumorer histologisk sammenlignes med sene kræft, vitamin D-forbindelser ikke statistisk ændre sygdomsbyrde, når de behandles efter kastration (figur 4C) eller pre-kastration (figur 4D). Samlet set resultater antyder, at vitamin D-forbindelser var effektive til at bremse væksten af ​​tidlige stadium androgen-stimuleret PCa, men ineffektive i sent stadium kastrationsresistent TRAMP sygdom.

(A-B) Mus blev behandlet med vehikel (kontrol) , calcitriol (20 ug /kg) eller QW (50 ug /kg) ip 3 × /uge i 14 uger. Kun prøver med den samlede ikke-invasiv lav kvalitet (LG) og mellemliggende bedømmelse (IG) prostata læsioner i dorsale blev laterale og ventrale lapper analyseret, mens alle kræftformer blev udelukket fra analyserne. (A) Urogenital (UG) vægte (mg) af kontrol (n = 30), calcitriol (n = 32) og QW (n = 28) mus. (B) Prostata vægte (mg) af kontrol (n = 29), calcitriol (n = 32) og QW (n = 28) grupper. (C) UG vægte (mg) af 24. uger gamle kastreringsområdet TRAMP mus behandlet med vehikelkontrol (n = 33), calcitriol (n = 30) eller QW (n = 30)

post-kastration

. (D) UG vægt (mg) af 24 uger gamle kastreringsområdet TRAMP mus behandlet med køretøj kontrol (n = 29) eller calcitriol (n = 34)

før kastration

. Alle data er repræsenteret som box plots med medianer, og whiskers repræsenterer 5

th og 95

th percentiler. • (prikker), repræsenterer punkter uden for 5

th og 95

percentil. Alle p-værdier blev dannet ved anvendelse af Mann-Whitney-test.

Calcitriol fremmer differentiering og hæmmer proliferation i androgen-stimuleret TRAMP-mus Salg

Baseret på observationer, der calcitriol inhiberede UG og prostata vægt i ventrallap (figur 4), blev der foretaget yderligere undersøgelser i ikke-invasive LG og IG læsioner. Tab af cadherin 1 (CDH1) ekspression er forbundet med PCa progression og nedsat differentiering i TRAMP [25], [29]. CDH1 ekspression overvejende placeret til plasmamembranen. Men når cancerceller mister differentieringsstatusen, regulering af CDH1 kan forstyrres resulterer i cytosoliske og ekspressionsmønstre nukleare [30]. Endvidere stigninger i ekspressionen af ​​CDH1 korrelerer med induktion af differentiering induceret af vitamin D-analoger i PCA-cellelinier [31]. Derfor ekspression af CDH1 blev vurderet for at bestemme virkningen af ​​calcitriol på differentiering. I modsætning til kontrolmus (figur 5A-B), blev CDH1 udtrykkes kraftigt i de ventrale lapper af calcitriol behandlede mus (figur 5C-D). Mens nogle cytoplasmatisk farvning af CDH1 blev observeret i begge behandlingsgrupper, at størstedelen af ​​CDH1 farvning forblev membranbundne. Efterfølgende kvantificering bekræftede, at calcitriol markant stigning i antallet af CDH1 positive kirtler i forhold til køretøjet (figur 5G) (p = 0,0086). Udover CDH1 blev androgen receptor (AR) udtryk også undersøgt i ventrale prostata af køretøjer og calcitriol behandlede mus (figur 5E og 5F). Selvom der ikke blev observeret nogen forskel i AR-ekspression, er det vigtigt at bemærke, at AR-ekspression blev opretholdt. Endelig er der en stokastisk fremkomsten af ​​neuroendokrine kræftformer i TRAMP model, der er præget af forøget ekspression af synaptophysin under tumorudvikling [25]. Undersøgelse af synaptophysin ekspression viste, at calcitriol og QW behandling ikke ændrede forekomst af neuroendokrine fænotype (data ikke vist).

Immunhistokemi blev udført med anti-CDH1, anti-AR og anti-MKI67 antistoffer på vævssnit fra kontrol, calcitriol og QW behandlingsgrupper. (A-D, G) CDH1 udtryk i ikke-invasiv lav kvalitet (LG) og mellemliggende bedømmelse (IG) ventrale prostata væv. Repræsentative mikrofotografier af CDH1 farvning i kontrol (A-B) og calcitriol (C-D) grupper. Indsat i (A) betegner positiv CDH1 farvning af normale colon-epitelceller. Der blev taget mikrofotografier ved 40 ganges forstørrelse (A, C) og boxed områder repræsenterer 100 ganges forstørrelse (B, D). Repræsentative mikrofotografier (40 × forstørrelse) af AR udtryk i ikke-invasive prostata læsioner fra ventrale kamre af (E) kontrol og (F) calcitriol gruppe. (G) CDH1 score på ikke-invasive ventrallap læsioner fra kontrol (n = 25) og calcitriol (n = 27) grupper blev beregnet ved at kvantificere antallet af E-cadherin positive kirtler som beskrevet i

Materialer og metoder

sektion. (H) Proliferativ indeks LG og IG ventrallap læsioner af kontrol (n = 30), calcitriol (n = 33) og QW (n = 27) grupper blev bestemt ved at kvantificere MKI67 farvning som beskrevet i

Materialer og metoder

afsnit. Kun LG og IG prostata læsioner blev analyseret, mens sene kræftformer blev udelukket for både CDH1 scoring og MKI67 farvning. Alle data er repræsenteret som box plots med medianer, og whiskers repræsenterer 5

th og 95

th percentiler. • (prikker), repræsenterer punkter uden for 5

th og 95

percentil. Alle p-værdier blev genereret ved anvendelse af Mann-Whitney test.

Ud over at undersøge differentiering status LG og IG ventrale lapper blev immunhistokemisk farvning udført med en MKI67 antistof at undersøge effekten af ​​calcitriol og QW på proliferation af ventrallap. Sammenlignet med bærer, calcitriol signifikant nedsat proliferation i ventrallap (p = 0,0467), mens QW var ineffektivt (p = 0,2667) (figur 5H). Analyse af apoptose påvist, at den samlede ekspression af pro-apoptotisk caspase 3 var meget lav (data ikke vist).